基于生物信息學分析CD59在胰腺癌中的表達及預后影響

劉佳偉，劉春玲，仵紅嬌，宋琴琴，劉沖，董靜，呂瀾，張雪梅，張志

1.華北理工大學臨床醫(yī)學院，河北唐山 063210；2.唐山市工人醫(yī)院腫瘤科，河北唐山 063000；3.唐山市人民醫(yī)院病理科，河北唐山 063001；4.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山 063210

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期診斷困難、轉移迅速及缺乏有效治療手段使其成為全球癌癥死亡的第七大主要原因[1]。在我國，胰腺癌負擔逐年增加，年死亡率幾乎與發(fā)病率相當[2]。

補體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，保護宿主細胞免受病原微生物和受損細胞的侵害[3]。CD59是糖基磷脂酰肌醇錨定的補體調節(jié)蛋白，通過抑制攻膜復合物的形成調節(jié)補體活化，保護宿主細胞免受補體攻擊[4]。既往研究表明，CD59在多種實體瘤中高表達，并幫助腫瘤細胞逃避補體的監(jiān)視[5]。目前CD59在胰腺癌中研究較少，作用機制尚不明確。本研究通過生物信息學分析CD59在胰腺癌中的表達及其對胰腺癌患者預后的影響，為CD59作為胰腺癌的臨床診斷指標和預后評估的生物標志物提供線索和理論依據。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據來源

1.1.1 GEPIA2數(shù)據庫 基因表達譜交互分析2（gene expression profiling interactive analysis 2，GEPIA2）數(shù)據庫用于探究CD59在胰腺癌及癌旁組織的mRNA表達差異及對胰腺癌不同病理分期的影響。篩選條件設置：|Log2FC| Cutoff: 1和q-value Cutoff: 0.01。

1.1.2 HPA數(shù)據庫 人類蛋白組圖譜數(shù)據庫（human protein atlas，HPA）用于探究CD59在胰腺癌及正常胰腺組織中的蛋白表達差異。利用“Tissue”模塊獲取CD59在正常胰腺組織中的表達情況，利用“Pathology”模塊獲取其在胰腺癌組織中的表達情況。

1.1.3 TIMER2.0數(shù)據庫 利用TIMER 2.0數(shù)據庫“Immune Association”下的“Gene”模塊分析CD59表達水平與免疫細胞浸潤水平的關系。

1.1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫 卡普蘭邁爾（Kaplan-Meier plotter）數(shù)據庫用于分析CD59表達水平對胰腺癌患者總生存期（overall survival，OS）和無復發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）的影響。

1.1.5 蛋白-蛋白互作網絡 String數(shù)據庫旨在整合蛋白質之間所有已知和預測的關聯(lián)，包括物理相互作用和功能關聯(lián)。將篩選條件設為“full STRING network”，將所需分數(shù)設為“medium confidence(0.400)”，將“size cutoff”設為“no more than 50 interactors”，得到CD59的蛋白互作網絡（protein-protein interaction network，PPI），利用Cytoscape3.9.1的“Analyze Network”篩選重要節(jié)點。

1.1.6 GO富集分析和KEGG通路分析 DAVID6.8是為基因提供全面功能注釋的工具，用以了解大量基因背后的生物學含義。本研究將CD59及50個相關互作分子輸入DAVID6.8數(shù)據庫進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行處理分析，CD59基因表達的差異比較采用t檢驗；CD59表達對胰腺癌患者生存影響的比較采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗方法；采用Pearson相關性檢驗篩選與CD59具有相關性的基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD59在胰腺癌中高表達

GEPIA2數(shù)據庫顯示，與癌旁正常組織相比，CD59在彌漫大B淋巴瘤、膠質瘤、胰腺癌、皮膚黑色素瘤和胸腺癌中的表達顯著上調（P<0.05），見圖1A。179例胰腺癌樣本中CD59的mRNA表達水平顯著高于171例正常胰腺樣本（P<0.05），見圖1B。免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CD59的蛋白表達水平明顯高于正常胰腺組織，CD59在胰腺癌組織的細胞質或細胞膜中高表達，見圖1C。CD59表達量對胰腺癌患者的疾病分期無影響（P＞0.05），見圖2。

圖2 CD59在不同分期胰腺癌中的表達水平

2.2 CD59表達水平與免疫細胞浸潤的關系

腫瘤淋巴細胞浸潤的數(shù)量和活性影響癌癥患者的預后[6]。TIMER2.0數(shù)據庫顯示，CD59表達與純度無關（P>0.05），與CD8+T細胞（partial.Cor=0.358，P<0.001）、CD4+T細胞（partial.Cor=0.061，P=0.431）、中性粒細胞（partial.Cor=0.307，P<0.001）及樹突狀細胞（partial.Cor=0.283，P<0.001）浸潤呈正相關，見圖3。

