濕貯玉米中添加春蓼對(duì)飼料抑菌能力的影響

鄭楊晨,趙峻祥,劉宇洋,卞彬彬,孔令芝,李井春,李雁冰*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 大慶 163319)

春蓼(Polygonumpersicaria)屬于蓼科(Polygonaceae)植物,是一年生草本植物,主產(chǎn)于我國(guó)北部和西南各地,主要集中在華東、華中、華南等地,延伸至東北一帶,黑龍江地區(qū)尤以春蓼居多[1]。早在1952年春蓼浸膏就以被批準(zhǔn)用于治療便秘[2]。眾多研究表明蓼科蓼屬植物具有良好的中藥作用,常見(jiàn)的有頭花蓼(Polygonumcapitatum)、木天蓼(Actinidiapolygama)、辣蓼(Polgonumhydropiper)等,其主要有效成分是黃酮類(lèi)、醌類(lèi)、苯丙類(lèi)化合物等,藥理作用包括抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、止痛、殺蟲(chóng)[3-5]。有研究學(xué)者和養(yǎng)殖者應(yīng)用辣蓼飼喂畜禽,對(duì)畜禽疾病進(jìn)行防治,并取得良好效果[6-7]。春蓼同為蓼屬植物,其藥理作用可能相同。

濕貯玉米又稱(chēng)高水分玉米、高濕玉米,與干玉米或蒸汽壓片玉米相比,濕貯玉米收獲時(shí)間早,省去了干燥、蒸汽加熱和機(jī)械壓片等過(guò)程,具有瘤胃淀粉消化率較高的特點(diǎn),近年來(lái)逐漸受到畜牧業(yè)的關(guān)注和應(yīng)用[8]。但濕貯玉米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受收獲時(shí)含水量和加工制作方法等多種因素的影響,易出現(xiàn)腐敗發(fā)霉變質(zhì)等現(xiàn)象,飼喂腐敗變質(zhì)飼料可引發(fā)多種疾病[9-10]。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究表明,動(dòng)物飼料品質(zhì)可以顯著影響畜禽腸道微生物群落的發(fā)展,腸道沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是常見(jiàn)食源性致病菌,飼料對(duì)其來(lái)說(shuō)是一個(gè)次優(yōu)環(huán)境,有害菌株經(jīng)飼料傳播已被證明會(huì)影響畜禽的健康[10-15]。目前畜牧業(yè)多主張防患大于治療,且自2020年7月1日起,國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開(kāi)始施行“禁抗令”,所有商業(yè)飼料生產(chǎn)中停止使用促生長(zhǎng)用抗生素。2022年兩會(huì)再次強(qiáng)調(diào)糧食安全的重要性,要把“藏糧于地,藏糧于技”落實(shí)到位[16]。蓼屬植物中的多種活性成分以及發(fā)酵中藥方式長(zhǎng)足的進(jìn)步,使得中草藥春蓼與飼料混合青貯的探究對(duì)畜禽健康、動(dòng)物產(chǎn)品安全和替代抗生素具有更重要的意義。目前研究多以辣蓼等蓼屬植物為主,春蓼研究較少,因此本研究旨在探索以不同比例春蓼與濕貯玉米混合青貯對(duì)飼料抑菌能力的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)春蓼作為飼料添加劑資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青貯原料及菌株來(lái)源

玉米購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市,全株春蓼采自黑龍江省大慶市。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus),雞沙門(mén)氏菌(Salmonellagullinarum)由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究室分離、鑒定,由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以濕貯玉米為材料,將陰干后的全株春蓼用粉碎機(jī)粉碎,粉碎后的粉末過(guò)四號(hào)篩,放進(jìn)實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌樣品袋保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)分3個(gè)處理,為無(wú)春蓼添加對(duì)照組、5%春蓼添加組、10%春蓼添加組。將濕貯玉米、春蓼按上述比例混勻裝入真空包裝袋,每袋300 g,使用真空包裝機(jī)排盡空氣進(jìn)行真空包裝。各處理重復(fù)3次,置于通風(fēng)陰涼處,分別在3,7,14,30,60天進(jìn)行開(kāi)封檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定 pH值采用pH計(jì)測(cè)定(PSH-3C,選自上海虹益儀器儀表有限公司)。測(cè)定后保留適量混合溶液。有機(jī)酸使用中速定性濾紙(102,杭州富陽(yáng)北木漿有限公司)過(guò)濾后,利用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸的含量。色譜條件為:色譜柱Carbomix H-HP5(8%交聯(lián)度,5 μm,8%交聯(lián)度,7.8×300 mm);流動(dòng)相2.5 mmol·L-1硫酸,臨用前用超聲波脫氣;流速0.6 mL·min-1,進(jìn)樣10 μL;溫度55℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。

