豬流行性腹瀉病毒Nsp6蛋白的分段表達(dá)及多克隆抗體制備

陳東奇，鄭殿重，2，魏志穎，王瑩，李佳璇，崔文，姜艷平，王曉娜，周晗，王麗，喬薪瑗，李一經(jīng)，唐麗杰，單智夫*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所，黑龍江 哈爾濱 150030)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染引起豬的一種急性烈性腸道傳染病。該病呈世界性分布，以腹瀉、脫水、嘔吐為主要臨床特征，?？蓪?dǎo)致仔豬死亡。PEDV感染嚴(yán)重影響動物的生產(chǎn)性能，自2010年以來，在包括中國在內(nèi)的主要養(yǎng)豬國家暴發(fā)和流行，成為最重要的豬病毒性腹瀉病之一，極大地阻礙了全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1]。對于PED的防控，最主要的措施是接種疫苗。然而，由于PEDV亞型多、具有很強(qiáng)的變異性，且存在持續(xù)性感染，接種疫苗并沒有達(dá)到預(yù)期的預(yù)防效果。PEDV的致病機(jī)制復(fù)雜，臨床上目前沒有有效的治療藥物。因此，深入研究PEDV的致病機(jī)制對該病的防控具有重要意義。

細(xì)胞自噬是一種具有多種調(diào)節(jié)功能、可維持真核細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的正常細(xì)胞生理活動。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬與病毒的感染與復(fù)制之間存在著密切的聯(lián)系，如自噬可降解侵染細(xì)胞的病毒，同時病毒可阻礙自噬的發(fā)生，以逃避自噬對其本身復(fù)制的影響，甚至某些病毒會利用自噬體促進(jìn)自我復(fù)制。目前對PEDV感染的致病機(jī)制，尤其是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制仍不十分清楚。Guo等[2]發(fā)現(xiàn)自噬有利于PEDV復(fù)制，并且自噬可能與炎性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，在PEDV感染期間與NF-κB信號通路具有正反饋調(diào)節(jié)作用。用雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬會抑制PEDV的感染，并減輕PEDV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的死亡[3]。Sun等[4]發(fā)現(xiàn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)在PEDV感染期間在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬中發(fā)揮重要作用，并且PERK和IER1通路參與誘導(dǎo)ROS依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬。Lin等[5]篩選出PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白6(Nsp6)可誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，是能夠引起細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白，然而其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵功能域尚未確定。因此，本研究獲得了在大腸桿菌系統(tǒng)中重組表達(dá)的PEDV Nsp6重組蛋白，純化后免疫小鼠制備相應(yīng)的多克隆抗體，用于鑒定Nsp6 分段基因的真核表達(dá)情況，為進(jìn)一步確定Nsp6蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵功能域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4周齡雌性BALB/c小鼠購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動物中心。PEDV毒株CH/HLJ/18(GenBank:MW561264.1)、豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2購自上海信裕生物科技有限公司；鼠抗PEDV-N蛋白單克隆抗體、pMD19-T Simple載體、pSUMO原核表達(dá)載體pCMV-HA真核表達(dá)載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；小鼠抗His標(biāo)簽、HA標(biāo)簽單克隆抗體均購自賽默飛世爾科技公司；HRP/FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；T4 DNA連接酶、dNTP Mixture、DNA Marker 及PageRulerTMPlus預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程(大連)公司；中劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ均購自NEB公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中PEDV Nsp6基因序列(Gene ID：935181)及SMART網(wǎng)站對Nsp6基因功能域的預(yù)測，將Nsp6基因分為Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3段，并使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物對Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R和N3-F/N3-R(見表1)，分別用于PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因的擴(kuò)增。

表1 引物序列

1.3 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

提取感染PEDV 的 IPEC-J2 細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以Nsp6-F/Nsp6-R為引物對，擴(kuò)增PEDV Nsp6基因。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并對回收片段雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)，再利用T4 DNA連接酶在16 ℃下作用14 h，連接到同樣雙酶切處理的pSUMO原核表達(dá)載體上。將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后隨機(jī)挑取單菌落并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。一方面以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定；另一方面進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送吉林庫美有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒命名為pSUMO-Nsp6，菌種命名為pSUMO-Nsp6/Rosetta。

以pSUMO-Nsp6質(zhì)粒為模板，分別以Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R及N3-F/N3-R為引物對，PCR擴(kuò)增PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因。將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T Simple連接，再將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后隨機(jī)挑取單菌落并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。一方面以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定；另一方面進(jìn)行單、雙酶切鑒定，均正確的質(zhì)粒送吉林庫美有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒分別命名為pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3，菌種分別命名為pMD-19T-Nsp6/DH5α、pMD-19T-Nsp6-1/DH5α、pMD-19T-Nsp6-2/DH5α、pMD-19T-Nsp6-3/DH5α。

