2021—2022年南京市野豬中8種病毒感染情況及PCV2全基因組遺傳進化分析

王怡，李梅榮，李樹博，馮春燕，杜季梅，鄧長林，程王琨，姜平，楊振*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物細菌學重點實驗室/“一帶一路”國際重大跨境動物疫病診斷與免疫專業(yè)科技創(chuàng)新院，江蘇 南京 210095；2.南京市紅山森林動物園，江蘇 南京 210028；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，遼寧 沈陽 110001；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123；5.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

野豬(Susscrofa)是全球分布最廣的哺乳動物物種之一，早在2000年就被我國列為國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的野生動物[1]。野豬與家豬具有密切的親緣關(guān)系，并有可能成為多種重要疾病的潛在宿主[2]。有許多重要動物病毒在野豬中流行，包括豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬細小病毒(PPV)等[3-5]。野豬作為天然宿主可以直接或間接傳播ASFV，是許多國家和地區(qū)引入和暴發(fā)ASFV的重要因素[6]。為控制及阻斷疫情傳播，許多國家都針對野豬制定了病原監(jiān)測和種群管理計劃，包括安裝圍欄限制野豬移動以防止病毒的空間傳播，實施誘捕和狩獵等措施降低野豬密度等[7-8]，但到目前為止，只有2個國家(比利時和捷克)通過主動和被動監(jiān)測重新獲得無ASFV感染狀態(tài)[9]。

近年來，隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變和種群規(guī)模的擴大，我國出現(xiàn)了多種新發(fā)和再發(fā)傳染病，其中非洲豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬流行性腹瀉、偽狂犬病等給養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)。多項研究表明，中國野豬群體中存在多種豬源性疾病的流行。2011年，任煒杰等[10]對中俄邊境24頭野豬的血清樣品檢測發(fā)現(xiàn)，CSFV抗體和PPV抗體呈陽性；在江西省狩獵所得的野豬樣本中利用實時熒光定量PCR方法同時檢測到了PCV1/2/3/4的核酸，表明野豬可感染多種PCVs[11-12]；2018年我國首次報道了野豬非洲豬瘟疫情，2020年在湖北省神農(nóng)架林區(qū)的7頭非正常死亡野豬中檢測到ASFV[13-14]。近年來，由于我國野生動物保護工作不斷加強，野豬的生存環(huán)境得到極大改善，加之其繁殖力強、成活率高，野豬群體數(shù)量逐年上升，局部地區(qū)存在野豬泛濫的情況[15]。因此加強對野豬的疾病監(jiān)測可以提供重要的流行病學信息和疫病預警，以便更好地制定防控措施，切斷野豬和家豬間的疾病傳播。然而，由于采集野豬樣品需要多單位、多部門協(xié)作，因此開展野豬疾病監(jiān)測研究難度大。南京紅山森林動物園野生動物收容救護中心是江蘇省和南京市兩級野生動物收容救護中心，負責全市乃至全省的野生動物收容救護工作。當接到有野豬迷途、受困等情況時，救助中心工作人員將聯(lián)合警方對野豬進行救助。本研究與南京紅山森林動物園野生動物收容救護中心、國內(nèi)動物疫病防控和檢驗檢疫機構(gòu)等多家單位合作，開展了南京市野豬疾病監(jiān)測和流行病學調(diào)查，旨在研究南京市捕獲野豬中ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、FMDV、PCV2和PCV3的感染狀態(tài)和病原分子遺傳特征，擴充我國野豬疫病監(jiān)測數(shù)據(jù)，為制定野豬疫病防控策略提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

QIAamp DNA Mini Kit核酸提取試劑盒購自QIAGEN公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自西安天隆有限公司；CSFV抗體、PEDV IgA抗體和PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司；PRV gB抗體ELISA檢測試劑盒購自BioChek公司；PRRSV抗體和FMDV O型抗體ELISA檢測試劑盒購自MEDIAN公司；FMDV A型抗體和PCV2抗體ELISA檢測試劑盒購自北京金諾公司；ASFV抗體ELISA檢測試劑盒購自INGENASA公司；PCV3抗體ELISA檢測試劑盒購自內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司；2×Probe qPCR Mix和2×SYBR qPCR Mix購自寶生物工程(大連)有限公司；2×TaqMaster Mix和2×Vazyme Lamp Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；2×Phire animal tissue PCR buffer和Phire hot start Ⅱ DNA polymerase購自ThermoFisher公司。

