鴨坦布蘇病毒prM蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位鑒定

劉亞林，梁真潔，楊興淼，曹瑞兵

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒(duck Tem-busu virus，DTMUV)引起的一種以商品蛋鴨、肉種鴨采食量、產(chǎn)蛋量驟然大幅下降為主要臨床特征，以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病。DTMUV可感染不同日齡鴨，患病鴨還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，如共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等[1-2]。2010年我國(guó)首次暴發(fā)鴨坦布蘇病毒病，其感染率可高達(dá)100%，死亡率可達(dá)10%～30%。該病可危害鴨、番鴨、鵝、蛋雞、鴿、麻雀等多種禽類(lèi)，給我國(guó)禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害[3-4]。DTMUV屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群。病毒粒子呈球形，病毒基因組為單股正鏈RNA，一個(gè)ORF編碼的前體蛋白經(jīng)病毒和宿主蛋白酶水解后形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和囊膜蛋白(E)及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[5]。其中prM 蛋白含167個(gè)氨基酸，主要存在于感染細(xì)胞內(nèi)未成熟的病毒粒子中，可被細(xì)胞中的弗林蛋白酶切割成pr片段(92 aa)和M蛋白(75 aa)，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的裝備過(guò)程中，prM 參與病毒囊膜的組成，對(duì)病毒復(fù)制及維持空間結(jié)構(gòu)起重要作用[6]。

目前針對(duì)鴨坦布蘇病毒prM蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究較少。本試驗(yàn)首先利用DNASTAR系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，DTMUV XZ2012株prM蛋白前153個(gè)氨基酸抗原性及疏水性較好，故將該基因片段克隆到表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并鑒定，然后以純化后的重組prM蛋白做免疫原免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，成功篩選獲得了2株穩(wěn)定分泌抗DTMUV-prM的單克隆抗體，確定了單抗識(shí)別的抗原表位區(qū)域，為今后研究鴨坦布蘇病毒prM蛋白結(jié)構(gòu)、功能及病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

鴨坦布蘇病毒XZ2012株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。pET-28a(+)質(zhì)粒、pET-32a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞及SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠和ICR雌性小鼠(5～6周齡)購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

高保真酶2×PrimeSTAR Max Premix購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；180 kDa Prestained Protein Marker購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗鼠IgG、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Proteintech生物科技有限公司；TanonTMHigh-sig ECL Western blot底物試劑盒購(gòu)自天能科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、細(xì)胞融合劑PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DTMUV XZ2012(GenBank：KM188953.1)毒株的prM基因序列設(shè)計(jì)引物，prM-F：5′-GCGGATCCATGCTGAAGCTTGGAA-ATTATAA-3′，含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)；prM-R：5′-TGCTCGAGTATCTTTTGGCTTCTCGTCG-3′，含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，用于擴(kuò)增prM基因，目的基因大小為459 bp。以提取的DTMUV XZ2012株基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增prM基因。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將目的片段和pET-28a(+)載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，細(xì)菌經(jīng)抗性單克隆培養(yǎng)、PCR和雙酶切鑒定，正確后送通用生物系統(tǒng)公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a-prM，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 prM蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-prM轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)中，置于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于37 ℃、200 r/min搖床誘導(dǎo)表達(dá)4 h。將誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行超聲波破碎，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達(dá)形式。用His鎳柱純化目的蛋白，利用BCA法測(cè)定目的蛋白濃度，重組prM蛋白分裝后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組蛋白prM單克隆抗體制備

1.4.1 動(dòng)物免疫

取5只5～6周齡雌性BALB/c小鼠，將純化的重組prM蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化，通過(guò)皮下多點(diǎn)注射方式免疫小鼠，60 μg/只。二免、三免用弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫間隔2周，第3次免疫后1周對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清，用間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。融合前3 d選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，腹腔注射重組蛋白，60 μg/只。

1.4.2 單克隆抗體制備

加強(qiáng)免疫后3 d，將小鼠安樂(lè)死并分離脾細(xì)胞，在PEG4000作用下與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞按照7∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞鋪至含有HAT選擇培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。細(xì)胞融合7 d后觀察96孔板中細(xì)胞融合情況，取有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μL，用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞需進(jìn)行2～3次亞克隆。將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存于液氮中長(zhǎng)期保存。

