腺苷A2a受體在系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)間質(zhì)性肺病中的作用及機(jī)制研究

戴才俊，董一枝，嚴(yán)丹，涂軍偉

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院 金華市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江金華 321000

系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）又稱硬皮病，是一種病因尚未完全明確、診治困難的自身免疫性疾病。該病具有彌漫皮膚或局部器官纖維化、血管病變及免疫學(xué)異常三大特征[1-2]；局部內(nèi)臟器官病變以系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)間質(zhì)性肺?。╯ystemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD）最常見，通常表現(xiàn)為肺部間質(zhì)性炎癥或纖維化，至今尚缺乏對(duì)SSc-ILD的有效治療措施，使其成為硬皮病患者的主要死亡原因之一[3-4]。目前治療SSc-ILD的主要藥物有激素和環(huán)磷酰胺等，但效果均欠佳，且有繼發(fā)感染、骨髓抑制等嚴(yán)重并發(fā)癥[5]。因此探明SSc-ILD的發(fā)病機(jī)制，尋求療效好且副作用小的藥物治療SSc-ILD是一項(xiàng)重要的研究課題。

近年來研究發(fā)現(xiàn)腺苷A2a受體（A2a receptor，A2aR）參與炎癥、缺氧、氧化應(yīng)激損傷等過程[6-8]。在肺缺血再灌注模型中，A2aR激活減少白細(xì)胞黏附的同時(shí)可抑制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肺組織滲出[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與SSc-ILD的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。目前A2aR對(duì)SSc-ILD的作用及機(jī)制研究較少，本研究擬建立次氯酸誘導(dǎo)的小鼠SSc-ILD模型，探討A2aR激活是否通過降低氧化應(yīng)激水平減輕SSc-ILD的炎癥及纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本

選取24只健康雌性Balb/c小鼠[購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004]，均為6周齡，體質(zhì)量18～22g。飼養(yǎng)條件：無特定病原體環(huán)境，室溫20～24℃，給予充足水和飼料。將小鼠隨機(jī)分為三組（n=8）：正常對(duì)照組（wild normal control group，WN組）、造模組（wild model group，WM組）、造模+A2aR激動(dòng)劑（CGS21680）組（WM with CGS21680 group，WMC組）。WN組小鼠背部注射300μl無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），WM組和WMC組小鼠背部注射300μl次氯酸溶液，1次/d，連續(xù)造模6周。造模后予腹腔注射給藥，WN組和WM組小鼠腹腔注射0.5ml無菌PBS溶液，WMC組小鼠腹腔注射0.5ml無菌CGS21680溶液,連續(xù)注射6周。各組小鼠結(jié)束注射2周后，頸椎脫臼法處死小鼠，心臟取血并分離血清，檢測血清晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced protein oxidation products，AOPP）。取小鼠肺組織分成兩部分：一部分立即用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和馬松染色；另一部分立即置于液氮中，低溫（-80℃）保存?zhèn)溆?，測定羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、AOPP、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量。本研究經(jīng)金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：AL-JSYJ202209）。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸二氫鉀粉末、次氯酸鈉溶液、CGS21680購自美國Sigma公司；終濃度為0.01mol/L的PBS溶液備用；次氯酸配置：166μl次氯酸鈉溶液（含2.6%的活性氯）加入11.1ml磷酸二氫鉀溶液（100mmol/L）中，混合后備用；CGS21680配置：100μg CGS21680溶于10ml PBS溶液中，配置成終濃度10μg/ml備用。HYP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。AOPP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、GSH ELISA試劑盒購自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司。LEICA DM 1000光學(xué)顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色和馬松染色 常規(guī)制作肺組織切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變；進(jìn)一步行馬松染色，膠原纖維呈亮綠色，肌纖維呈紅色，以亮綠色（膠原纖維）為陽性，反映膠原含量，觀察纖維化情況。HE染色切片和馬松染色切片采用LEICA DM 1000光學(xué)顯微鏡采圖。

1.3.2 HYP含量測定 根據(jù)ELISA試劑盒操作步驟測定各組小鼠肺組織HYP的含量，間接反映膠原纖維含量。

1.3.3 血清及肺組織AOPP及GSH測定 根據(jù)ELISA試劑盒操作步驟測定各組小鼠的血清及肺組織AOPP及GSH含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果符合正態(tài)分布。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HE染色肺部病理學(xué)變化及馬松染色肺部膠原含量變化的比較

與WN組小鼠比較，WM組小鼠肺部呈現(xiàn)肺泡間隔增厚，伴炎癥細(xì)胞滲出，部分肺泡萎縮粘連，血管周圍膠原沉積增多。WMC組小鼠肺部上述變化較WM組小鼠減輕，見圖1、圖2。

圖1 肺部病理學(xué)變化（HE染色，×100）

圖2 肺部膠原含量的變化（馬松染色，×100）

2.2 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化

WM組小鼠肺組織中HYP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中HYP含量較WM組小鼠降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化（±s，μg/mg，n=8）

表1 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化（±s，μg/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 肺組織中HYP含量 統(tǒng)計(jì)值 P WN組 0.43±0.09*WM組 0.58±0.05 12.13 <0.001 WMC組 0.50±0.04*

2.3 各組小鼠的血清AOPP含量比較

WM組小鼠的血清AOPP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；WMC組小鼠的血清AOPP含量較WM組小鼠降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 各組小鼠的血清AOPP含量比較（±s，nmol/ml，n=8）