1.3.2營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 干物質(zhì)(Dry matter,DM)參照劉宇洋等[17]的方法將開(kāi)封后的青貯飼料放置于65℃電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9240B,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),烘干48 h,稱(chēng)量差值得出干物質(zhì)含量。

1.3.3微生物數(shù)量測(cè)定 取開(kāi)封的青貯飼料樣本20 g分別與180 mL滅菌生理鹽水(0.85%)混合,并逐層稀釋,進(jìn)行微生物數(shù)量的檢測(cè)。參考張嘉懿等[18]的方法測(cè)定乳酸菌(Lacticacidbacteria)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Yeasts)數(shù)量(MRS培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司),使用電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9272,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)37℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4有氧穩(wěn)定性 將青貯飼料樣品放入1 L的聚乙烯罐中,罐口完全敞開(kāi),使用雙層醫(yī)用無(wú)菌紗布覆蓋,防止干燥和污染,樣本正中插入溫度計(jì),敞口放置,環(huán)境溫度為實(shí)驗(yàn)室室溫。每日2次(6∶00,18∶00)記錄室溫和所有樣本的溫度,當(dāng)樣本的溫度超過(guò)室溫2℃時(shí)判定為樣本腐敗,以此作為判定標(biāo)準(zhǔn)[19]。

1.3.5代謝組學(xué)分析 春蓼乙酸乙酯提取液作為檢測(cè)樣本(每個(gè)樣本三個(gè)重復(fù))由上海派森諾生物科技有限公司采用LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行生物體系代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。色譜條件:Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific,USA)超高效液相系統(tǒng),使用ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1×150 mm,1.8 um)(Waters,Milford,MA,USA)色譜柱,0.25 mL·min-1的流速,40℃的柱溫,進(jìn)樣量2 μL。正離子模式,流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),梯度洗脫程序?yàn)?0～1 min,2% B2;1～9 min,2%～50% B2;9～12 min,50%～98%B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～2% B2;14～20 min,2% B2。負(fù)離子模式,流動(dòng)相為乙腈(B3)和5 mM甲酸銨水(A3),梯度洗脫程序?yàn)?0～1 min,2% B3;1～9 min,2%～50% B3;9～12 min,50%～98% B3;12～13.5 min,98% B3;13.5～14 min,98%～2%B3;14～17 min,2% B3[20]。質(zhì)譜條件:Thermo QExactive Focus質(zhì)譜檢測(cè)器(Thermo Fisher Scientific,USA),電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325℃,以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描,一級(jí)離子掃描范圍m/z 100～1 000,并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解,碰撞能量為30 ev,二級(jí)分辨率為17 500,采集信號(hào)前3離子進(jìn)行碎裂,同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無(wú)必要的MS/MS信息[21]。

1.4 青貯后接種有害菌抑菌試驗(yàn)

在青貯30,60天開(kāi)封時(shí),取120 g青貯飼料添加1×105cfu·mL-1的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌混勻,取試驗(yàn)室無(wú)菌樣品袋,將每袋120 g的飼料平均分裝到12個(gè)樣品袋中,每袋約為10 g,用真空封口機(jī)封口,放置室溫下青貯。設(shè)置4個(gè)不同青貯時(shí)間,分別為8 h,24 h,48 h,72 h,分別在對(duì)應(yīng)時(shí)間使用平板涂布法檢測(cè)三種有害菌菌數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Microsoft Excel 2021整理數(shù)據(jù),采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析﹐采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;均以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中一般線(xiàn)性模型單變量方差分析實(shí)現(xiàn)交互效應(yīng)的方差分析,均以P<0.05為顯著具有交互效應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn);以P<0.01為具有極顯著交互效應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)。

