豬圓環(huán)病毒2型ORF1部分位點(diǎn)突變對(duì)病毒復(fù)制能力的影響

李荷然，肖琦，溫立斌，朱雪蛟，芮榮，何孔旺*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210014)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是一種無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，可通過(guò)口鼻黏膜直接或間接通過(guò)接觸糞、尿或病豬等發(fā)生水平傳播，也可以通過(guò)胎盤垂直傳播[1]，是臨床上引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病因[2-5]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。PCV2有2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(ORF)：編碼衣殼蛋白(Cap)的ORF2和編碼復(fù)制相關(guān)蛋白的ORF1。PCV2 ORF1所表達(dá)的Rep蛋白及經(jīng)過(guò)剪切的Rep′蛋白對(duì)病毒DNA的復(fù)制至關(guān)重要[8-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期在探索PCV2 Rep在體外對(duì)PK-15細(xì)胞影響的過(guò)程中，構(gòu)建2～6 aa和17～21 aa點(diǎn)突變的雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，將PCV2 Rep某些位點(diǎn)上的氨基酸單個(gè)或多個(gè)突變?yōu)楸彼岷驪CV2點(diǎn)突變病毒拯救失敗。為了找到突變后不影響病毒拯救的位點(diǎn)，本研究通過(guò)構(gòu)建PCV2 ORF1不同位點(diǎn)突變的雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行病毒拯救，使用熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)PCV2點(diǎn)突變株的復(fù)制能力，為探究Rep蛋白影響PCV2復(fù)制的關(guān)鍵作用位點(diǎn)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和主要試劑

PK-15細(xì)胞、PCV2d毒株、pBluescript Ⅱ SK(+)載體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

胎牛血清(FBS)、高糖 DMEM、胰酶，購(gòu)自中國(guó)Gibco公司；GreenTaqMix、2×Phanta Max Master Mix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；Uniclone One Step Seamless Cloning Kit，購(gòu)自北京金沙生物科技有限公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PCV2d的基因序列及無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)PCV2 Rep不同位點(diǎn)氨基酸點(diǎn)突變?yōu)楸彼崴璧囊?。?gòu)建PCV2及PCV2點(diǎn)突變株雙拷貝所需的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 構(gòu)建PCV2點(diǎn)突變單拷貝感染性克隆質(zhì)粒

以pSK載體為模板，XbaⅠ和BamHⅠ為酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，雙酶切后進(jìn)行膠回收。以PCV2環(huán)狀病毒為模板，使用XbaⅠ酶對(duì)其預(yù)線化。使用含有上游載體重疊區(qū)域、酶切位點(diǎn)與PCV2正向特異性擴(kuò)增序列的引物2-Uni-F1，與包含目的堿基突變的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得插入片段1；使用包含目的堿基突變的上游引物，與含有下游載體重疊區(qū)域、酶切位點(diǎn)與反向特異性擴(kuò)增序列的引物2-Uni-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得插入片段2。按照無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)配置體系，將載體、插入片段1和插入片段2進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)，挑菌搖菌后使用載體通用引物(M13-F和M13-R)進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇重組成功的菌株送測(cè)序，測(cè)序正確的菌株搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測(cè)量濃度后保存?zhèn)溆谩?/p>

M.DL2000 Marker；1.PCV2 點(diǎn)突變單拷貝感染性克隆質(zhì)粒。

1.4 構(gòu)建PCV2及PCV2點(diǎn)突變雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒

以pSK載體為模板，XbaⅠ和BamHⅠ為酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，雙酶切后進(jìn)行膠回收。以PCV2環(huán)狀病毒或PCV2點(diǎn)突變單拷貝質(zhì)粒為模板，使用XbaⅠ酶對(duì)其預(yù)線化。使用2-Uni-F1和2-Uni-R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，插入片段3；使用在5′端插入了與片段3的3′端序列重復(fù)的2-Uni-F2，和2-Uni-R2一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得插入片段4。按照無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)配置體系，將載體、插入片段3和插入片段4進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)入Trans5α，挑菌搖菌后使用630-F和630-R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，將在630 bp處有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果正確則說(shuō)明PCV2雙拷貝感染性克隆質(zhì)?；騊CV2點(diǎn)突變雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的PCV2雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒命名為pSK-PCV2，根據(jù)不同的突變位點(diǎn)將PCV2點(diǎn)突變雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒分別命名為pSK-3aa、pSK-5aa、pSK-2-4aa、pSK-4-6aa、pSK-3-6aa、pSK-2-6aa、pSK-17aa、pSK-18aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa、pSK-17-19aa和pSK-17-21aa。

1.5 感染性克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

將無(wú)PCV2污染的PK-15細(xì)胞鋪于T25細(xì)胞瓶中，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層。按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)分別將pSK-PCV2、pSK-3aa、pSK-5aa、pSK-2-4aa、pSK-4-6aa、pSK-3-6aa、pSK-2-6aa、pSK-17aa、pSK-18aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa、pSK-17-19aa、pSK-17-21aa以及空載體pSK轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞并記錄為第0代，連續(xù)帶毒傳代，收取上清液使用熒光定量PCR的方法檢測(cè)Ct值。若Ct值無(wú)明顯變化，則吸取1 mL收取的上清液接毒無(wú)PCV2污染的PK-15細(xì)胞盲傳6代后再進(jìn)行檢測(cè)；若Ct值持續(xù)升高則停止傳代。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2點(diǎn)突變單拷貝感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建的所有PCV2點(diǎn)突變單拷貝感染性克隆質(zhì)粒無(wú)縫克隆后，挑菌使用M13通用引物進(jìn)行菌液PCR，陽(yáng)性菌均應(yīng)得到大小為1 964 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示相關(guān)位點(diǎn)突變成功，說(shuō)明點(diǎn)突變單拷貝感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 PCV2 ORF1部分位點(diǎn)突變

