紅花綠絨蒿種子休眠解除的生理生化響應(yīng)

陳紅剛,趙文龍,晉 玲,高素芳,杜 弢*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000; 2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省珍稀中藥資源評(píng)價(jià)與保護(hù)利用工程研究中心,甘肅 蘭州 730000)

紅花綠絨蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)為罌粟科綠絨蒿屬草本植物,生于海拔2 800～4 300 m的山坡草地、高山草甸、林緣和溝邊,主要分布于四川西北部、西藏東北部、青海東南部和甘肅西南部[1],其性苦澀、微溫、歸肝、腎經(jīng),具有清熱解毒、利尿和消炎止痛的功效,可以治療遺精、結(jié)核、肺炎、白帶、痛經(jīng)和高血壓等疾病[2]。

近年來,受自然環(huán)境和人為因素的影響,紅花綠絨蒿野生資源遭到了嚴(yán)重破壞,分布范圍和群體數(shù)量逐漸減少,面臨著枯竭的危險(xiǎn)[3-5],1999年我國將紅花綠絨蒿列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》(第1批)Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[6]。紅花綠絨蒿種子具有休眠現(xiàn)象,種子休眠類型為深度復(fù)雜形態(tài)生理休眠,層積處理是打破紅花綠絨蒿種子休眠的有效方法[7],但其機(jī)理尚未明確。本試驗(yàn)通過測定分析層積過程中紅花綠絨蒿種子胚形態(tài)、胚率、發(fā)芽率、營養(yǎng)物質(zhì)、內(nèi)源激素、關(guān)鍵酶活性等理化指標(biāo)的變化規(guī)律,旨在明確種子休眠解除對(duì)生理生化指標(biāo)變化的響應(yīng),為紅花綠絨蒿野生資源保護(hù)和人工馴化栽培提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料 紅花綠絨蒿種子2021年8月采自青海省久治縣隆格山(100°50′12.96″E,33°17′13.49″N,海拔4 317 m),由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為紅花綠絨蒿種子,陰干后室溫儲(chǔ)存。

1.1.2主要儀器及試劑 Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)(德國徠卡公司),LeicaDM500顯微鏡(德國徠卡公司),ROX-400H人工氣候箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司),全波長酶標(biāo)儀Multiskan GO(美國賽默飛世爾科技有限公司),Enppendorf5430R冷凍離心機(jī)(德國Enppendorf公司),T6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),IKARV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司),THZ-82氣浴恒溫振蕩器(常州金壇恒豐儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1種子層積處理 參照陳紅剛等[7]的方法進(jìn)行,隨機(jī)稱取陰干紅花綠絨蒿種子6份,每份10.0 g,1份不做層積處理(CK),于4℃冰箱中保存,其余5份進(jìn)行連續(xù)變溫層積處理,具體為:處理Ⅰ(7℃ 20 d),處理Ⅱ(7℃ 20 d+4℃ 20 d),處理Ⅲ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d),處理Ⅳ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d),處理Ⅴ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d+4℃ 20 d)。層積結(jié)束后取出樣品,于通風(fēng)處陰干、過篩,分取5.0 g種子置于4℃冰箱中保存,進(jìn)行種子質(zhì)量指標(biāo)測定,剩余種子經(jīng)液氮冷凍后置于-80℃低溫冰箱中保存,進(jìn)行種子生理生化指標(biāo)測定。

1.2.2種子胚形態(tài)及胚率觀測 分別取4℃保存的各處理種子30 粒,蒸餾水浸泡12 h,OCT膠水常溫包埋10 min,冷凍包埋5 min(-20℃),Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)切片(厚0.15 mm),LeicaDM500顯微鏡觀察種胚形態(tài)(目鏡10 倍,物鏡40 倍),測量胚長和胚乳長,計(jì)算胚率[8]。

