藏藥三味檀香湯散對全腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DND和凋亡的影響

劉杰，劉輝琦，王生蘭，曹學(xué)鋒，吳穹

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海西寧810001)

三味檀香湯散藏藥名:贊旦松湯，由檀香100 g、肉豆蔻100 g、廣棗100 g經(jīng)過粉碎、混合制成的棕紅色散劑，方中檀香為君藥，輔以肉豆蔻和廣棗，具有清熱、祛風(fēng)、養(yǎng)心之功效，是蒙藏醫(yī)治療心熱病的常用藥方［1］。目前應(yīng)用三味檀香湯散在心血管缺血缺氧方面有一些研究［2-7］，認(rèn)為此方劑對急性缺血缺氧、心肌缺血/再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用［4］，但對腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，I/R)研究的報道甚少。本實驗通過四血管閉塞法復(fù)制大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，全腦缺血/再灌注損傷前藏藥低、高劑量組分別用三味檀香湯散低、高劑量給大鼠灌胃預(yù)處理，標(biāo)本硫堇染色下觀察海馬CAl區(qū)神經(jīng)元組織學(xué)分級(Histological grade，HG)、神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)的變化，反映神經(jīng)元遲發(fā)性死亡(Delayed Neuron Death DND)的情況;采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡陽性個數(shù)和免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3表達(dá)的變化，反映神經(jīng)元凋亡的程度，為探討三味檀香湯散對全腦缺血/再灌注損傷大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將有關(guān)情況報告如下。

1 材料

1.1 動物蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供雄性Wistar大鼠［SCXK(甘)2009-0004］，清潔級，48只，在我院實驗室飼養(yǎng)2～3周，體質(zhì)量至280～320 g開始實驗。

1.2 藥物與試劑藏藥三味檀香湯散(青海省金訶藏藥廠生產(chǎn)，標(biāo)準(zhǔn)編號:WS3-BC-0260-95)，每袋裝40 g，用前研磨成粉，用蒸餾水配制成50%的水溶液(每毫升溶液含生藥0.5 g)［4］;硫堇(分析純)購于美國Sigma公司，TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于北京中昊時代生物公司，caspase-3免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。

2 方法

2.1 大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型的制備采用Pulsinelli四血管閉塞法建立全腦缺血模型。所有實驗動物首先凝閉雙側(cè)椎動脈，方法如下:動物全麻、固定，后頸部縱行切口，鈍性分離暴露雙側(cè)翼狀孔，徹底電凝雙側(cè)椎動脈，術(shù)畢單籠飼養(yǎng)48 h后復(fù)制動物全腦缺血/再灌注損傷模型:乙醚吸入麻醉、夾閉雙側(cè)頸總動脈持續(xù)8 min，首先可見大鼠瀕死掙扎，后翻正反射消失，雙瞳孔散大、對光反射消失，部分動物出現(xiàn)呼吸暫停，缺血8 min后迅速解除頸總動脈夾閉，大鼠雙眼瞳孔逐漸恢復(fù)至正常，對光反射、翻正反射恢復(fù)，完成腦缺血/再灌注損傷模型復(fù)制，術(shù)畢將動物單籠獨飼養(yǎng)(按標(biāo)記檢測HG、ND的大鼠飼養(yǎng)7 d，檢測TUNEL和caspase-3的大鼠飼養(yǎng)3 d)。

2.2 動物分組與給藥方法48只大鼠隨機(jī)分為4組(每組12只:6只用于硫堇染色觀察HG和ND，6只用于檢測TUNEL和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)):①假手術(shù)組:凝閉雙側(cè)椎動脈，暴露但不夾閉雙側(cè)頸總動脈;②全腦缺血/再灌注損傷模型組:凝閉雙側(cè)椎動脈，夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min;③三味檀香湯散低劑量預(yù)處理組(藏藥低劑量組):在全腦缺血前10 d起三味檀香湯散按成人劑量的10倍，即1.0 g/kg，每天灌胃1次，連續(xù)10 d，余同I/R模型組;④三味檀香湯散高劑量預(yù)處理組(藏藥高劑量組):藏藥按成人劑量的15倍，即1.5 g/kg給藥，余同藏藥低劑量組。