將春蓼代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)通過(guò)Proteowizard軟件包(v3.0.8789)[22]中MSConvert工具將原始質(zhì)譜下機(jī)文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式。采用R XCMS軟件包[23]進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊處理,得到物質(zhì)定量列表,參數(shù)設(shè)置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5,30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=‘centWave’。采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB[24],massbank[25],LipidMaps[26],mzcloud[27],KEGG[28]及自建物質(zhì)庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)的鑒定,參數(shù)設(shè)置為ppm<30。采用總峰面積歸一化的方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)校正,消除系統(tǒng)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料指標(biāo)的檢測(cè)

青貯原料組成成分如表1所示。春蓼含水量為73.83%,pH值為5.90,乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌數(shù)量分別為7.55,7.49,7.37 lg cfu·g-1,玉米籽粒含水量34.20%,pH值為5.88,乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌數(shù)量分別為5.78,4.10,2.88 lg cfu·g-1。

表1 青貯原料組成Table 1 The composition of silage raw materials

2.2 春蓼不同添加量對(duì)濕貯玉米發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表2可知,經(jīng)過(guò)不同時(shí)間發(fā)酵處理的各組,其干物質(zhì)含量、pH值、乳酸菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

表2 春蓼不同添加量對(duì)濕貯玉米中微生物菌數(shù)的影響Table 2 Effect of different adding amount of Polygonum persicaria on microbial number in high moisture corn

發(fā)酵3天時(shí),添加組干物質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其余時(shí)間段內(nèi)各組干物質(zhì)含量無(wú)顯著差異,添加組pH值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),10%春蓼pH值最高,達(dá)4.04;7天時(shí),添加組pH值迅速下降,顯著低于對(duì)照組(P<0.05),14天時(shí),10%春蓼pH值略有上升,與對(duì)照組無(wú)顯著差異,5%春蓼組pH值顯著低于其余兩組(P<0.05);30天時(shí),10%春蓼組pH值顯著高于其余兩組,在60天時(shí),各添加組pH值無(wú)顯著差異,都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

發(fā)酵3天和7天時(shí),添加組乳酸菌數(shù)量都顯著高于對(duì)照組(P<0.05);14天和30天時(shí),各組乳酸菌數(shù)量沒(méi)有顯著差異;60天時(shí),5%春蓼組乳酸菌數(shù)量低于對(duì)照組和10%春蓼組(P<0.05),10%春蓼組乳酸菌數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異;各組乳酸菌數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈緩慢下降的趨勢(shì)。各組酵母菌數(shù)量在3天時(shí)沒(méi)有顯著差異;7天時(shí),10%春蓼組酵母菌數(shù)量顯著高于其余兩組(P<0.05);14天時(shí),添加組酵母菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中,10%春蓼組沒(méi)有檢測(cè)到酵母菌;30天時(shí),各組酵母數(shù)量迅速增高,10%春蓼組酵母菌數(shù)量從0增加到8.18 lg cfu·g-1,添加組酵母菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05);60天時(shí),5%春蓼組酵母菌數(shù)量顯著高于其余兩組(P<0.05)。發(fā)酵3天時(shí),10%春蓼組大腸桿菌數(shù)量顯著高于其余兩組(P<0.05),7天時(shí),10%春蓼組大腸桿菌數(shù)量迅速降低,但與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異,5%春蓼組大腸桿菌數(shù)量顯著低于其余兩組(P<0.05);14天時(shí),添加組大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),5%春蓼組大腸桿菌數(shù)量顯著低于10%春蓼組(P<0.05);發(fā)酵30天后,各組均未檢測(cè)到大腸桿菌。