1.4.3 間接ELISA檢測(cè)抗體

將重組prM蛋白用碳酸鹽抗原包被液稀釋至2 μg/mL包被酶標(biāo)板，4 ℃包被過(guò)夜，用5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入酶標(biāo)板，同時(shí)將小鼠血清按1∶1 000稀釋設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，于37 ℃反應(yīng)1 h；用PBST洗滌3次，加入100 μL羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1∶6 000稀釋)于37 ℃反應(yīng)1 h；用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL TMB顯色液，于37 ℃避光顯色10 min；加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。為了排除載體自身誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白影響檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)采用pET28a-vp70重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，用制備的抗體孵育進(jìn)行反檢。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(P/N)>2.1判定為陽(yáng)性，其陽(yáng)性孔對(duì)應(yīng)的抗體最大稀釋倍數(shù)即為該抗體的效價(jià)。

1.4.4 小鼠單抗腹水的制備

選取7周齡雌性BALB/c小鼠，先向小鼠腹腔內(nèi)注射500 μL無(wú)菌液體石蠟。7 d后，向小鼠腹腔注射3×106～4×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。5～7 d后，觀察小鼠腹部變大、觸之有波動(dòng)感、行動(dòng)不敏捷、被毛粗糙時(shí)收集腹水，4 000 r/min離心5 min，取中間層，置-80 ℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體分泌穩(wěn)定性及亞型測(cè)定

將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，每隔5代凍存一批細(xì)胞，利用ELISA測(cè)定不同代次細(xì)胞上清液的抗體效價(jià)。使用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒按照說(shuō)明書(shū)方法鑒定單克隆抗體亞型。

1.5.2 Western blot鑒定單抗

分別取DTMUV感染BHK-21細(xì)胞和JEV感染BHK-21細(xì)胞樣品，先進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF膜)上。5%脫脂奶粉封閉，以雜交瘤細(xì)胞上清液作為一抗，進(jìn)行Western blot。以BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照，鑒定prM單克隆抗體反應(yīng)的特異性。

1.5.3 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定單抗

用DTMUV感染BHK-21細(xì)胞，以未感染DTMUV的細(xì)胞作為對(duì)照，培養(yǎng)36 h后用4%多聚甲醛固定，用PBS(pH=7.2)洗滌3次，用0.1%的Triton 100作用15 min；洗滌后每孔加入含有2%牛血清白蛋白(BSA)PBS 200 μL，于37 ℃封閉2 h；洗滌后每孔加入200 μL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于37 ℃反應(yīng)1 h；洗滌后每孔加入200 μL FITC-羊抗鼠IgG(用PBS進(jìn)行1∶200稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h，用PBS重復(fù)洗滌3次，將細(xì)胞板置于熒光顯微鏡下觀察，使用EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)拍攝照片并保存。

1.5.4 微量病毒空斑減少中和試驗(yàn)

將BHK-21細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞孔80%左右時(shí)，將單克隆抗體細(xì)胞上清液在56 ℃水浴滅活處理30 min，用DMEM培養(yǎng)液按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)缓髮⑾♂尦?00 TCID50/mL的病毒液與等量倍比稀釋的單克隆抗體細(xì)胞上清液均勻混合，37 ℃孵育1 h，接種BHK-21細(xì)胞，72 h后觀察空斑形成情況。

1.6 單抗識(shí)別B細(xì)胞抗原表位的鑒定

利用IEDB(http://www.iedb.org/home_v3.php)分析prM蛋白序列抗原特性，預(yù)測(cè)單克隆抗體的B細(xì)胞表位，然后將prM蛋白進(jìn)行逐步截短并克隆至pET-32a(+)載體中。以制備的單克隆抗體3H4和5C10為一抗，通過(guò)Western blot鑒定prM單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位區(qū)域。

1.7 抗原表位氨基酸位點(diǎn)比對(duì)分析

選擇不同來(lái)源的DTMUV 16個(gè)代表毒株的prM基因序列以及同屬黃病毒中的日本腦炎病毒(JEV)、登革熱病毒(DENV)和西尼羅病毒(WNV)的prM基因序列，利用BioEdit軟件比對(duì)prM蛋白氨基酸序列，分析B細(xì)胞抗原表位序列在各毒株中的保守性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增的prM目的基因片段大小為459 bp，與理論值相符(圖1)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-prM進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后的基因片段與目的基因大小一致，基因測(cè)序結(jié)果正確，無(wú)任何突變。

