咪達唑侖調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB通路對乳腺癌細胞的影響

蔣琦雯，徐楊，姚軍，葉棋，任帥帥

1.金華文榮醫(yī)院麻醉科，浙江金華 321001；2.上海市第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233；3.金華市人民醫(yī)院麻醉科，浙江金華 321302

乳腺癌是一種惡性腫瘤，女性患者占比高達99%，發(fā)病率在女性癌癥中位居第一[1]。乳腺癌早期可采用保乳手術(shù)切除病理組織，但癌細胞增殖快、極易遷移，多發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移造成全身系統(tǒng)疾病，必須采用放、化療結(jié)合方式提高患者的生存率，但放、化療副作用大且易復(fù)發(fā)，極大降低患者的生活質(zhì)量[2]。因此，探索抑制乳腺癌細胞增殖的靶向制劑是臨床上改善患者預(yù)后的有效途徑。

咪達唑侖具有典型的苯二氮?類藥理活性，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗肌肉松弛等作用，多用于治療失眠和術(shù)前誘導(dǎo)睡眠[3]。已有研究表明，咪達唑侖可抑制三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞的增殖、遷移、侵襲和間充質(zhì)蛋白水平，具有作為治療乳腺癌候選藥物的潛力[4]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路可促進腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。本研究旨在探討咪達唑侖對乳腺癌的影響及對cAMP/PKA/CREB通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 馬來酸咪達唑侖注射液（批準文號：國藥準字H20031037，生產(chǎn)單位：江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：1ml∶5mg）；Sp-cAMPS購自美國MCE公司；胎牛血清購自美國ThermoFisher公司；青霉素鏈霉素溶液（碧云天生物科技有限公司；規(guī)格：100ml/瓶）、DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS）、RIPA裂解液、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗和結(jié)晶紫溶液購自碧云天生物科技有限公司；cAMP酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自北京正四柏生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT]細胞生長測定試劑盒購自美國Merck公司；Transwell小室購自北京萌壯科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技上海有限公司；一抗磷酸化（p-）PKA、PKA、p-CREB、CREB和GAPDH購自美國Abcam公司。CO2培養(yǎng)箱購自德國Memmert公司；細胞板、移液槍、超凈工作臺、酶標儀，購自美國Thermo Fisher公司；熒光顯微鏡購自日本Keyence公司；流式細胞儀購自美國Thermo Fisher公司；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司；Tanon 1600全自動凝膠成像分析儀購自天能集團。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組與處理 復(fù)蘇MDA-MD-231細胞后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中，加入100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，置于CO2培養(yǎng)箱（5% CO2，37℃）中無菌培養(yǎng)。將細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，1.0×105個/孔，隨機分為5組：對照組、咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組和咪達唑侖H+Sp-cAMPS組，每組設(shè)置6個重復(fù)孔。咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組每孔分別加入5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L咪達唑侖，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組每孔中加入20μmol/L咪達唑侖+10μmol/L Sp-cAMPS[4-6]。

1.2.2 MTT法檢測MDA-MD-231細胞的增殖能力將1.2.1項的各組細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，1.0×105個/孔，每孔加入10%體積的MTT溶液，37℃孵育4h，棄去上清，加入與初始體積等量的Formazan Solvent溶液，MTT甲臜結(jié)晶物完全溶解后，使用酶標儀檢測450nm處各孔細胞的光密度（optical density，OD），細胞增殖能力與OD值成正比。

1.2.3 細胞劃痕試驗檢測MDA-MD-231細胞的遷移能力 將1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞接種至6孔板，1.0×106個/孔，用移液器槍頭垂直畫一條線并標記不同分區(qū)，在0h和48h拍照，計算愈合效率即細胞遷移能力。愈合效率=（0h時細胞劃痕面積－48h時細胞劃痕面積）/0h時細胞劃痕面積。