分別提取pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3及pCMV-HA質(zhì)粒，利用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收目的片段。將膠回收的目的片段與pCMV-HA真核表達(dá)載體連接，并將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)；12 h后隨機(jī)挑取單菌落并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。一方面以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定；另一方面進(jìn)行單、雙酶切鑒定，均正確的質(zhì)粒送吉林庫美有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒分別命名為pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3，菌種分別命名為pCMV-Nsp6/DH5α、pCMV-Nsp6-1/DH5α、pCMV-Nsp6-2/DH5α、pCMV-Nsp6-3/DH5α。

1.4 PEDV Nsp6的原核表達(dá)及鑒定

將重組大腸桿菌pSUMO-Nsp6/Rosetta培養(yǎng)至OD600 nm為0.5時，取1 mL誘導(dǎo)前的菌體和上清液樣品作為對照，其余加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，使IPTG終濃度為1.0 mmol/L，于37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h后，離心收集菌體沉淀重懸并超聲破碎，再次離心后分別收集超聲后的沉淀和上清液，分別加入125 μL 5×SDS，混勻后置于沸水中作用10 min，用于SDS-PAGE和Western blot鑒定。分別配制12%分離膠和5%積層膠，用于SDS-PAGE檢測。點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳，80 V電泳1 h，120 V電泳2 h；電泳結(jié)束，將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，置于室溫染色30 min，經(jīng)脫色液脫色后，觀察蛋白表達(dá)情況。用同樣方法將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)印至0.2 μm PVDF膜，在100 V電壓下濕轉(zhuǎn)1.5 h；放入5%脫脂乳在室溫條件下封閉2 h后，利用 1×PBST反復(fù)清洗PEDV膜并加入小鼠抗His標(biāo)簽的單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗，依次經(jīng)室溫孵育1 h后進(jìn)行ECL顯色。

1.5 真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與蛋白表達(dá)和鑒定

使用Promega中劑量質(zhì)粒提取試劑盒制備無內(nèi)毒素質(zhì)粒pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3備用，將IPEC-J2細(xì)胞鋪至24孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/孔，待細(xì)胞長成單層后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。向無菌EP管中依次加入50 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)液、轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000(LipofectamineTM3000 Transfection Reagent，Thermo，L3000001)3 μL及去內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒1 μg，輕柔混勻，室溫作用5 min；向EP管中加入P3000 (LipofectamineTM3000 Transfection Reagent，Thermo，L3000001)2 μL，輕柔混勻，室溫作用20 min；清洗IPEC-J2細(xì)胞單層，每孔加入150 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液，并向孔板中均勻滴加轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染 24 h收集細(xì)胞，再通過以鼠抗HA標(biāo)簽單抗為一抗的免疫熒光法(IFA)和以小鼠抗Nsp6多抗為一抗的Western blot檢測法來判定Nsp6及截短蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.6 PEDV Nsp6蛋白的純化及多克隆抗體的制備

取200 mL誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌pSUMO-Nsp6/Rosetta菌液，按照1.4所述方法制備蛋白樣并進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后，將凝膠放入提前配制好的低溫KCl溶液中染色10 s，使用刀片切下白色的目的帶并將其放入含2 mL電泳緩沖液的透析袋中浸沒；正向100 V電泳2 h后，再反向電泳10 min，使蛋白從膠中析出；取出剩余膠條，將透析袋浸沒于1×PBS中，4 ℃平衡12 h；收集透析袋中溶液獲得純化的目的蛋白。

每100 μg純化的PEDV Nsp6蛋白與100 μL弗氏完全佐劑混合，充分乳化后分別在第0、7和14天按每只50、50和100 μg的劑量腹腔注射免疫4周齡BALB/c小鼠。第3次免疫完成后7 d，采集小鼠血清，并采用間接ELISA方法測定血清抗體效價。以PEDV CH/HLJ/18株細(xì)胞培養(yǎng)毒包被酶標(biāo)板，封閉后，按照1∶20、1∶40、1∶80……1∶20 480倍比稀釋待檢血清并孵育，再添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，加入顯色液作用后終止反應(yīng)，并用全波長酶標(biāo)儀讀取各孔OD450 nm值。不同稀釋度血清與陰性對照OD值比值(P/N)≥2的最大稀釋度判定為血清抗體的效價。