1.2 樣品來源

所有樣品均采集于2021年3月至2022年6月期間在南京市紅山森林動物園野生動物收容救護中心救助的南京地區(qū)野豬，共采集30頭野豬的76份樣品，其中30份全血樣品、30份血清樣品、6份糞便樣品和10份組織樣品(心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織的混合樣品)。每只采樣的野豬都記錄其性別和救助日期等信息。

1.3 樣品處理及保存

全血樣品經(jīng)3 000 r/min離心15 min后分離血清放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；取野豬的組織混合樣品或糞便樣品放入2 mL離心管內(nèi)，加入2顆研磨珠，最后加入PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.0)10倍稀釋，將離心管置于自動研磨儀中以60 Hz研磨3次，每次研磨90 s，然后將組織勻漿凍融3次后在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸提取

利用普通PCR方法進行抗原檢測的樣品DNA使用QIAamp DNA Mini Kit核酸提取試劑盒提??；基于熒光定量PCR(qPCR)方法進行抗原檢測的樣品核酸利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒在全自動核酸提取儀上提取，并置-20 ℃保存。

1.5 引物設(shè)計

引物和探針信息如表1所示。在PCV2的檢測中，引物通過Primer Premier軟件設(shè)計，目標是檢測GenBank上發(fā)表的PCV2序列ORF2基因的保守區(qū)域。所有引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針信息

1.6 核酸檢測

利用普通PCR方法進行PCV2和PCV3檢測。其中PCV3檢測的反應體系包括：模板DNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1.2 μL，2×Phire animal tissue PCR buffer 10 μL，Phire hot start II DNA polymerase 0.4 μL，最后ddH2O補齊至20 μL。擴增程序為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 5 s，68 ℃ 7 s，72 ℃ 15 s，45次循環(huán)；72 ℃ 1 min。PCV2檢測的擴增體系總體積為25 μL，包括：1 μL模板DNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，12.5 μL 2×TaqMaster Mix和9.5 μL ddH2O。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，47 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 5 min。

利用基于TaqMan探針的qPCR方法對CSFV、ASFV、PRV、PRRSV(美洲株)和PEDV進行核酸檢測。采用20 μL反應體系：10 μL 2×Probe PCR Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA或cDNA 2 μL，ddH2O補齊。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火，延伸20 s，45個循環(huán)。

利用SYBR Green qPCR方法對歐洲株P(guān)RRSV進行核酸檢測，采用20 μL反應體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補齊。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火，延伸20 s，45個循環(huán)。

1.7 抗體檢測

使用各病原對應的ELISA商品化檢測試劑盒進行病原抗體檢測，按照試劑盒說明書完成操作步驟和結(jié)果判定。

1.8 全基因組序列擴增

對PCR鑒定結(jié)果為陽性的病料進行PCV2全基因的擴增，PCR反應體系為50 μL，包括：1 μL模板DNA，10 μmol/L上下游引物各2 μL，25 μL 的2×Vazyme Lamp Master Mix和20 μL的ddH2O。反應條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。利用瓊脂糖凝膠回收法純化陽性PCR產(chǎn)物，并送至通用生物有限公司進行測序。

1.9 遺傳進化分析

將獲得的PCV2全基因組核苷酸序列與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的國內(nèi)外家豬和野豬的參考序列，使用Megalign軟件的Clustal W算法進行多序列比較，再在MEGA X軟件中采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置布展值(Bootstrap values)檢驗為1 000次重復。

2 結(jié)果

2.1 核酸檢測情況

對30份血清樣品進行了7種病原的核酸檢測，其中根據(jù)國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃要求，F(xiàn)MDV需在國家參考實驗室進行檢測，所以本試驗未進行FMDV的核酸檢測。30份全血樣品、6份糞便樣品和10份組織樣品只通過傳統(tǒng)PCR方法進行了PCV2和PCV3核酸檢測。