1.2.3種子發(fā)芽指標(biāo)測定 參照陳紅剛等[7]的方法進(jìn)行,分別取4℃保存的各處理種子300 粒,用0.1%的升汞消毒10 min,蒸餾水沖洗5次,播于沙床上(細(xì)沙2～3 mm),每皿播種50 粒,6次重復(fù),在10℃全黑暗條件下培養(yǎng),以胚根突破種皮、胚芽為種子長1/2為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況,及時(shí)補(bǔ)足水分,第23 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.4種子生理生化指標(biāo)測定 分別取-80℃保存的各處理種子,采用考馬斯亮藍(lán)法測定種子可溶性蛋白含量,采用蒽酮比色法測定淀粉和可溶性糖含量,采用ELISA酶聯(lián)免疫法測定丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)活性、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性和6-磷酸-葡萄糖脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PDH)活性,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行,每個(gè)處理3次重復(fù)。蛋白定量試劑盒(批號(hào):20210622)、植物可溶性糖檢測試劑盒(批號(hào):20210422)、淀粉含量檢測試劑盒(批號(hào):20210429)、PK試劑盒(批號(hào):20210329)、SDH測試盒(批號(hào):20210329)購于南京建成生物工程研究所,G-6-PDH檢測試劑盒(批號(hào):202103)購于上海欽誠生物科技有限公司。

分別取-80℃保存的各處理種子0.1 g,采用LC-MS/MS法測定種子內(nèi)赤霉素(Gibberellic acid,GA)、吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)、脫落酸(Abscisic acid,ABA)含量,每個(gè)處理3次重復(fù)。檢測工作委托上海拜譜生物科技有限公司測定,測定條件為:

質(zhì)譜:QTRAP 5500 質(zhì)譜儀(AB SCIEX)。

色譜:Shimadzu Nexera X2 LC-30AD。

色譜柱:Waters Acquity UPLC HSS T3 column (1.7 μm 2.1×100 mm Column)。

試劑:乙腈(millipore,1.00030.4008)、乙酸銨(Sigma,73594)、甲醇(millipore,1.06007.4008)。所有植物激素標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma-Aldrich或上海源葉生物科技有限公司)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2013軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)整理及制圖,采用SPSS 25.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析、多重比較(LSD法)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 層積對(duì)紅花綠絨蒿種子胚發(fā)育及發(fā)芽率的影響

未層積和層積初期紅花綠絨蒿種子胚發(fā)育時(shí)期多處于球型期(圖1A)或心型期(圖1B),種胚未發(fā)育成熟,隨著層積時(shí)間的增加,種胚持續(xù)發(fā)育,經(jīng)歷心型胚后期(圖1C)、魚雷型胚(圖1D),最終發(fā)育成子葉型胚(圖1E),完成形態(tài)后熟。

圖1 紅花綠絨蒿種胚形態(tài)Fig.1 Embryo morphology of Meconopsis punicea注:A,球型胚;B,心型胚;C,心型胚后期;D,魚雷型胚;E,子葉型胚Note:Panel A,globular embryo;Panel B,heart-shaped embryo;Panel C,late heart-shaped embryo;Panel D,torpedo-shaped embryo;Panel E,cotyledon-shaped embryo

種子胚率、發(fā)芽率在層積過程中呈上升趨勢(圖2A,2B)。未層積種子(CK)胚率僅為18.5%,層積處理期間胚率快速增長,處理Ⅴ時(shí)達(dá)到最大值(87.5%),顯著大于未層積種子(CK)(P<0.05);未層積種子(CK)及處理Ⅰ至處理Ⅲ時(shí)期的種子均不發(fā)芽,處理Ⅳ之后種子休眠解除,發(fā)芽率快速升高,處理Ⅴ時(shí)達(dá)到最大值(50.0%),顯著大于未層積種子(CK)(P<0.05)。