1.2.4 Transwell實驗檢測MDA-MD-231細胞的侵襲能力 將1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞稀釋10倍，接種于Transwell小室，3×103個/室，置于37℃培養(yǎng)箱孵育60min。每個小室加入200μl基本培養(yǎng)基和700μl完全培養(yǎng)基，孵育過夜，再加入4% PFA和0.1%結(jié)晶紫溶液，熒光顯微鏡下拍照并計算細胞侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 在1.2.1項的各組細胞中加入0.25%胰蛋白酶，配制濃度為1×109個/L的細胞懸液，加入100μl細胞懸液至Falcon試管中，再加入5μl Annexin V-FTTC和5μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光孵育15min，最后加入結(jié)合緩沖液靜置1h，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。統(tǒng)計Q2區(qū)細胞占比作為MDA-MD-231細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA檢測細胞cAMP的表達 在1.2.1項的各組細胞中加入PBS混懸液，按ELISA試劑盒說明書配制待測標準品和樣品溶液，讀取酶標儀450nm波長處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中的cAMP濃度。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達 收集1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞，提取細胞總蛋白并定量總蛋白濃度，隨后采用蛋白免疫印跡（Western blot）法驗證蛋白的表達。配制SDS-PAGE凝膠，上樣10μg，電泳參數(shù)設(shè)為80V通電30min后轉(zhuǎn)為120V通電1h。取下凝膠，200V電壓下將已分離的條帶轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（poly-vinylidene fluoride，PVDF）膜。封閉后的PVDF膜分別置于p-PKA、PKA、p-CREB、CREB（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）過夜，再經(jīng)二抗（1∶500）和ECL超敏化學(xué)發(fā)光液孵育，使用Tanon 1600軟件拍照并分析蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖情況的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的增殖能力顯著降低（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的增殖能力顯著提高（P<0.05），見表1。

表1 各組細胞OD450值比較（±s，n=6）

表1 各組細胞OD450值比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 OD450值對照組 1.62±0.13咪達唑侖L組 1.35±0.14*咪達唑侖M組 1.09±0.12*咪達唑侖H組 0.83±0.07*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 1.40±0.13#F 38.282 P <0.001

2.2 各組細胞遷移能力的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的遷移能力顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組相比，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的遷移能力顯著提高（P<0.05），見圖1和表2。

圖1 細胞劃痕試驗檢測MDA-MD-231細胞的遷移能力

表2 各組MDA-MD-231細胞的遷移能力比較（±s，n=6）

表2 各組MDA-MD-231細胞的遷移能力比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞遷移率（%）對照組 96.11±10.43咪達唑侖L組 82.26±8.18*咪達唑侖M組 73.75±7.14*咪達唑侖H組 61.54±7.79*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 90.24±12.26#F 12.789 P <0.001

2.3 各組細胞侵襲能力的比較

Transwell實驗結(jié)果表明，與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的侵襲能力顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的侵襲能力顯著提高（P<0.05），見圖2和表3。

圖2 Transwell實驗檢測各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力（×100）

表3 各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力比較（±s，n=6）

表3 各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞侵襲率（%）對照組 91.16±9.38咪達唑侖L組 78.25±7.23*咪達唑侖M組 74.67±8.64*咪達唑侖H組 62.74±9.53*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 88.43±8.67#F 10.248 P <0.001

2.4 各組細胞凋亡率的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞凋亡率顯著提高（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見圖3和表4。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

表4 各組MDA-MD-231細胞凋亡率比較（±s，n=6）

表4 各組MDA-MD-231細胞凋亡率比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞凋亡率（%）對照組 2.76±0.34咪達唑侖L組 4.12±0.36*咪達唑侖M組 6.87±0.84*咪達唑侖H組 12.71±1.58*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 3.11±0.26#F 145.374 P <0.001

2.5 各組細胞cAMP表達水平的比較

咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的cAMP表達水平均顯著低于對照組（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的cAMP表達水平顯著升高（P<0.05），見表5。

表5 各組細胞cAMP表達水平的比較（±s，n=6）

表5 各組細胞cAMP表達水平的比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 濃度（pmol/ml）對照組 8.52±1.01咪達唑侖L組 6.45±0.74*咪達唑侖M組 4.81±0.54*咪達唑侖H組 2.77±0.36*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 7.51±0.88#F 56.132 P <0.001