檢測結(jié)果如表2所示，30頭野豬中12頭為PCV3核酸陽性(11頭全血鑒定陽性，1頭組織鑒定陽性)，陽性率為40%。76份樣品中全血樣品檢出率為36.7%(11/30)，血清樣品檢出率為6.7%(2/30)，糞便樣品檢出率為16.7%(1/6)，組織樣品檢出率為10%(1/10)。2頭為PCV2核酸陽性，其中1頭全血鑒定陽性，1頭組織鑒定陽性，陽性率為6.7%，血清、糞便和組織樣品均未檢測到PCV2陽性。另外，血清樣品ASFV、CSFV、PRRSV、PRV和PEDV的qPCR檢測結(jié)果均為陰性。

表2 30頭野豬的潛在攜帶病原核酸檢測結(jié)果

2.2 血清樣品抗體檢測

對30頭野豬的血清樣品進行了8種病原的抗體檢測，結(jié)果顯示其中16頭野豬為PCV3抗體陽性，陽性率為53.3%；9頭野豬為PCV2抗體陽性，陽性率為30%；9頭野豬為PRV gB抗體陽性，陽性率為30%；2頭野豬為FMDV A型抗體陽性，陽性率為6.7%。此外，各有1頭野豬為PRRSV抗體陽性和PEDV抗體陽性，陽性率均為3.3%。所有野豬CSFV和ASFV抗體均為陰性。具體數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 30頭野豬的抗體檢測結(jié)果

2.3 混合感染情況

在野豬中僅檢測到PCV2和PCV3的核酸，但未在同一頭野豬中同時檢測到2種病毒核酸?？贵w檢測結(jié)果顯示，30頭野豬中有20頭至少有1種病原抗體檢測陽性，其中有6頭野豬表現(xiàn)為單一病原抗體陽性；有6頭野豬8種病原的核酸和抗體檢測均為陰性。

2.4 PCV2全基因組遺傳進化分析

共獲得2條PCV2全基因組序列：PCV2/NJ/WB/2022/1和PCV2/NJ/WB/2022/2，均由1 767個核苷酸組成，序列分別來自野豬的全血樣本和組織樣本；通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，獲得序列的核苷酸相似性為99.3%，與參考序列的核苷酸同源性在91.30%～99.4%之間。構(gòu)建的遺傳進化樹如圖1所示，已知目前PCV2毒株分為8個基因亞型(PCV2a～PCV2h)[18]，本研究獲得序列的毒株均屬于2d基因亞型。

注：■為本研究中獲得的序列。

3 討論

本研究采集了南京地區(qū)30頭野豬的樣品進行了8種重要豬病病毒的核酸和抗體監(jiān)測，檢測到PCV2和PCV3的核酸，其中PCV3核酸檢出率最高，為40%。PCV3在不同國家野豬中的陽性率存在差異，在德國、意大利和巴西等歐洲國家野豬中的陽性率在29%～71%之間，而在韓國野豬中的檢出率相對較低，為5.6%[19-22]。PCV3在國內(nèi)家豬群體中也存在廣泛流行，劉相聰?shù)萚23]從華南地區(qū)的177家規(guī)?；i場采集病料檢測PCV3，其中樣品陽性率為29.04%，豬場陽性率為44.63%；趙宇等[24]在河南7個地市的規(guī)模化豬場均檢測出PCV3，陽性率為30.26%。本研究中的野豬主要捕獲于南京市城區(qū)，PCV3核酸檢出率為40%，與王小泉等[25]在江蘇省規(guī)模化豬場采集組織樣品的PCV3陽性率(37.17%)相近，但高于Hu等[12]在江西省狩獵捕獲野豬的PCV3陽性率(5.8%)[12]。雖然PCV3的傳播途徑尚未完全了解，但在城市區(qū)域活動的野豬可能會接觸更多的垃圾(如廚余垃圾)、環(huán)境污染物和家畜農(nóng)貿(mào)市場等，因此極有可能是這些野豬感染該病毒的原因。此外，本研究結(jié)果表明南京地區(qū)野豬中還存在PCV2流行，從野豬PCV2陽性樣品獲得了2條PCV2全基因組序列。PCV2毒株分為2a～2h共8種基因亞型，自2013年后中國主要流行的PCV2基因亞型由2b轉(zhuǎn)變?yōu)?d[26]。本研究在野豬中獲得的PCV2全基因組序列均屬于2d亞型，提示南京市野豬群體流行的PCV2d基因亞型與我國家豬中流行的主要基因亞型一致，進一步證明了PCV2d基因型在我國的廣泛流行。意大利、葡萄牙、羅馬尼亞、烏拉圭、馬來西亞、韓國、波蘭等多個國家均有報道PCV2在野豬中存在，主要流行亞型為PCV2a、PCV2d和PCV2b。此外，馬來西亞和韓國均發(fā)現(xiàn)野豬中存在PCV2b到PCV2d的基因亞型轉(zhuǎn)變，與家豬中的變化趨勢一致[27-28]，且從野豬中獲得的分離毒株序列與家豬具有高度同源性。以上證據(jù)均表明野豬與家豬之間可能存在流行病學關(guān)聯(lián)。