圖2 不同層積處理紅花綠絨蒿種子胚率及發(fā)芽率變化Fig.2 Changes of embryo rate and germination rate of M. punicea seeds in different stratification treatments注:CK為未層積種子;Ⅰ為層積處理20 d(7℃ 20 d);Ⅱ?yàn)閷臃e處理40 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d);Ⅲ為層積處理60 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d);Ⅳ為層積處理80 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+- 4℃ 20 d);Ⅴ為層積處理100 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+- 4℃ 20 d+4℃ 20 d)。不同小寫字母表示處理之間在 0.05 水平差異顯著(P<0.05)。下同Note:CK,Unstratified seeds;Ⅰ,Stratification treatment for 20 d (7℃ 20 d);Ⅱ,Stratification treatment for 40 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d);Ⅲ,Stratification treatment for 60 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d);Ⅳ,Stratification treatment for 80 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d + -4℃ 20 d);Ⅴ,Stratification treatment for 100 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d + -4℃ 20 d + 4℃ 20 d). Different lowercase letters indicate that there are a significant difference between stratification treatments at 0.05 level (P<0.05). The same as below

2.2 層積對(duì)紅花綠絨蒿種子營養(yǎng)物質(zhì)含量變化的影響

紅花綠絨蒿種子淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白含量在層積過程中總體呈現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢(圖3A,3B)。淀粉含量在處理 Ⅰ 時(shí)快速升高,后連續(xù)下降,至處理Ⅴ時(shí)小幅回升并達(dá)到最大值(22.28 mg·g-1),最終含量較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05);可溶性糖、可溶性蛋白含量在處理Ⅰ至處理Ⅲ期間持續(xù)上升,后有所降低,處理Ⅴ時(shí)再次上升并分別達(dá)到最大值(46.06 mg·g-1,38.60 mg·g-1),最終含量較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05)。

圖3 紅花綠絨蒿種子層積過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量變化Fig.3 Changes of the nutrient contents in seeds of M. punicea in the stratification treatments

2.3 層積對(duì)紅花綠絨蒿種子呼吸途徑關(guān)鍵酶活性變化的影響

層積過程中,紅花綠絨蒿種子PK活性總體呈下降趨勢(圖4A),處理Ⅳ時(shí)降至最低值(0.66 U·g-1·min-1),最終酶活性較未層積種子(CK)顯著降低(P<0.05);SDH活性總體呈先升后降的趨勢(圖4B),處理Ⅳ時(shí)達(dá)到最大值(1.70 U·mg-1·min-1),最終酶活性較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05);G-6-PDH活性呈先升后降的趨勢,但總體變化比較平穩(wěn)(圖4C),處理Ⅱ時(shí)達(dá)到最大值(1.62 U·g-1·min-1),最終酶活性較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05)。

圖4 紅花綠絨蒿種子層積過程中呼吸途徑關(guān)鍵酶活性變化Fig.4 Changes of key enzyme activities in respiratory pathway of M. punicea seeds in the stratification treatments

2.4 層積對(duì)紅花綠絨蒿種子內(nèi)源激素含量變化的影響

層積過程中,紅花綠絨蒿種子ABA,IAA含量總體呈下降趨勢(圖5A,5D),ABA含量在處理Ⅲ時(shí)降至最低(51.97 ng·g-1),最終含量較未層積種子(CK)顯著降低(P<0.05);IAA含量在處理Ⅰ時(shí)急速下降,后期變化比較平穩(wěn),最終含量較未層積種子(CK)顯著降低(P<0.05);GA3含量呈上下波動(dòng)趨勢(圖5B),并在處理Ⅳ時(shí)達(dá)到最大值(10.51 ng·g-1),最終含量與未層積種子(CK)無顯著性差異;GA1含量呈先升后降的趨勢(圖5C),但總體變化比較平穩(wěn),最終含量與未層積種子(CK)無顯著性差異;ABA/GA3,ABA/GA1比值總體呈下降趨勢(圖5E,5F),最終比值顯著低于未層積種子(CK)(P<0.05)。

圖5 紅花綠絨蒿種子層積過程中內(nèi)源激素含量變化Fig.5 Changes of endogenous hormone content in seeds of M. punicea in the stratification treatments