1.7 鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗體的特異性檢測

通過Western blot首先驗(yàn)證鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗體與Nsp6蛋白的結(jié)合情況。先將純化的Nsp6蛋白樣轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入1∶200稀釋的多克隆抗體孵育后再加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG作為二抗，最后進(jìn)行ECL顯色。為檢測多克隆抗體與PEDV培養(yǎng)物結(jié)合的情況，將PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物及IPEC-J2細(xì)胞蛋白樣轉(zhuǎn)印至PVDF膜，按1∶200加入稀釋后的多克隆抗體孵育，再加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG作為二抗，最后進(jìn)行ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定

提取PEDV的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，擴(kuò)增Nsp6基因片段并將其構(gòu)建到重組質(zhì)粒pSUMO-Nsp6，經(jīng)過PCR鑒定，可獲得大小為840 bp的目的條帶(圖1A)。再利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，可以獲得大小約為5 598 bp的載體片段及大小約為840 bp的目的條帶(圖1B)。

M1.DNA Marker DL2000；1.pSUMO-Nsp6 PCR鑒定結(jié)果；2.陰性對照；M2.DNA Marker DL8000；3.pSUMO-Nsp6 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。

以pSUMO-Nsp6質(zhì)粒為模板，利用EcoRⅠ及XhoⅠ切割下Nsp6并連接至pCMV-HA真核表達(dá)載體上，獲得重組質(zhì)粒pCMV-Nsp6。根據(jù)SMART網(wǎng)站對Nsp6功能域的預(yù)測，將Nsp6基因分為3段，分別連接到pCMV-HA真核表達(dá)載體上，構(gòu)建出pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3三種重組質(zhì)粒，并進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定，獲得長度分別為840、258、210 和402 bp的目的片段(圖2A)；再次經(jīng)過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單、雙酶切鑒定后獲得相應(yīng)大小的目的片段(圖2B)。

M1.DNA Marker DL2000；1.陰性對照；2.pCMV-Nsp6 PCR鑒定；3.pCMV-Nsp6-1 PCR鑒定；4.pCMV-Nsp6-2 PCR鑒定；5.pCMV-Nsp6-3 PCR鑒定；M2.DNA Marker DL8000；6.pCMV-Nsp6 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；7.pCMV-Nsp6 EcoRⅠ單酶切鑒定；8.pCMV-Nsp6 XhoⅠ單酶切鑒定；9.pCMV-Nsp6-1 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；10.pCMV-Nsp6-1 EcoRⅠ單酶切鑒定；11.pCMV-Nsp6-1 XhoⅠ單酶切鑒定；12.pCMV-Nsp6-2 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；13.pCMV-Nsp6-2 EcoRⅠ單酶切鑒定；14.pCMV-Nsp6-2 XhoⅠ單酶切鑒定；15.pCMV-Nsp6-3 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；16.pCMV-Nsp6-3 EcoRⅠ單酶切鑒定；17.pCMV-Nsp6-3 XhoⅠ單酶切鑒定。

2.2 Nsp6蛋白原核表達(dá)及純化鑒定

將鑒定正確的重組菌pSUMO-Nsp6/Rosetta進(jìn)行大量培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析后結(jié)果如圖3A所示，誘導(dǎo)后菌體和超聲后菌體沉淀及上清液中，在47 kDa處可見目的蛋白表達(dá)條帶。以帶His標(biāo)簽的單克隆抗體為一抗通過Western blot對其進(jìn)一步鑒定，結(jié)果表明可在正確位置出現(xiàn)特異性條帶(圖3B)。

M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)后上清液；2.誘導(dǎo)12 h菌體；3.誘導(dǎo)12 h超聲后沉淀，4.誘導(dǎo)12 h超聲后上清液；5.誘導(dǎo)前菌體沉淀；6～7.純化的Nsp6蛋白；8.空載體對照。

2.3 鼠抗Nsp6多克隆抗體的鑒定及效價的測定

將純化的Nsp6蛋白免疫小鼠，3次免疫后收集小鼠血清。為了驗(yàn)證所制多抗是否能夠與Nsp6蛋白相結(jié)合，利用Western blot法分別檢測含有SUMO標(biāo)簽的Nsp6蛋白及PEDV病毒培養(yǎng)物中的Nsp6蛋白與制備的鼠抗PEDV Nsp6多克隆抗體的結(jié)合情況，結(jié)果如圖4所示，分別檢測到約為47 kDa大小的含SUMO標(biāo)簽的Nsp6及約為32 kDa大小的PEDV Nsp6 蛋白條帶，說明所制多抗能夠與含SUMO標(biāo)簽的Nsp6蛋白和PEDV的Nsp6蛋白相結(jié)合。利用間接ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價，結(jié)果如圖5所示，P/N≥2時，血清最大稀釋比例為 1∶10 240，即制備的鼠抗Nsp6多克隆抗體的效價為1∶10 240。