2.3 指標(biāo)測定及方法按動物分組標(biāo)記造模規(guī)定時間斷頭處死動物，冰皿上快速取腦，在自嗅結(jié)節(jié)前緣4 mm處做成厚約4 mm包含雙側(cè)海馬組織的冠狀切面的腦片，放入4%多聚甲醛液中固定48 h，脫水，浸蠟，包埋后連續(xù)5 μm切片。①硫堇染色，按Kitagawa和Kato方法，于光學(xué)顯微鏡下，確定HG:0級，無神經(jīng)元死亡;1級，散在神經(jīng)元死亡;2級，成片神經(jīng)元死亡;3級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)平均等級作為統(tǒng)計值;ND:計數(shù)海馬CAl區(qū)每1 mm2區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均值作為統(tǒng)計值，根據(jù)海馬CAl區(qū)HG和ND結(jié)果，反映DND的程度，對其組織學(xué)改變進(jìn)行評價。②采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡細(xì)胞，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。③采用免疫組織化學(xué)染色(鏈酶菌抗生物素蛋白過氧化物酶法)檢測caspase-3的表達(dá)。caspase-3及TUNEL陽性物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi)，使胞核呈棕黃色，采用顯微計數(shù)法(400×)，隨機(jī)選取缺血海馬5個視野，計算每1 mm2區(qū)段內(nèi)TUNEL標(biāo)記和免疫組化caspase-3顯色陽性的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)兩者的變化反映海馬CAl區(qū)神經(jīng)元凋亡程度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS l1.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用±s表示，單因素方差分析(One-Way ANOVA)及t檢驗進(jìn)行組間比較，組織學(xué)分級采用多樣本等級資料的秩和檢驗進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異有顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

觀察各組大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元組織學(xué)分級(HG)的HG結(jié)果見表1，檢測各組大鼠神經(jīng)元密度ND結(jié)果見表2，神經(jīng)元凋亡(TUNEL)陽性細(xì)胞個數(shù)及caspase-3的比較結(jié)果見表3。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織學(xué)分級(HG)結(jié)果

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度ND結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度ND結(jié)果(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與全腦缺血/再灌注損傷模型組比較，#P＜0.05;藏藥高、低劑量組間比較，▲P＜0.05。

組別ND/(個·mm－2)183.667±6.408 3全腦缺血/再灌注損傷模型組30.333±4.885 4*藏藥低劑量組48.500±12.629 3*#藏藥高劑量組68.167±12.106 5*#▲假手術(shù)組

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL凋亡細(xì)胞和caspase-3表達(dá)的結(jié)果±s)

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL凋亡細(xì)胞和caspase-3表達(dá)的結(jié)果±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與全腦缺血/再灌注損傷模型組比較，#P＜0.05，藏藥高、低劑量組間比較，▲P＜0.05。

組別凋亡細(xì)胞數(shù)/(個·mm－2)caspase-3/(個·mm－2)10.833±2.926 920.625±6.255 0全腦缺血/再灌注損傷模型組138.167±13.044 8*79.250±8.811 5*藏藥低劑量組117.167±12.890 6*#61.625±10.528 0*#藏藥高劑量組92.333±8.140 4*#▲54.125±12.710 4*#假手術(shù)組

3.1 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞2至3層整齊排列、細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜、細(xì)胞核無缺損、且胞核圓，位于中央，部分細(xì)胞可見核仁，尼氏體，HG為0級，ND為183.667±6.408 3個/mm2。TUNEL及免疫組化染色淺，少見凋亡小體及核固縮，細(xì)胞核染色少見，TUNEL法計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)為10.833±2.926 9個/mm2，caspase-3陽性染色細(xì)胞為20.625±6.255 0個/mm2。

3.2 全腦缺血/再灌注損傷模型組大鼠海馬CA1區(qū)見明顯的組織損傷，多數(shù)錐體細(xì)胞崩解，大量細(xì)胞碎片散布，存活的錐體細(xì)胞零星分布，部分細(xì)胞體積縮小，呈不規(guī)則形，核膜不完整、核仁不見，HG增高為3級，而ND顯著性降低。TUNEL及caspase-3免疫組化深染，凋亡細(xì)胞(138.167±13.044 8)個/mm2和caspase-3陽性細(xì)胞(79.250±8.811 5)個/mm2數(shù)目明顯增多，顯著高于其它三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3 藏藥組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元HG級別降低、ND數(shù)目升高，組織損傷程度減輕，可見存活的錐體細(xì)胞增多，TUNEL陽性凋亡細(xì)胞和caspase-3染色細(xì)胞數(shù)目減少，檢測藏藥低、高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元四項指標(biāo)與假手術(shù)組和全腦缺血/再灌注損傷模型組的結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藏藥低、高劑量組間比較，后者作用強(qiáng)于前者，其中ND數(shù)、TUNEL凋亡陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，HG、caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