由表3可知,濕貯玉米中添加春蓼,乳酸和乙酸含量各組之間存在顯著差異(P<0.05)。發(fā)酵3天、14天時(shí),各組乳酸含量沒(méi)有顯著差異,7天、30天和60天時(shí),添加組乳酸含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);發(fā)酵3天、7天時(shí),各組乙酸含量沒(méi)有顯著差異,30天時(shí),5%春蓼組乙酸含量顯著高于其余兩組(P<0.05),對(duì)照組乙酸含量最低,60天時(shí),10%春蓼組顯著高于其余兩組(P<0.05),各組乳酸、乙酸含量均隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì)。

2.3 添加春蓼對(duì)濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

由表4可知,發(fā)酵3天、7天時(shí)各組有氧穩(wěn)定性天數(shù)類(lèi)似,發(fā)酵14天時(shí),添加春蓼組的有氧穩(wěn)定性天數(shù)升高,發(fā)酵30天時(shí),5%春蓼組有氧穩(wěn)定性天數(shù)顯著提升,發(fā)酵60天時(shí),10%春蓼組有氧穩(wěn)定性天數(shù)為各組最佳,達(dá)到7天。

表4 添加春蓼對(duì)濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響Table 4 Effects of Polygonum polygonum on aerobic stability of high moisture corn

2.4 全株春蓼對(duì)青貯30天后濕貯玉米混合青貯抑菌效果的影響

由表5可知,添加大腸桿菌的各組中,只有發(fā)酵72 h時(shí)檢測(cè)到了大腸桿菌,且各添加組大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 青貯30天后全株春蓼添加對(duì)濕貯玉米抑菌效果的影響Table 5 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 30 days of silage

添加金黃色葡萄球菌的各組中,發(fā)酵8 h,24 h和48 h時(shí),各添加組金黃色葡萄球菌數(shù)量都顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中,24 h和48 h時(shí),10%春蓼組金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著低于5%春蓼組(P<0.05),72 h時(shí),各組金黃色葡萄球菌數(shù)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。

添加沙門(mén)氏菌的各組中,在發(fā)酵8 h和72 h時(shí),均未檢測(cè)到沙門(mén)氏菌,24 h時(shí),添加組沒(méi)有檢測(cè)到沙門(mén)氏菌,48 h時(shí),5%春蓼組沙門(mén)氏菌數(shù)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。

2.5 全株春蓼對(duì)青貯60天后濕貯玉米混合青貯抑菌效果的影響

由表6可知,添加大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的各組均未檢測(cè)到菌。

表6 發(fā)酵60天后全株春蓼添加對(duì)濕貯玉米抑菌效果的影響Table 6 Effect of whole plant Polygonum persicaria addition on the bacterial inhibition of high moisture corn after 60 days of silage

添加金黃色葡萄球菌的各組中,10%春蓼組在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)均未檢測(cè)出金黃色葡萄球菌,5%春蓼組在8 h未檢測(cè)到金黃色葡萄球菌,在其他時(shí)間段內(nèi),5%春蓼組金黃色葡萄球菌數(shù)量均低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 春蓼乙酸乙酸萃取液代謝產(chǎn)物

圖1為春蓼萃取液總離子流圖,其中縱坐標(biāo)表示收集存儲(chǔ)離子的電流總強(qiáng)度,橫坐標(biāo)表示離子的生成時(shí)間或連續(xù)掃描的掃描次數(shù),其中,每個(gè)峰的峰面積代表某種代謝產(chǎn)物的濃度,也可以說(shuō)是某種離子的總量。

圖1 春蓼萃取液總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of extract of Polygonum persicaria

由表7可知,春蓼乙酸乙酯萃取液表達(dá)量最高的代謝產(chǎn)物主要為黃酮類(lèi)化合物(金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、槲皮苷和異槲皮苷等物質(zhì)),姜酚類(lèi)化合物(姜酚),兩種酚酸類(lèi)化合物(兒茶素沒(méi)食子酸酯和三羥基苯甲酸)和其他類(lèi)化合物(2,4,6-三氨基甲苯、乙酰酰胺、三羥基苯甲酸、5-戊基間苯二酚、吡唑醚菌酯、瑟丹酸內(nèi)酯和膽堿)。