M.蛋白Marker；1.純化的Nsp6蛋白(含SUMO標(biāo)簽)；2.空白細(xì)胞對照；3.PEDV培養(yǎng)物中Nsp6蛋白。

圖5 間接ELISA方法檢測鼠抗Nsp6多克隆抗體效價

2.4 Nsp6截短片段的真核表達(dá)及鑒定

為確定連接真核表達(dá)載體的Nsp-6及其截短蛋白在IPEC-J2細(xì)胞中的表達(dá)情況，首先利用IFA檢測Nsp6及各截短片段轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6A所示。以鼠抗HA標(biāo)簽抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗，轉(zhuǎn)染后4種質(zhì)粒均可在IPEC-J2細(xì)胞中檢測到綠色熒光，表明目的蛋白獲得表達(dá)。再利用Western blot檢測pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3在IPEC-J2細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖6B所示。在鼠抗Nsp6多克隆抗體的作用下，分別在32、10.6、8.7和15 kDa的位置檢出符合預(yù)期大小的蛋白條帶，表明4種蛋白在IPEC-J2細(xì)胞中均獲得表達(dá)。

M.蛋白Marker；1.Nsp6；2、6.細(xì)胞對照；3.Nsp6-1；4.Nsp6-2；5.Nsp6-3。

3 討論

PEDV是具有囊膜的單鏈正向RNA病毒，其RNA基因組大小約為28 kb[6]。PEDV基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，以及16種非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp1～Nsp16)和輔助蛋白ORF3[7]。非結(jié)構(gòu)蛋白是冠狀病毒復(fù)制和形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(RTC)以及逃避免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵要素。通過劫持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，Nsps幫助病毒建立RTC[8]。目前對于與PEDV同屬冠狀病毒成員SARS-CoV2的研究表明，Nsp6蛋白也能夠引起細(xì)胞自噬[9]。Cottam 等[10]發(fā)現(xiàn)Nsp6可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成自噬體。通過突變Nsp6可以導(dǎo)致SARS-CoV-2的毒性降低，從而影響病毒的致病性[11]。對以傳染性支氣管炎病毒為代表的禽冠狀病毒研究也證明了Nsp6損害了由饑餓誘導(dǎo)的自噬溶酶體的形成[12]，進(jìn)一步證明了Nsp6蛋白對自噬的復(fù)雜調(diào)節(jié)作用。Nsp6、Nsp1及Nsp12蛋白具有干擾素拮抗作用[13]。此外，Nsp6能夠與TANK激酶1(TBK1)結(jié)合并在不影響TBK1的磷酸化的基礎(chǔ)上抑制IRF3的磷酸化，從而減少Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[14]。Nsp6和Nsp13能夠通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1和2(STAT1和STAT2)的磷酸化進(jìn)而抑制干擾素信號的傳導(dǎo)[15]。

Nsp6 在PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞的過程中也對誘發(fā)細(xì)胞自噬產(chǎn)生重要的作用[4]，然而目前針對Nsp6蛋白引起細(xì)胞自噬產(chǎn)生的具體功能域研究則鮮有報道。為進(jìn)一步確定Nsp6蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬產(chǎn)生的關(guān)鍵功能域，本試驗(yàn)通過SMART網(wǎng)站對Nsp6蛋白的潛在結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，評估了蛋白可能的跨膜區(qū)域。在盡量不破壞其原有的結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上，將Nsp6基因分段為3段，分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞中表達(dá)。

為確定Nsp6及其分段基因的真核表達(dá)情況，本試驗(yàn)構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pSUMO-Nsp6，并將其在大腸桿菌中原核表達(dá)，獲得的蛋白用于制備抗Nsp6 蛋白的多克隆抗體。Western blot結(jié)果表明，該抗體既可以與含SUMO標(biāo)簽的Nsp6原核表達(dá)蛋白結(jié)合，又可以與PEDV的天然Nsp6蛋白相結(jié)合，說明該抗體能夠用于識別PEDV，且通過Western blot確定了Nsp6及其分段基因在IPEC-J2細(xì)胞中均得到了表達(dá)。

總之，本文為進(jìn)一步確定Nsp6蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵功能域做好了鋪墊，為闡明PEDV在感染宿主上皮細(xì)胞IPEC-J2過程中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，對深入了解PEDV的致病機(jī)理提供重要線索，也為研究PEDV的抗病毒藥物提供重要的靶點(diǎn)。