圖3 CD59與胰腺癌免疫細胞浸潤的關系

2.3 CD59表達與胰腺癌患者預后的關系

Kaplan-Meier plotter數(shù)據庫分析顯示，CD59高表達患者的OS和RFS均短于低表達患者（HR=2.30，95%CI：1.52～3.50，P<0.001；HR=4.31，95%CI：1.57～11.83，P<0.001），見圖4。

圖4 CD59表達與患者預后的關系分析

2.4 構建CD59共表達網絡及功能富集分析

利用String數(shù)據庫得到50個CD59相關蛋白，采用Cytoscape3.9.1進一步分析發(fā)現(xiàn)與CD59關系最為密切的蛋白是CD55、順式高爾基質蛋白（cis-Golgi matrix protein，GOLGA2）、甘露糖結合凝集素1（mannose-binding lectin，LMAN1）、跨膜Emp24結構域運輸?shù)鞍?（transmembrane p24 trafficking protein 2，TMED2）和Serpin肽酶抑制劑進化枝A成員1（serpin family A member 1，SERPINA1）。利用DAVIA6.8在線數(shù)據庫對CD59及其相互作用蛋白進行GO和KEGG富集分析，結果顯示，CD59及其共表達基因主要參與補體激活（經典途徑）、先天免疫反應等生物途徑，見表1。KEGG通路富集分析結果顯示，CD59及其共表達基因主要富集于補體和凝血級聯(lián)通路、冠狀病毒-COVID-19通路等，見表2。

表1 GO通路富集分析

表2 KEGG通路富集分析

3 討論

胰腺癌早期癥狀隱匿，80%～85%的患者確診時已處于晚期，傳統(tǒng)的化療效果差，5年生存率約2%～9%[7]。目前，臨床上尚缺乏針對胰腺癌敏感的早期診斷指標和有效的治療靶點。因此，尋找胰腺癌的新治療靶點和預后標志物對臨床治療意義重大。

CD59是膜結合補體調節(jié)蛋白（membrane complement regulatory proteins，mCRPs）家族成員，主要參與調控補體系統(tǒng)的激活[4]。有研究表明，CD59促進乳腺癌腫瘤生長并預測不良預后[5]。CD59在結腸癌中高表達且與結腸癌的分化和TNM分期具有臨床相關性[8-9]。此外，CD59對卵巢癌和前列腺癌細胞也發(fā)揮同樣的保護作用[10-11]。本研究通過生物信息學分析探究CD59基因在胰腺癌中的表達水平及預后意義，發(fā)現(xiàn)CD59在胰腺癌組織中高表達，而與疾病分期無關，這表明CD59可能誘導胰腺癌的發(fā)生。TIMER2.0數(shù)據庫表明，CD59表達水平與多種腫瘤相關免疫細胞的浸潤呈正相關，Kaplan-Meier plotter數(shù)據庫分析顯示，CD59高表達的胰腺癌患者預后更差，這表明CD59在胰腺癌中可能通過調節(jié)免疫細胞浸潤來保護胰腺癌細胞免受補體介導的細胞裂解，導致胰腺癌患者的預后更差[12]。這一發(fā)現(xiàn)有望為胰腺癌的免疫治療提供新的策略。

String數(shù)據庫及Cytoscape3.9.1分析顯示，CD59與CD55、GOLGA2、LMAN1、TMED2、SERPINA1等分子存在相互作用。CD55與CD59同屬mCRPs家族，通過調控補體活化促進腫瘤發(fā)生[13]。GOLGA2在蛋白質的糖基化和轉運中起重要作用，下調可抑制腫瘤的發(fā)生[14]。LMAN1介導內質網到高爾基體糖基化蛋白的轉運，在膠質瘤中發(fā)揮促癌作用[15]。TMED2負責轉運高爾基體和內質網之間的蛋白質，其表達增加可作為乳腺癌和頭頸部鱗癌患者預后不良的指標[16-17]。SERPINA1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是評估結直腸癌患者預后的準確生物標志物[18]。其中CD55作為聯(lián)系最緊密的節(jié)點，已被證實與胰腺癌相關[19]。

通過對CD59的共表達基因進行功能分析，對其發(fā)揮作用的機制進行初步探究。CD59作為補體調節(jié)劑，在腫瘤中過度表達，有助于腫瘤細胞發(fā)生無限增殖、抵抗凋亡，發(fā)生免疫逃逸[20]。GO和KEGG富集分析顯示，CD59的共表達基因主要參與補體激活調控等生物途徑，這與既往的認識一致。

綜上所述，CD59在胰腺癌組織中呈高表達，且高表達組胰腺癌患者對應的預后更差。此外，CD59表達與多種免疫細胞浸潤水平呈正相關。因此，CD59可作為胰腺癌患者預后評估的新指標，本研究為胰腺癌的早期診斷、靶向治療和更深入的機制探索提供初步的理論依據。