表7 春蓼乙酸乙酯萃取液中表達(dá)量高的前20個(gè)代謝產(chǎn)物Table 7 The top 20 high-expressed metabolites in the ethyl acetate extract of Polygonum persicaria

3 討論

3.1 全株春蓼添加對(duì)濕貯玉米青貯品質(zhì)的影響

要保證青貯的發(fā)酵品質(zhì),就要形成一個(gè)良好的以乳酸菌為主導(dǎo)的厭氧環(huán)境,而評(píng)判的指標(biāo)主要就是pH值及有機(jī)酸含量。本試驗(yàn)中,發(fā)酵3天時(shí),添加春蓼的pH值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),可能是由于春蓼所含的一些有效成分增加了青貯原料的緩沖能值[29],使得添加組pH值高于對(duì)照組,發(fā)酵7天后,添加組pH值便基本趨于穩(wěn)定且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。乳酸在青貯飼料方面發(fā)揮著重要作用,乳酸含量越高則青貯品質(zhì)越好,本試驗(yàn)中乳酸含量呈先增高后降低的趨勢(shì),這可能與春蓼中的黃酮類(lèi)物質(zhì)有關(guān),前期黃酮類(lèi)物質(zhì)抑制了有害微生物繁殖,促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng),從而產(chǎn)生了大量乳酸,降低了pH值,這與王妍等人[30]的研究相似;由于游離乳酸的積累,pH值迅速下降也會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng),進(jìn)而抑制了青貯中乳酸的產(chǎn)生,致使后期乳酸含量降低[31];添加組在發(fā)酵14天后酵母菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),在30天和60天時(shí),都未檢測(cè)出大腸桿菌,這是由于低pH值的環(huán)境下,大腸桿菌生長(zhǎng)受到抑制;值得注意得是,在發(fā)酵60天時(shí),10%春蓼組乙酸含量顯著高于其余兩組,這可能與蓼屬植物地上部分含有少量甲酸和乙酸有關(guān)[32],這將有效抑制不利微生物生長(zhǎng),提高青貯發(fā)酵品質(zhì),防止青貯飼料腐敗變質(zhì)[33]。

3.2 全株春蓼添加對(duì)濕貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

在對(duì)濕貯玉米中添加春蓼的有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵60天后的10%春蓼組有氧穩(wěn)定性最好,有氧穩(wěn)定性天數(shù)顯著高于其他各組,達(dá)到168 h,從開(kāi)封檢測(cè)結(jié)果可以看出,10%春蓼組在60天時(shí),酵母菌沒(méi)有被檢測(cè)到,乙酸含量顯著高于各組,為0.60 g·kg-1DM,其余兩組在60天乙酸含量降低,而10%春蓼組在60天時(shí)乙酸含量反而升高,由于乙酸可以抑制好氧微生物的活性,提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性,因此10%春蓼組有氧穩(wěn)定性最好[33]。這與嚴(yán)波等人[34]在研究紫花苜蓿、稻秸與干酒糟及其可溶物(Distillers dried grains with solubles,DDGS)混合青貯中發(fā)現(xiàn),添加乙酸青貯飼料有氧穩(wěn)定性提升的結(jié)果相似。并且10%春蓼組相較于其他兩組,含有更多的黃酮類(lèi)化合物,黃酮類(lèi)化合物有較好的抗菌、抗氧化性,抑制細(xì)菌、霉菌的生長(zhǎng),有利于濕貯玉米有氧穩(wěn)定性。李偉等人[35]研究發(fā)現(xiàn)甘草細(xì)胞中提取的黃酮粗提液具有相同功效。因此將春蓼作為青貯添加劑與青貯原料共同發(fā)酵有利于青貯的有氧穩(wěn)定性的提高,但春蓼對(duì)青貯原料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的研究少有報(bào)道,其中的發(fā)酵過(guò)程和代謝物之間的變化還有待進(jìn)一步研究。