由于從活體野豬身上獲取血清樣本較為困難，當前有關(guān)野豬疾病血清學監(jiān)測的研究較少。Wang等[29]基于間接ELISA方法對國內(nèi)60頭野豬進行了PCV3抗體檢測，結(jié)果顯示陽性率為18.3%；本研究在16頭野豬中檢測到PCV3 Cap蛋白IgG抗體，陽性率為53.3%，高于先前的研究，表明南京地區(qū)野豬中的PCV3感染暴露較高。此外，本研究在9頭野豬中檢測到PCV2抗體，其中1頭野豬的組織樣品同時表現(xiàn)為PCV2核酸陽性。PCV2 IgG抗體一般在病原感染后第15天開始檢測到[30]，此時機體還處于帶毒狀態(tài)，因此可以同時檢測核酸和抗體。有研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染不會引起野豬相關(guān)臨床癥狀和組織病變[31]，但本研究未對野豬的組織樣品進行病理檢查，因此還需要進一步的試驗評估野豬中PCV2感染與致病性的關(guān)系。

本次調(diào)查還在野豬中檢測到PRV抗體，陽性率與PCV2相同，為30%。PRV包含11種糖蛋白，其中g(shù)B蛋白是主要的保護性抗原，能刺激豬產(chǎn)生中和抗體和病毒特異性細胞免疫應答；gE蛋白是毒力和病毒傳播的重要抗原，gE基因缺失疫苗在預防PRV方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而自2011年底以來，變異型PRV在我國接種疫苗的豬場中廣泛流行，因此可以利用gE抗體檢測來區(qū)分野毒株和疫苗株感染[32]。我們在PRV血清陽性野豬中檢測到的均為gB抗體，gE抗體為陰性，說明野豬可能曾感染過PRV gE基因缺失疫苗株，提示PRV疫苗毒株有從家豬或環(huán)境中傳播至野豬的風險。野豬感染PRV疫苗毒后潛在風險尚不清楚，如果PRV疫苗毒在野豬種群中傳播，可能會對其他野生動物或家畜造成潛在健康風險。因此，未來PRV減毒活疫苗的研發(fā)和使用應該考慮該疫苗對野生動物及其生存環(huán)境帶來的直接或者間接影響。

FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3這7種血清型，目前主要在非洲、亞洲國家或地區(qū)呈散發(fā)或地方性流行，其中O、A、C和Asia1型是亞洲地區(qū)流行的主要血清型[33]。有研究利用從家豬中分離到的毒株對野豬進行試驗感染，結(jié)果顯示野豬對FMDV高度敏感，排毒量與家豬相似，可將病毒傳播給其他野豬和家豬，存在疾病傳播風險；此外與家豬相比，野豬表現(xiàn)出延遲或較弱的臨床癥狀，并且病變難以識別，因此早期監(jiān)測計劃對于控制疫情傳播尤為重要[34-35]。本研究中有2頭野豬表現(xiàn)為FMDV抗體陽性且血清型均為A型，說明該地區(qū)野豬中也存在FMDV暴露感染。然而，近年來國內(nèi)A型田間疫情逐年減少，口蹄疫疫情以O(shè)型為主[36]。根據(jù)2022年國家動物疫病免疫技術(shù)指南可知，我國連續(xù)3年未發(fā)生A型口蹄疫疫情，但2021年在邊境地區(qū)監(jiān)測到A型的境外分支病毒，提示境外毒株傳入我國的風險依然存在。本次調(diào)查在野豬中檢測到的均為A型抗體，提示野豬可能感染了A型FMDV毒株，野豬可能是我國A型FMDV的潛在儲存宿主，存在A型FMDV從野豬到家豬傳播風險。