表2 各組小鼠的血清AOPP含量比較（±s，nmol/ml，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 血清AOPP含量 統(tǒng)計(jì)值 P WN組 11.08±1.55*WM組 14.77±1.30 14.04 <0.001 WMC組 12.23±1.42*

2.4 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較

WM組小鼠肺組織中AOPP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中AOPP含量較WM組小鼠降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3。

表3 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較（±s，nmol/mg，n=8）

表3 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較（±s，nmol/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 肺組織AOPP含量 統(tǒng)計(jì)值 P WN組 0.36±0.08*WM組 0.56±0.05 15.62 <0.001 WMC組 0.45±0.08*

2.5 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較

WM組小鼠肺組織中GSH含量較WN組小鼠明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中GSH含量較WM組小鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較（±s，μg/mg，n=8）

表4 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較（±s，μg/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01，#P<0.05

組別 肺組織GSH含量 統(tǒng)計(jì)值 P WN組 2.50±0.44*WM組 1.89±0.23 8.45 0.002 WMC組 2.14±0.12#

3 討論

硬皮病是一種至今病因尚未完全明確的全身性結(jié)締組織病，以自身免疫異常、各組織器官膠原過度沉積和微血管損傷為特征[12-13]。SSc-ILD是硬皮病最常見內(nèi)臟器官病變之一，通常表現(xiàn)為肺部的炎癥浸潤或纖維化形成，也是硬皮病患者最常見的死亡原因之一[14]。目前尚缺乏對(duì)SSc-ILD的有效治療。

越來越多的科學(xué)研究運(yùn)用次氯酸誘導(dǎo)的硬皮病模型進(jìn)行相關(guān)疾病發(fā)生及藥物作用機(jī)制的研究[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與SSc-ILD的發(fā)生、發(fā)展，系統(tǒng)性氧化應(yīng)激水平的變化通過循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)致肺部氧化應(yīng)激水平隨之變化，進(jìn)而導(dǎo)致肺組織中激活的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，促使成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致a-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加，Ⅰ型膠原蛋白合成增加，細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，最終導(dǎo)致SSc-ILD的發(fā)生發(fā)展[10,17-19]。AOPP作為一個(gè)循環(huán)因子，參與硬皮病模型中氧化應(yīng)激從皮膚傳播到肺的過程[18]。AOPP屬于大分子尿毒癥毒素，于1996年在慢性腎衰竭患者的血漿中首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是血清白蛋白等被ROS氧化后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[20]。作為氧化應(yīng)激的代謝產(chǎn)物，AOPP被認(rèn)為是反映氧化應(yīng)激損傷的敏感指標(biāo)，也發(fā)揮著炎癥介質(zhì)的作用，可引起炎癥細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的ROS，從而加重氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[21-22]。慢性腎臟病的研究發(fā)現(xiàn)血清AOPP的升高可誘導(dǎo)腎臟AOPP的增加及轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)增加，最終促成腎臟纖維化[23]。使用硬皮病患者的血清孵育成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AOPP可誘導(dǎo)其產(chǎn)生過氧化氫和一氧化氮，提示AOPP誘導(dǎo)產(chǎn)生不同類型的ROS參與SSc-ILD的發(fā)生、發(fā)展[24]。本研究模型中發(fā)現(xiàn)造模組小鼠肺組織呈現(xiàn)炎癥及纖維化，HYP含量升高，間接提示膠原纖維含量增加；此外造模組小鼠的血清及肺組織中AOPP含量均升高，而代表抗氧化能力的GSH含量降低，提示氧化還原失衡參與SSc-ILD的發(fā)生、發(fā)展。

腺苷是機(jī)體內(nèi)的一種內(nèi)源性嘌呤核苷，在人體各系統(tǒng)廣泛分布，通過其特異性細(xì)胞表面受體發(fā)揮不同生物學(xué)效應(yīng)[25]。A2aR屬于腺苷受體之一，被證實(shí)與氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切[9]。在多種疾病模型中發(fā)現(xiàn)A2aR可降低相應(yīng)器官或細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，也可提高相應(yīng)細(xì)胞的抗氧化能力，產(chǎn)生抗氧化損傷作用[26-27]。A2aR的抗炎、抗纖維化作用也在多種疾病模型中得到證實(shí)，A2aR的激活抑制炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥細(xì)胞因子的釋放，最終延緩從炎癥到纖維化的進(jìn)展[28-30]。在亨廷頓舞蹈病中，A2aR的激活可降低神經(jīng)元的DNA損傷和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[31]；且在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，A2aR的激活可降低氧化損傷水平，從而在慢性炎癥過程中產(chǎn)生抗炎和緩解組織損傷的保護(hù)作用[32]。本研究發(fā)現(xiàn)A2aR激動(dòng)劑組小鼠的肺組織炎癥及纖維化程度較造模組減輕，代表氧化應(yīng)激水平的血清及肺組織AOPP含量減少，而代表抗氧化能力的GSH含量升高。提示A2aR的激動(dòng)可通過減輕硬皮病系統(tǒng)性氧化應(yīng)激水平間接減少肺部ROS的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)肺部氧化還原的平衡，減輕肺部的氧化應(yīng)激水平，最終延緩SSc-ILD的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，A2aR的激活可通過抗氧化作用，有效減輕SSc-ILD的炎癥和纖維化程度，延緩其發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果可能為今后開發(fā)A2aR相關(guān)藥物治療SSc-ILD提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。