3.3 全株春蓼添加對(duì)濕貯玉米抑菌效果的影響

本試驗(yàn)分得的20個(gè)代謝產(chǎn)物中,有10個(gè)為黃酮類(lèi)成分,其很可能是春蓼抑菌抗氧化活性物質(zhì)。春蓼主要檢測(cè)的前20種代謝產(chǎn)物為金絲桃苷、糖苷蘆丁衍生物、槲皮素、山奈酚、槲皮苷和異槲皮苷、姜酚、兒茶素沒(méi)食子酸酯、三羥基苯甲酸等物質(zhì),其中金絲桃苷、糖苷蘆丁衍生物都屬于槲皮素衍生物[36],槲皮素對(duì)于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等有害菌都有顯著抑菌效果[37-38]。而姜酚清除氧自由基能力比維生素E強(qiáng),具有抗氧化、抗炎、抗凝等多種生物活性,還有抗病原微生物、殺菌防腐的功效[39-40]。目前也有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素沒(méi)食子酸酯也具有抑菌、抗炎、抗氧化等功能[41]。試驗(yàn)中,發(fā)酵30天后的青貯飼料各組,在發(fā)酵8 h,24 h和48 h時(shí),均未檢測(cè)到大腸桿菌,各組pH值均低于4.2,大腸桿菌未檢測(cè)到可能與青貯飼料的低pH值有關(guān),也可能與春蓼有效成分有關(guān)。從發(fā)酵30天時(shí)青貯料各項(xiàng)指標(biāo)中可以看出發(fā)酵并未穩(wěn)定,乳酸菌和酵母菌數(shù)量也沒(méi)有保持穩(wěn)定,可能造成發(fā)酵72 h時(shí)飼料環(huán)境中的pH升高,因此飼料各組均檢測(cè)到了大腸桿菌,但各添加組的大腸桿菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組,這可能與添加組中春蓼的有效成分有關(guān)。春蓼中含有多種黃酮類(lèi)化合物,黃酮類(lèi)化合物是蓼屬植物最主要的次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于蓼屬植物中,具有抗菌、抗氧化、清除自由基等作用[42]。其中,抗菌作用是目前國(guó)內(nèi)外主要研究的方向,本次抑菌試驗(yàn)中,添加組有害菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),這與黃酮類(lèi)化合物的抗菌功效有很大的聯(lián)系,宋立立等人[43]研究發(fā)現(xiàn)報(bào)道銀杏葉中的黃酮成分可以有效抑制病原微生物的生長(zhǎng),將其作為飼料添加劑,可以有效提高動(dòng)物生成性能和治療由細(xì)菌引起的疾病,對(duì)產(chǎn)氣型腸桿菌和大腸桿菌均有良好的抑制效果;眾多學(xué)者[44-45]研究表明黃酮類(lèi)化合物中槲皮素抑制沙門(mén)氏菌的能力最強(qiáng),最低抑菌濃度為0.063 mg·mL-1,槲皮素用于抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的濃度為2 mg·mL-1。從青貯飼料抑菌試驗(yàn)結(jié)果看出,10%春蓼處理比5%春蓼處理的金黃色葡萄球菌數(shù)量更低,可能與春蓼添加量有一定關(guān)系。雖然低pH值對(duì)于有害菌的影響是主要的[45],但是當(dāng)對(duì)照組中含有有害菌時(shí),添加組的有害菌數(shù)量總是低于對(duì)照組,這與黃酮類(lèi)化合物的抑菌機(jī)制有很大的關(guān)系。目前對(duì)春蓼的研究較少,其藥理作用機(jī)制尚不明確,故后期應(yīng)以該方面為重點(diǎn),以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該植物提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

10%春蓼添加量顯著改善濕貯玉米發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。春蓼對(duì)三種有害菌均有抑制能力,且10%春蓼添加量對(duì)金黃色葡萄球菌及沙門(mén)氏菌抑制能力較5%添加量更佳。春蓼代謝產(chǎn)物主要含有黃酮類(lèi)、姜酚類(lèi)化合物。