M.DNA Marker；1～4.prM基因PCR產(chǎn)物；5.pET28a-prM 重組質(zhì)粒；6.pET28a-prM 雙酶切產(chǎn)物。

2.2 重組 prM 蛋白表達(dá)與純化

重組菌BL21-prM經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)，在20 kDa大小處有明顯條帶，SDS-PAGE結(jié)果顯示與預(yù)期大小相符，將誘導(dǎo)后的全菌超聲裂解后發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(圖2A)。通過(guò)使用鎳柱親和層析純化，利用不同濃度咪唑洗脫得到單一條帶的重組prM蛋白(圖2B)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.空載體誘導(dǎo)全菌蛋白；2.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)全菌蛋白；3.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后上清液；4.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后沉淀；5～13.純化的重組prM蛋白(5為過(guò)柱前重組prM蛋白，6～10為200 mmol/L咪唑洗脫得到重組prM蛋白，7～13為300 mmol/L咪唑洗脫得到重組prM蛋白)。

2.3 小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定

小鼠第3次免疫后10 d，通過(guò)尾靜脈采血，利用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)(圖3)。與陰性小鼠相比，免疫組的所有小鼠均表現(xiàn)出較高水平的prM蛋白抗體效價(jià)，血清抗體效價(jià)均大于1∶25 600。選取抗體效價(jià)最高的1號(hào)小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞。

圖3 間接ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)

2.4 DTMUV prM單克隆抗體制備及效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗DTMUV prM蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3H4和5C10。將2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代至20代，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液抗體效價(jià)穩(wěn)定(表1)，同時(shí)用2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備小鼠腹水，其中5C10抗體效價(jià)為1∶102 400，3H4抗體效價(jià)為1∶51 200。

表1 雜交瘤細(xì)胞上清液和腹水ELISA抗體效價(jià)測(cè)定

2.5 DTMUV prM單克隆抗體亞型鑒定

單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果表明：3H4和5C10單克隆抗體的重鏈均屬于IgG2b亞類(lèi)，輕鏈均為Kappa型(表2)。

表2 單克隆抗體亞型鑒定

2.6 DTMUV prM單克隆抗體 Western blot 反應(yīng)性鑒定

Western blot鑒定結(jié)果顯示，2株單克隆抗體3H4和5C10均能特異性識(shí)別DTMUV接種BHK-21細(xì)胞中大小約為20 kDa的病毒蛋白，與prM蛋白大小一致(圖4A)，而這2株單克隆抗體均不與JEV接種的BHK-21發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4B)，表明所制備的這2株單克隆抗體均能特異性識(shí)別DTMUV prM蛋白，而與JEV沒(méi)有交叉反應(yīng)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.DTMUV感染的BHK-21細(xì)胞樣品；2、4.正常細(xì)胞對(duì)照；3.JEV感染的BHK-21細(xì)胞樣品。

2.7 DTMUV prM單克隆抗體IFA反應(yīng)特性鑒定

IFA結(jié)果顯示：?jiǎn)慰寺】贵w3H4和5C10均能與DTMUV感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的綠色熒光，陽(yáng)性細(xì)胞中抗體熒光分布在細(xì)胞質(zhì)，與DTMUV prM在細(xì)胞中的表達(dá)和分布一致，而經(jīng)單克隆抗體處理的對(duì)照組BHK-21細(xì)胞均未見(jiàn)特異性熒光(圖5)。表明這2株單克隆抗體均能特異性結(jié)合DTMUV，具有良好的反應(yīng)原性和特異性。

圖5 抗prM蛋白單克隆抗體與DTMUV的IFA反應(yīng)特性鑒定(200×)

2.8 DTMUV prM單克隆抗體病毒中和活性測(cè)定

通過(guò)空斑減少試驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體3H4和5C10的中和活性(圖6)，在等量病毒液中加入不同稀釋度的抗體作用后，細(xì)胞孔中病毒感染空斑個(gè)數(shù)出現(xiàn)變化，意味著病毒的數(shù)量發(fā)生了變化。通過(guò)Reed-Muench法計(jì)算單克隆抗體的中和效價(jià)，3H4和5C10的中和效價(jià)分別為1∶34和1∶11.5，這表明單克隆抗體3H4和5C10具有一定的中和活性。

