miR-29a影響eNOS蛋白表達(dá)參與血管內(nèi)皮障礙機(jī)制研究

鄒鵬濤，何磊，張方，朱波

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西南昌 330006

冠心病是心血管疾病中的常見病癥，其病變機(jī)制為冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣病變，最終使個(gè)體出現(xiàn)諸如心肌缺血、缺氧或壞死等臨床癥狀[1-2]。全球每年死于冠心病的病例總數(shù)近700萬，位居單病種死因之首[3]。miRNA已被多項(xiàng)研究證實(shí)參與動(dòng)植物基因表達(dá)調(diào)控，主要機(jī)制為通過降解靶基因mRNA或調(diào)控其蛋白表達(dá)影響機(jī)體生理機(jī)制[4]。miR-29a是miRNA的一員，被證實(shí)廣泛參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。張建興等[5]研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血清miR-29a水平顯著高于不穩(wěn)定型心絞痛患者，提示miR-29a與心肌缺血-再灌注關(guān)聯(lián)密切。Yang等[6]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者中miR-29a表達(dá)顯著上調(diào)，而通過抑制miR-29a的表達(dá)可發(fā)揮抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用。Silvis等[7]研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)促進(jìn)多種炎癥因子分泌，炎癥因子進(jìn)一步加重冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。關(guān)于miR-29a對冠心病患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究較多，但對其機(jī)制的探索較少，本研究旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析炎癥因子對miR-29a及其對應(yīng)蛋白表達(dá)的影響，以期為冠心病患者的治療提供新的理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與材料

原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）、熒光檢測試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司）、蛋白核酸定量儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（青島奧特凱美軟控技術(shù)有限公司）、蛋白垂直電泳儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與增殖過程

凍存細(xì)胞用37℃水浴融化后，在4℃環(huán)境下以3000轉(zhuǎn)/min離心。在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的改良RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸生長。增殖過程選取對數(shù)生長期的細(xì)胞稀釋至1×103cell/ml。將瓊脂與培養(yǎng)基按1∶9的比例充分混合，加入平板中，放置在室溫下使瓊脂固化，然后接種細(xì)胞懸浮液混合物（1.5ml）和等體積的0.5%軟瓊脂。將板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)兩周后，使之生長至合適細(xì)胞密度。將腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）及血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）分別加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為4～48h。

1.3 反轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)分析

向收集的培養(yǎng)細(xì)胞中加入TRIzovl試劑以提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照ABI公司（美國）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作。cDNA為模版反應(yīng)體系和條件：體系包含10μl去離子水、1μl寡核苷酸（oligonucleotide，dT）、2μl RNA，16℃條件下孵育30min，在體系內(nèi)2μl脫氧核糖核苷酸三磷酸、1μl RNA抑制酶、4μl上樣緩沖液42℃孵育30min，85℃加熱5min，迅速冷卻后，置于4℃環(huán)境中保存。將得到的樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR），采用TaqMan Universal PCR Master Mix 20μl反應(yīng)體系，在羅氏（瑞士）LightCycler480儀器上操作，以β-action作為表達(dá)檢測的內(nèi)參。預(yù)變性10min；于95℃條件下變性15s，后60℃條件下退火30s，70℃條件下延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，β-action上下游引物序列：5'-TCAG GTCATCACTATCGGCAAT-3'，5'-AAAGAAAGGGT GTAAAACGCA-3'。miR-29a上下游引物序列：5'-CC CATCTATGAGGGTTACGC-3'，5'-TTTAATGTCACG CACGATTTC-3'。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測及蛋白質(zhì)印跡分析

使用EzOmics one-step qPCR試劑盒對細(xì)胞系內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-29a及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)情況進(jìn)行檢測，檢測儀器為stratagene Mx3000 pTM型實(shí)時(shí)定量PCR儀，miR-29a值以U6值作為參照，eNOS值以GAPDH作為參照，分別計(jì)算miR-29a及eNOS的表達(dá)情況。在37°C條件下以4000轉(zhuǎn)/min離心5min收集細(xì)胞，將細(xì)胞（1×106）在250μl放射免疫沉淀測定緩沖液中裂解。通過10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（denatured polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離50μg細(xì)胞蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，加入1∶3000稀釋后轉(zhuǎn)化因子2β（transforming factor 2β，TRA2β）的大鼠抗人單克隆抗體后在4°C下孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline solution，PBS）洗滌3次后將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗大鼠二抗以1∶3000的稀釋度在室溫下靜置處理30min，洗去所有未偶聯(lián)的抗體。使用Western熒光檢測試劑染色，用BandScan 5.0軟件觀測成像光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子TNF-α和SAA對細(xì)胞miR-29a表達(dá)的影響分析