4 討論

藏藥三味檀香湯散主要有檀香酮、檀香酸、水楊酸等成分;化學(xué)結(jié)構(gòu):醇類-檀香腦、醛類-糖醛、倍半帖-檀香烯;屬性:行氣活血、養(yǎng)心、安神、消炎、抗菌、鎮(zhèn)咳、袪痰、補身、收斂。馬祁生等［3］研究發(fā)現(xiàn)三味檀香湯散可能是通過增強(qiáng)抗氧化酶活性、清除氧自由基、保護(hù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)，改善缺血心肌能量代謝和功能，提高心肌細(xì)胞對缺氧損傷的耐受性。寇毅英等［4］研究發(fā)現(xiàn)三味檀香散可能通過抑制心肌iNOS水平，減少NO過量產(chǎn)生，從而削弱了NO的細(xì)胞毒性作用。本實驗主要研究藏藥三味檀香湯散是否有減輕全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡作用，為探討該藏藥是否有神經(jīng)保護(hù)作用提供實驗依據(jù)。

國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血/再灌注損傷模型的發(fā)生機(jī)制與興奮性氨基酸毒性、自由基損害、鈣超載、NO的細(xì)胞毒性、血-腦屏障損害、炎性損害等多因素綜合作用有關(guān)，全腦缺血/再灌注損傷模型引起細(xì)胞死亡有壞死和凋亡兩種形式，許多研究已證實，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞會在全腦缺血/再灌注損傷模型后3～4 d出現(xiàn)、7 d左右逐漸發(fā)生完全的遲發(fā)性死亡(DND)現(xiàn)象，因此，本實驗選擇觀察全腦缺血/再灌注損傷模型后7 d海馬CA1區(qū)DND變化情況。實驗發(fā)現(xiàn)全腦缺血/再灌注損傷模型組大鼠HG為3級，DN減少，表明錐體細(xì)胞發(fā)生明顯的DND，模型復(fù)制成功。三味檀香湯散低、高劑量預(yù)處理后可見HG級別降低、ND數(shù)目升高，組織損傷程度減輕，且高劑量組效果好于低劑量組。

全腦缺血/再灌注損傷模型海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要形式是凋亡［8］，絕大部分細(xì)胞凋亡依賴于caspase的存在，caspase的功能有:滅活凋亡抑制蛋白、直接解體細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分解與細(xì)胞骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白、瓦解核結(jié)構(gòu)成核碎片。細(xì)胞凋亡的主要途徑有兩條:①內(nèi)源性途徑:Cyt-C從線粒體釋放到胞漿后與dATP、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合成復(fù)合物，激活caspase-9，caspase-9切割后激活caspase-3，caspases-3是凋亡的最終執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞凋亡中起著最后樞紐的作用［9］;②外源性途徑:Fas膜受體系統(tǒng)激活caspase-8，caspase-8直接激活caspase-3［10］。TUNEL法是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，是最常用的檢測組織樣品凋亡細(xì)胞的手段，但結(jié)果存在假陽性的缺點，所以本實驗分別用TUNEL原位標(biāo)記法和免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡陽性個數(shù)和caspase-3表達(dá)的變化，反映全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度，并可探索三味檀香湯散減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型后caspase-3陽性細(xì)胞與凋亡陽性細(xì)胞高峰時間基本一致［11］，即I/R后24～48 h達(dá)高峰、72 h后開始下降。因此，本實驗選擇全腦缺血/再灌注損傷模型后3d進(jìn)行細(xì)胞核內(nèi)凋亡細(xì)胞、caspase-3基因陽性表達(dá)的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在全腦缺血/再灌注損傷模型模型組有大量TUNEL和caspase-3陽性細(xì)胞，而在藏藥預(yù)處理灌胃大鼠的切片中TUNEL和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)目明顯比I/R組減少。

本次實驗結(jié)果提示藏藥三味檀香湯散預(yù)防給藥可能有減輕全腦缺血/再灌注損傷模型后海馬CA1區(qū)DND、抑制caspase-3表達(dá)，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。通過本實驗也發(fā)現(xiàn)三味檀香湯散低、高劑量組間，后者作用強(qiáng)于前者，尤其對ND數(shù)、TUNEL凋亡陽性細(xì)胞數(shù)影響明顯，對HG、caspase-3表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此對于藏藥三味檀香湯散的腦保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制以及預(yù)防和治療給藥的具體劑量、毒性反應(yīng)等諸多問題還有待繼續(xù)深入研究。

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