1～5.單抗細(xì)胞上清液稀釋比例分別為1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋?zhuān)?.DMEM對(duì)照。

2.9 prM蛋白截短體的表達(dá)及B細(xì)胞抗原表位的鑒定

為了探究單克隆抗體3H4和5C10識(shí)別的抗原表位區(qū)域，首先將prM片段截?cái)喾殖?個(gè)片段prM1～81 aa和prM70～153 aa，成功誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)3H4和5C10單克隆抗體Western blot反應(yīng)性鑒定，發(fā)現(xiàn)2株單克隆抗體均與前段prM1～81 aa反應(yīng)。為了進(jìn)一步分析單克隆抗體3H4和5C10識(shí)別的抗原表位，先在后段prM70～153 aa的基礎(chǔ)上逐步向前加10個(gè)氨基酸構(gòu)建出5個(gè)截短體prM60～153 aa、prM50～153 aa、prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa，將以上截短體誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)3H4和5C10單克隆抗體Western blot反應(yīng)性鑒定，同時(shí)設(shè)立空載誘導(dǎo)菌體作為陰性對(duì)照。Western blot反應(yīng)性鑒定結(jié)果顯示(圖7A)，mAb 3H4與重組蛋白prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa有效結(jié)合，但不能與prM50～153 aa和prM60～153 aa蛋白結(jié)合，而mAb 5C10與重組蛋白prM50～153 aa、prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa有效結(jié)合，但不能與prM60～153 aa蛋白結(jié)合。為進(jìn)一步確定表位所在區(qū)域，通過(guò)將前段基因序列進(jìn)行逐步截短，構(gòu)建出截短體prM1～50 aa、prM1～55 aa、prM1～60 aa、prM1～65 aa和prM1～70 aa，Western blot反應(yīng)性鑒定結(jié)果顯示(圖7B)，mAb 3H4可以和重組蛋白prM1～55 aa、prM1～60 aa、prM1～65 aa、prM1～70 aa反應(yīng)，而與重組蛋白prM1～50 aa不反應(yīng)；mAb 5C10可以和prM1～60 aa、prM1～65 aa和prM1～70 aa反應(yīng)，而與重組蛋白prM1～50 aa和prM1～55 aa不反應(yīng)。綜上根據(jù)2次截短體的鑒定結(jié)果，繪制抗原表位鑒定示意圖(圖7C)及簡(jiǎn)化示意圖(圖7D),可以證明mAb 3H4的抗原識(shí)別區(qū)域大概為第40～55位氨基酸,即40DVGLMCQDDITYLCPK55,mAb 5C10的抗原識(shí)別區(qū)域大概為第50～60位氨基酸，即50TYLCPKLEYGY60。

注：A.單抗與截短體蛋白Western blot結(jié)果，其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為 L1截短體，2～6分別為R1～R6截短體，9為L(zhǎng)6截短體，10為L(zhǎng)5截短體，11為L(zhǎng)4截短體，12為L(zhǎng)3截短體，13為L(zhǎng)2截短體，8、14為pET-32a；B.單抗識(shí)別抗原表位鑒定示意及判定結(jié)果，+表示有反應(yīng)，-表示不反應(yīng)。

2.10 DTMUV等黃病毒pr蛋白抗原表位氨基酸位點(diǎn)比對(duì)分析

通過(guò)利用BioEdit軟件比對(duì)DTMUV的不同毒株和黃病毒屬中其他病毒如：JEV、DENV、WNV的pr蛋白氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)：第40～60位氨基酸之間的這2個(gè)抗原表位區(qū)域，在DTMUV不同毒株間無(wú)氨基酸差異，保守性較高；DTMUV與DENV和WNV差異較大，推測(cè)DTMUV的prM蛋白單克隆抗體與其應(yīng)該無(wú)交叉反應(yīng)；DTMUV與JEV存在7個(gè)氨基酸差異，推測(cè)這7個(gè)氨基酸是導(dǎo)致這2株prM蛋白單克隆抗體與JEV無(wú)交叉反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸。