2.6 各組細胞蛋白表達水平的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖4和表6。

圖4 Western blot檢測細胞中p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白的表達

表6 細胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平的比較（±s，n=6）

表6 細胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平的比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 p-PKA/PKA p-CREB/CREB對照組 0.84±0.11 0.98±0.08咪達唑侖L組 0.70±0.09* 0.83±0.07*咪達唑侖M組 0.58±0.07* 0.69±0.07*咪達唑侖H組 0.33±0.04* 0.37±0.03*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 0.79±0.10# 0.88±0.09#F 33.817 66.726 P <0.001 <0.001

3 討論

乳腺癌起源于乳腺上皮組織，臨床表現(xiàn)為乳房腫塊、泌乳障礙、局部擴散可侵及周圍淋巴管，全身轉(zhuǎn)移可累及臟器和骨組織，甚至導(dǎo)致死亡[7]。三陰性乳腺癌是乳腺癌中比較常見的一種病理亞型，具有較高的發(fā)病率[8]。目前，臨床上還沒有靶向治療乳腺癌、有效防治復(fù)發(fā)的方法，因此尋找療效好、安全性高的新型藥物，提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量勢在必行。

咪達唑侖不僅可作為鎮(zhèn)定劑用于外科手術(shù)，還可抑制多種腫瘤的進展。咪達唑侖能通過上調(diào)miR-217抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移并促進凋亡[9]；還能抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細胞增殖，抑制腫瘤相關(guān)嗜中性粒細胞、巨噬細胞和多形核骨髓來源細胞的局部浸潤，進而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌進展[10]；也能抑制非小細胞肺癌細胞增殖和活力[11]。本研究發(fā)現(xiàn)5μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L咪達唑侖處理后的三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞數(shù)量減少、生長狀態(tài)變差，顯示出凋亡跡象；通過MTT法、細胞劃痕試驗和Transwel實驗檢測發(fā)現(xiàn)，咪達唑侖劑量依賴性降低MDA-MD-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且細胞凋亡率升高，說明咪達唑侖可有效抑制MDA-MD-231細胞的活力。

cAMP廣泛存在于細胞中，多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)及其他信號分子將其用作細胞內(nèi)第二信使，因此，cAMP可直接調(diào)控細胞的各種生物學(xué)行為，包括細胞代謝、生長、分化、凋亡和基因表達等[12]。PKA是一種四聚體酶，可使底物磷酸化促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。CREB是PKA的底物之一，cAMP可通過調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控PKA及其下游因子CREB，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。本研究中，咪達唑侖處理后的MDA-MD-231細胞cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平下降，說明咪達唑侖可抑制cAMP/PKA/CREB信號通路。咪達唑侖對MDA-MD-231細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制可能通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路激活實現(xiàn)。為驗證咪達唑侖對MDA-MD-231細胞活力的抑制確實與抑制cAMP/PKA/CREB信號通路有關(guān)，本研究增設(shè)咪達唑侖H+Sp-cAMPS組。Sp-cAMPS是一種依賴cAMP的PKA有效激活劑[16]。相較于咪達唑侖H組，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組MDA-MD-231細胞生長狀態(tài)好轉(zhuǎn)，增殖、遷移和侵襲能力顯著增加，細胞凋亡率降低，cAMP/PKA/CREB信號蛋白表達上調(diào)，表明經(jīng)Sp-cAMPS處理增加MDA-MD-231細胞活力及cAMP/PKA/CREB信號，也印證咪達唑侖抑制MDA-MD-231細胞的增殖、遷移和侵襲與其抑制cAMP/PKA/CREB信號激活有關(guān)。

綜上所述，咪達唑侖可通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路的激活抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而，cAMP/PKA/CREB信號通路與腫瘤之間的作用復(fù)雜，需要考慮具體的腫瘤類型和背景，有研究報道，在肝癌中降低cAMP的濃度和CREB的磷酸化程度，導(dǎo)致癌細胞凋亡[17]。因此，關(guān)于cAMP/PKA/CREB在乳腺癌和其他類型腫瘤中的調(diào)控機制還需深入探究。