加入TNF-α和SAA并未使miR-21、miR-29b、miR-29c的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯變化（P>0.05）；但miR-29a的表達(dá)水平較對照組顯著提高（P<0.05）；加入TNF-α與加入SAA的細(xì)胞系中miR-29a表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1、圖1。

圖1 TNF-α和SAA對細(xì)胞miR-29a表達(dá)的影響

表1 TNF-α和SAA對細(xì)胞miR-29a表達(dá)的影響分析（±s）

表1 TNF-α和SAA對細(xì)胞miR-29a表達(dá)的影響分析（±s）

指標(biāo) TNF-α（ng/ml）SAA（U/L） 對照組 t P miR-21 1.05±0.21 1.07±0.15 1.03±0.18 0.635 0.551 miR-29a 2.21±0.26 2.38±0.18 1.04±0.15 0.816 0.236 miR-29b 1.10±0.10 1.09±0.15 1.06±0.11 2.659 0.021 miR-29c 1.12±0.11 1.13±0.15 1.10±0.17 0.165 0.897

2.2 炎癥因子水平及作用時(shí)間對miR-29a表達(dá)影響的分析

qRT-PCR檢測顯示，隨著加入炎癥因子水平的升高，細(xì)胞系中miR-29a表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，見表2、圖2。以1.0ng/ml的TNF-α及SAA作為恒定水平進(jìn)行干預(yù)，觀察炎癥因子作用時(shí)間對miR-29a表達(dá)的影響，結(jié)果顯示隨著時(shí)間推移，miR-29a表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，見表3、圖3。

圖2 炎癥因子水平對miR-29a表達(dá)的影響

圖3 時(shí)間對miR-29a表達(dá)水平的影響

表2 炎癥因子水平對miR-29a表達(dá)影響的分析（±s）

表2 炎癥因子水平對miR-29a表達(dá)影響的分析（±s）

炎癥因子水平（ng/ml）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 1.04±0.15 1.01±0.18 0.516 0.419 1 2.21±0.26 2.38±0.18 0.635 0.411 10 2.59±0.15 2.61±0.16 0.951 0.215 20 2.73±0.11 2.81±0.16 0.669 0.411

表3 時(shí)間對miR-29a表達(dá)影響的分析（±s）

表3 時(shí)間對miR-29a表達(dá)影響的分析（±s）

炎癥因子加入時(shí)間（h）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 2.21±0.26 2.20±0.18 0.441 0.635 4 2.34±0.14 2.41±0.15 0.951 0.236 12 2.46±0.12 2.51±0.11 0.746 0.431 24 2.68±0.18 2.67±0.17 0.635 0.441

2.3 炎癥因子對eNOS蛋白表達(dá)水平影響的分析

采用Western blot對TNF-α及SAA通過細(xì)胞系作用于eNOS蛋白表達(dá)水平影響進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，相較于對照組，加入TNF-α及SAA均可導(dǎo)致eNOS蛋白表達(dá)的下調(diào)，見圖4。

圖4 炎癥因子對eNOS蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 丹參對miR-29a及eNOS蛋白表達(dá)影響的分析

丹參不同劑量、不同作用時(shí)間對miR-29a表達(dá)水平影響的分析結(jié)果顯示，miR-29a表達(dá)水平隨著丹參濃度的升高呈降低趨勢；恒定濃度下，隨著時(shí)間的推移，miR-29a表達(dá)水平呈降低趨勢，見圖5。加入丹參可使eNOS蛋白表達(dá)升高，見圖6。