圖8 DTMUV等黃病毒prM蛋白氨基酸序列分析

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本研究成功制備了2株針對(duì)DTMUV-prM的單克隆抗體3H4和5C10，小鼠腹水抗體效價(jià)分別為1∶51 200和1∶10 2400，3H4和5C10單克隆抗體的重鏈均屬于IgG2b亞類(lèi)，輕鏈均為Kappa型；Western blot反應(yīng)性鑒定試驗(yàn)顯示，2株單克隆抗體均能與DTMUV感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，而與JEV沒(méi)有交叉反應(yīng)性，均在20 kDa處出現(xiàn)prM蛋白大小的預(yù)期條帶，這說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的病毒多數(shù)以未成熟病毒粒子的形式存在；IFA反應(yīng)性鑒定試驗(yàn)顯示，2株單克隆抗體均能夠識(shí)別DTMUV感染的BHK-21細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)空斑減少中和試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2株單克隆抗體具有一定的中和活性，證明制備的這2株單抗具有重要應(yīng)用價(jià)值；而且鑒定出這2株單抗針對(duì)prM的不同表位，均分別位于pr部分，其中mAb 3H4的抗原位點(diǎn)識(shí)別區(qū)域?yàn)榈?0～55位氨基酸，mAb 5C10的抗原位點(diǎn)識(shí)別區(qū)域?yàn)榈?0～60位氨基酸，這為后續(xù)建立檢測(cè)方法和研究DTMUV的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

目前，對(duì)DTMUV等一些重要黃病毒的E、NS1、NS5等蛋白進(jìn)行了深入研究[7-11]，然而針對(duì)DTMUV prM蛋白功能的研究還非常有限，僅見(jiàn)Huang等[12]制備了3株針對(duì)prM蛋白的單克隆抗體，且沒(méi)有進(jìn)行中和試驗(yàn)和抗原表位的鑒定。本研究針對(duì)prM蛋白獲得的3H4和5C10單克隆抗體能特異性識(shí)別DTMUV，與JEV無(wú)交叉反應(yīng)。利用DNASTAR軟件對(duì)DTMUV、JEV、WNV、DENV等黃病毒的prM第40～60位抗原表位區(qū)域進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同DTMUV毒株之間在prM這一抗原表位區(qū)域無(wú)差異，保守性較高，而DTMUV與JEV有7個(gè)氨基酸的差異，說(shuō)明JEV這7個(gè)氨基酸對(duì)抗體表位的識(shí)別起著關(guān)鍵作用，與WNV和DENV差異較大。這些結(jié)果提示：針對(duì)DTMUV prM蛋白的單克隆抗體僅能特異性識(shí)別DTMUV，對(duì)于多種黃病毒共存地區(qū)，在黃病毒感染的血清學(xué)研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)建立ELISA檢測(cè)方法提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

黃病毒的prM蛋白被弗林蛋白酶裂解是激活產(chǎn)生成熟的具有感染性病毒粒子的必要條件[13-15]，prM未裂解的病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)使E蛋白不能順利和內(nèi)體膜融合，從而影響病毒基因組的釋放，prM蛋白的裂解程度將影響病毒復(fù)制和毒力。在病毒成熟的過(guò)程中，prM蛋白會(huì)被切割為pr部分和M蛋白，pr部分對(duì)于E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的再加工及E蛋白最后的組裝均起著重要作用[16-17]；M蛋白參與病毒囊膜的構(gòu)成，與插入脂雙層E蛋白的完全疏水C端相互作用，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)E蛋白進(jìn)行折疊、修飾和裝配，可誘生具有輕度中和作用的抗體，與病毒核心組成具有感染性的病毒粒子。本研究發(fā)現(xiàn)3H4和5C10單克隆抗體能特異性識(shí)別DTMUV的pr部分，而且具有一定的病毒中和活性，因?yàn)辄S病毒弗林蛋白酶介導(dǎo)的prM蛋白裂解通常是不完全的，可在細(xì)胞外檢測(cè)到未成熟、部分成熟和成熟病毒顆粒混合物[18-19]，因此單克隆抗體可以和病毒粒子暴露出來(lái)的prM蛋白結(jié)合，起到一定的中和作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針對(duì)DTMUV prM蛋白的單克隆抗體具有中和活性，而prM蛋白誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的功能域，prM蛋白對(duì)病毒入侵、組裝和釋放的影響機(jī)制及prM蛋白與其宿主分子之間的相互作用均有待進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)獲得2株單克隆抗體，為建立DTMUV檢測(cè)方法和研究prM蛋白生物學(xué)功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。