2.5 紅花綠絨蒿種子休眠解除過程中各指標(biāo)間相關(guān)性分析

由表1可知,種子發(fā)芽率和胚率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與其余指標(biāo)相關(guān)關(guān)系均不顯著;PK活性與淀粉含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SDH活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與ABA含量、IAA含量、ABA/GA3比值、ABA/GA1比值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05);SDH活性與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與ABA含量、IAA含量、ABA/GA3比值、ABA/GA1比值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05);G-6-PDH活性與可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與ABA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05);ABA含量與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),IAA含量與淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),ABA含量與IAA含量、ABA/GA1比值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表1 紅花綠絨蒿種子休眠解除過程中各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation analysis of indicators for the dormancy release of seeds of M. punicea in the stratification treatments

3 討論

3.1 紅花綠絨蒿種子休眠解除與胚形態(tài)發(fā)育的關(guān)系

種胚的進(jìn)一步生長和發(fā)育是形態(tài)生理休眠種子得以萌發(fā)的先決條件,未分化的種胚需要經(jīng)過分化,并達(dá)到一定的長度,而分化了但是發(fā)育不完全的胚也需要生長到一定的閾值才可以萌發(fā)[9]。本研究中,紅花綠絨蒿種胚從球型胚、心型胚、魚雷型胚,最終發(fā)育成子葉型胚,完成形態(tài)后熟,胚率及發(fā)芽率顯著提高(P<0.05),且胚率與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),其他研究者在淫羊藿(Epimediumbrevicornu)[10]、大花貝母(Fritillariaverticillatavar.albidoflora)[11]上也有類似發(fā)現(xiàn)。同時(shí),處理Ⅲ至處理Ⅳ期間胚率快速增長,種子開始發(fā)芽,而該時(shí)期是-4℃至0℃低溫層積階段,說明-4℃至0℃低溫層積是紅花綠絨蒿種胚發(fā)育的關(guān)鍵。

3.2 紅花綠絨蒿種子休眠解除與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

種子中的儲(chǔ)藏物質(zhì)主要包括淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)和可溶性糖等,淀粉是植物體內(nèi)重要的儲(chǔ)藏物質(zhì),成熟種子內(nèi)的淀粉在相關(guān)代謝酶的催化下逐步水解為可被利用的小分子物質(zhì),從而促進(jìn)種子休眠的解除[12]。如黃精(Polygonatumsibiricum)種子在低溫層積過程中淀粉和粗脂肪逐步分解為可溶性糖及可溶性蛋白等小分子物質(zhì),為種胚的分化發(fā)育提供能量,促進(jìn)種子萌發(fā)[13]。本研究中,處理Ⅰ時(shí)期紅花綠絨蒿種子淀粉含量的上升是為下一步的物質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行積累,處理Ⅱ至處理Ⅳ時(shí)期淀粉含量持續(xù)下降,分解為小分子物質(zhì),從而促進(jìn)種子休眠解除,處理Ⅴ時(shí)期淀粉含量又開始回升,原因可能是休眠已經(jīng)解除,種子開始為下一步的發(fā)芽進(jìn)行物質(zhì)積累。

可溶性糖是種子中最直接的供能物質(zhì),由淀粉降解產(chǎn)生,同時(shí)又作為呼吸底物被消耗,因此,可溶性糖含量的高低既與淀粉降解的速度有關(guān),又與呼吸消耗的速度有關(guān)[14-15]?？扇苄缘鞍资遣糠旨?xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)物質(zhì),為種胚的生長提供物質(zhì)能量[16]。本研究中,處理Ⅴ時(shí)期紅花綠絨蒿種子可溶性糖、可溶性蛋白含量較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05),從而促進(jìn)種子休眠的解除,但處理Ⅲ至處理Ⅳ時(shí)期可溶性糖、可溶性蛋白含量均有所下降,原因可能是該時(shí)期種子胚率快速增長,代謝活動(dòng)增強(qiáng),可溶性糖、可溶性蛋白消耗的速度大于種子中儲(chǔ)藏物質(zhì)降解的速度,導(dǎo)致其含量降低。此研究結(jié)果在東北紅豆杉(Taxuscuspidata)[17]、流蘇樹(Chionanthusretusus)[18]、垂珠花(Styraxdasyanthus)[19]上也有類似發(fā)現(xiàn)。