圖5 丹參對miR-29a表達(dá)水平的影響

圖6 丹參對eNOS蛋白表達(dá)的影響

3 討論

冠心病的發(fā)病機(jī)制及病因在不同患者中存在較大的差異，患者面臨的臨床風(fēng)險(xiǎn)也存在較大差異[8]。當(dāng)前臨床上主要將心電圖、心肌損傷標(biāo)志物用于冠心病的診斷中，但上述檢測方式均存在一定的局限性，冠心病患者的早期診斷難度較大[9]。針對冠心病流行病學(xué)的研究指出，近些年冠心病患者的預(yù)后呈好轉(zhuǎn)趨勢，但仍有部分患者在干預(yù)后數(shù)月或數(shù)年后出現(xiàn)急性心肌梗死[10]。目前針對上述現(xiàn)象的研究屬于熱點(diǎn)方向之一，通過篩選心血管時(shí)間或死亡高風(fēng)險(xiǎn)患者并進(jìn)行標(biāo)志物的分析，對降低冠心病患者病死率具有積極意義。

miRNA主要作用機(jī)制為通過降解或翻譯抑制實(shí)現(xiàn)對靶基因的負(fù)調(diào)控，進(jìn)而起到調(diào)控生理機(jī)制的作用[11]。人類基因組中約有1881條miRNA前體，影響約60%人類基因組中基因片段的表達(dá)，提示miRNA對人體多項(xiàng)生物進(jìn)程如細(xì)胞分化、增殖、凋亡等發(fā)揮重要作用[12]。有研究指出，miRNA參與內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增生、新生血管形成等進(jìn)程，同時(shí)還影響惡性腫瘤細(xì)胞的遷移、凋亡等[13-14]。miR-29a是miRNA家族中的一員，已有研究指出，miR-29a在多種癌組織中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[15]；但關(guān)于miR-29a對冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的相關(guān)研究較少。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入TNF-α與SAA并未使miR-21、miR-29b和miR-29c的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯變化，但miR-29a的表達(dá)水平較對照組顯著提高，提示TNF-α及SAA可通過影響miR-29a的表達(dá)參與機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞的病變進(jìn)程。本研究進(jìn)一步分析劑量及作用時(shí)間對miR-29a表達(dá)水平的影響，提示隨著炎癥因子水平的增加及作用時(shí)間的延長，miR-29a表達(dá)量均呈現(xiàn)升高趨勢，進(jìn)一步證實(shí)炎癥因子TNF-α及SAA誘導(dǎo)miR-29a的表達(dá)，且這種誘導(dǎo)呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴。

本研究分析炎癥因子對eNOS蛋白表達(dá)水平的影響，顯示加用TNF-α及SAA均導(dǎo)致eNOS蛋白表達(dá)的下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。魏艷勝等[16]發(fā)現(xiàn)eNOS蛋白廣泛參與冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)程，而加入谷紅注射液可明顯提高eNOS表達(dá)水平，從而提高冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。本研究中炎癥因子的引入使eNOS蛋白表達(dá)降低，卻提高miR-29a的表達(dá)量，提示miR-29a可通過影響eNOS蛋白的表達(dá)參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)程。吳瑩[17]的研究證實(shí)eNOS是miR-29a的靶標(biāo)。另有研究認(rèn)為miR-29a通過影響eNOS蛋白的表達(dá)，在腎間質(zhì)纖維化、心肌纖維化等病變中發(fā)揮重要作用，與本研究結(jié)論相似[18]。最后為反向論證本研究的結(jié)論，研究中引入血管保護(hù)性藥物丹參，加入丹參后可抑制miR-29a的表達(dá)，增加eNOS蛋白的表達(dá)，提示miR-29a正是通過影響eNOS蛋白的表達(dá)參與血管內(nèi)皮功能變化進(jìn)程，而使用血管保護(hù)性藥物則可特異性降低miR-29a的表達(dá)，增加eNOS蛋白的表達(dá)。

綜上所述，炎癥因子TNF-α和SAA可通過誘導(dǎo)miR-29a表達(dá)參與血管內(nèi)皮損傷進(jìn)程，eNOS蛋白廣泛參與該進(jìn)程，而應(yīng)用血管保護(hù)性藥物可一定程度上抑制miR-29a的過表達(dá)，降低eNOS蛋白的表達(dá)量，從而發(fā)揮保護(hù)血管的作用。