PEDV引起的豬流行性腹瀉是對全球養(yǎng)豬業(yè)最具破壞性的疾病之一，臨床癥狀包括嚴重的腹瀉、脫水和嘔吐，會引起哺乳仔豬高死亡率[37]。2016年，Lee等[38]首次在韓國的野豬糞便樣本中檢測到PEDV核酸，說明PEDV可以在野豬中傳播。在本研究中，只有1頭野豬的體內(nèi)檢測出PEDV抗體，表明該地區(qū)野豬曾感染過PEDV，但感染率相對較低。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是以妊娠母豬繁殖障礙和呼吸道疾病為特征的重要豬源性疾病。西班牙、德國和日本等國家檢測野豬群體的PRRSV抗體陽性率和病毒載量較低[39-41]；然而，研究表明PRRSV陽性野豬傾向于出現(xiàn)在家豬密度較高的地區(qū)，盡管這種相關(guān)性并沒有統(tǒng)計學意義[40]；此外，韓國野豬中的PRRSV核苷酸序列與家豬序列相似。這些發(fā)現(xiàn)表明家豬和野豬之間可能存在PRRSV傳播[42]。本研究僅在1頭野豬體內(nèi)檢測到PRRSV抗體，說明南京地區(qū)野豬PRRSV感染率較低，但考慮到樣本數(shù)量和研究區(qū)域的限制，未來還需進一步研究來評估中國野豬中PRRSV的流行情況。本次調(diào)查在30頭救助野豬中未檢測到ASFV和CSFV的核酸和抗體，暫未發(fā)現(xiàn)南京地區(qū)野豬中ASFV和CSFV流行的證據(jù)。

本次研究結(jié)果提示，野豬可以攜帶并傳播多種病原，野豬與家豬之間也存在潛在的互動風險，因此需要制定相關(guān)的生物安全措施以控制疫病傳播，保障畜禽健康養(yǎng)殖。一方面，考慮到許多豬場建設(shè)在城市郊區(qū)或農(nóng)村，與野豬接觸的風險較大，因此可以安裝監(jiān)控和圍欄等設(shè)備防止野豬與家豬互動；另一方面可以考慮對野豬群體進行重要病原的免疫。目前對野生動物進行疫苗免疫已經(jīng)在多個物種中得到了成功實踐，例如歐洲多個國家已經(jīng)利用口服疫苗在野生動物(包括狐貍和浣熊犬等)中成功控制住了狂犬病[43]。疫苗可以有效控制疾病在野生動物與家畜之間的傳播，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生。然而，野生動物疫苗的應用面臨著多方面的挑戰(zhàn)。首先，疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)成本較高，限制了其大規(guī)模應用；其次，野生動物種群數(shù)量和分布范圍廣泛，疫苗的投放和管理也面臨一定困難；此外，疫苗應用可能會對一些野生動物種群帶來潛在的風險和不確定性。因此未來需要在國內(nèi)各省份定期開展野豬疫病監(jiān)測計劃，了解野豬群體中的病原流行情況，以便及時制定相應的防控策略。

綜上，本文通過對南京地區(qū)野豬進行重要動物病原的分子生物學和血清學篩查，證明了野豬群體中感染過多種病毒，包括PCV2、PCV3、PRV、PEDV和PRRSV。野豬是多種重大動物傳染病潛在的傳播媒介，其種群在國內(nèi)多個省市均有分布。因此，有針對性地制定和實施野豬疾病監(jiān)測網(wǎng)絡，對于家豬疾病預警、保障生豬養(yǎng)殖和維護公共衛(wèi)生具有重要意義。