3.3 紅花綠絨蒿種子休眠解除與呼吸代謝的關(guān)系

植物體內(nèi)有三條最基本的呼吸代謝途徑,具體為糖酵解途徑(Embden-Meyerhof pathway,EMP)、三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)、磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway,PPP)[20]。PK,SDH,G-6-PDH分別是EMP途徑、TCA循環(huán)、PPP途徑的關(guān)鍵酶,當(dāng)種子呼吸途徑轉(zhuǎn)為PPP時(shí),意味著種子由休眠向萌發(fā)過程轉(zhuǎn)變[21-22]。本研究中,處理Ⅴ時(shí)期紅花綠絨蒿種子PK活性較未層積種子(CK)顯著降低(P<0.05),SDH活性、G-6-PDH活性較未層積種子(CK)顯著升高(P<0.05),意味著種子EMP途徑減弱,TCA,PPP途徑增強(qiáng),呼吸代謝途徑由EMP-TCA向PPP途徑轉(zhuǎn)變,種子休眠解除。此結(jié)果與羌活(Notopterygiumincisum)[23]、七葉一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara)[24]、華重樓(ParispolyphyllaSmith var.chinensis)[25]種子研究結(jié)果類似,且與休眠種子呼吸代謝酶被抑制的觀點(diǎn)一致[26]。

3.4 紅花綠絨蒿種子休眠解除與內(nèi)源激素的關(guān)系

多種植物激素參與調(diào)控種子休眠與萌發(fā)[27-28],其中ABA和GA行使主要功能,ABA促進(jìn)種子休眠,GA促進(jìn)種子萌發(fā)[29],IAA通過調(diào)控ABA,GA的合成和傳導(dǎo)影響種子的休眠及萌發(fā)[30],但有關(guān)IAA對(duì)種子萌發(fā)和休眠的影響還有一定爭議,有研究表明IAA具有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用[31-33],但也有學(xué)者認(rèn)為IAA與ABA存在協(xié)同作用從而誘導(dǎo)種子休眠[34]。本研究中,紅花綠絨蒿種子ABA,IAA含量總體下降,發(fā)芽率顯著上升(P<0.05),說明ABA,IAA含量下降促進(jìn)種子休眠解除;GA3含量在處理Ⅲ至處理Ⅳ時(shí)期顯著升高(P<0.05),同時(shí)期種子胚率快速增長,這可能與GA3大量合成有利于動(dòng)員種子的儲(chǔ)存物質(zhì)和胚的擴(kuò)張有關(guān)[35],隨后GA3被消耗導(dǎo)致含量驟降,這與小花草玉梅(Anemonerivularisvar.floreminore)[36]、三七(Panaxnotoginseng)[37]等種子研究結(jié)果類似;GA1含量變化總體比較平穩(wěn),處理 Ⅰ 時(shí)期含量的上升可能與啟動(dòng)種子休眠調(diào)控進(jìn)程有關(guān)。

種子休眠不僅取決于植物激素的絕對(duì)含量,還取決于激素之間的平衡和消長變化[38-39],GA與ABA的比值對(duì)種子休眠及萌發(fā)起主導(dǎo)作用[40],種子休眠隨GA/ABA比例增大而解除[41-43]。本研究中,紅花綠絨蒿種子ABA/GA3,ABA/GA1比值總體呈下降趨勢,發(fā)芽率顯著上升(P<0.05),說明GA/ABA比值正向調(diào)控紅花綠絨蒿種子休眠的解除。

4 結(jié)論

紅花綠絨蒿種子休眠解除是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程,隨著層積時(shí)間的延長,種胚從球型胚、心型胚、魚雷型胚,最終發(fā)育成子葉型胚,完成形態(tài)后熟;7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d+4℃ 20 d的連續(xù)變溫層積處理,是目前最佳的層積處理方案;種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累,呼吸代謝途徑由EMP-TCA向PPP途徑轉(zhuǎn)變,ABA,IAA含量及ABA/GA3,ABA/GA1比值降低是紅花綠絨蒿種子休眠解除的關(guān)鍵,且此過程與ABA調(diào)控密切相關(guān)。