M.DL2000 Marker；1.PCV2雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒。

2.2 PCV2及PCV2點(diǎn)突變雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建

以PCV2雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建為例。pSK載體、包含pSK載體上游重疊區(qū)域的PCV2全長(zhǎng)或點(diǎn)突變PCV2全長(zhǎng)的片段3，及包含pSK載體下游重疊區(qū)域的PCV2全長(zhǎng)或點(diǎn)突變PCV2全長(zhǎng)的片段4進(jìn)行無(wú)縫克隆后挑菌；使用引物630-F和630-R進(jìn)行菌液PCR，若在630 bp處有明顯的條帶，判定為陽(yáng)性(圖3)，測(cè)序結(jié)果正確，說(shuō)明雙拷貝正確連接，PCV2雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 3 aa、5 aa和18 aa點(diǎn)突變后PCV2復(fù)制能力

pSK-PCV2、pSK-3aa、pSK-5aa和pSK-18aa轉(zhuǎn)染后傳至第3代，用收獲的上清液接毒無(wú)PCV2污染的PK-15細(xì)胞并盲傳6代，吸出200 μL收獲的上清液用于病毒DNA提取，并使用PCV2 ORF2檢測(cè)引物進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)Ct值。若模板濃度太高，將DNA稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，3 aa點(diǎn)突變株、5 aa點(diǎn)突變株和18 aa點(diǎn)突變株Ct值與PCV2原毒株相比均有降低，說(shuō)明點(diǎn)突變后PCV2復(fù)制能力增強(qiáng)(表2)。熔解曲線顯示PCV2 ORF2檢測(cè)引物能有效檢測(cè)PCV2點(diǎn)突變株和原毒株(圖4)。

A.3 aa點(diǎn)突變株；B.5 aa點(diǎn)突變株；C.18 aa點(diǎn)突變株；D.原毒株。

2.4 4～6 aa和3～6 aa點(diǎn)突變后PCV2復(fù)制能力

pSK-4-6aa和pSK-3-6aa轉(zhuǎn)染后連續(xù)傳至3代，收獲上清液接毒無(wú)PCV2污染的PK-15細(xì)胞并盲傳6代，各吸出200 μL提取DNA并使用PCV2 ORF2檢測(cè)引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)Ct值，若模板濃度太高，將DNA稀釋再進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示4～6 aa點(diǎn)突變株和3～6 aa突變株復(fù)制能力減弱(表3)。

表3 4～6 aa和3～6 aa點(diǎn)突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

2.5 2～4 aa、2～6 aa、17～19 aa點(diǎn)突變后PCV2復(fù)制能力變化

pSK-2-4aa、pSK-4-6aa和pSK-17-19aa轉(zhuǎn)染后連續(xù)傳代，最多傳至第6代，每代提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)Ct值，結(jié)果顯示Ct值持續(xù)上升，說(shuō)明病毒復(fù)制能力明顯減弱(表4)。

表4 2～4 aa、17～19 aa和2～6 aa點(diǎn)突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

2.6 17 aa、19 aa、20 aa、21 aa和17～21 aa點(diǎn)突變后PCV2拯救情況

pSK-17aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa和pSK-17-21aa轉(zhuǎn)染后連續(xù)傳代，最多傳至第6代，每代提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)Ct值，結(jié)果顯示Ct值持續(xù)上升至30以上，說(shuō)明17 aa、19 aa、20 aa和21 aa點(diǎn)突變后嚴(yán)重抑制了病毒的復(fù)制能力，這4個(gè)位點(diǎn)對(duì)PCV2的復(fù)制起到關(guān)鍵作用(表5)。

表5 17 aa、19 aa、20 aa、21 aa和17～21 aa點(diǎn)突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

3 討論

PCV有4種血清型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。PCV1和PCV2廣泛存在，目前普遍認(rèn)為PCV1無(wú)致病性[11-12]，而PCV2是導(dǎo)致PMWS的主要因素。PCV1病毒的復(fù)制起點(diǎn)位于2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2之間的頸環(huán)結(jié)構(gòu)上，由Rep和剪切后的Rep′在結(jié)構(gòu)保守九聚體的第7、8堿基之間進(jìn)行切割與連接[13]，PCV2與PCV1的基因組具有高度同源性，二者與病毒復(fù)制相關(guān)的起點(diǎn)及Rep基因都是保守的[14]。與PCV1類似，PCV2中同樣存在2個(gè)以上剪切后的Rep′，全長(zhǎng)Rep和Rep′是PCV2復(fù)制所必需的[15]。本研究通過(guò)無(wú)縫克隆，在不影響Rep全長(zhǎng)的情況下將個(gè)別氨基酸突變?yōu)楸彼幔D(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，通過(guò)qPCR檢測(cè)PCV2及PCV2突變株的復(fù)制情況。

本研究首先對(duì)PCV2 Rep的2～6 aa和17～21 aa進(jìn)行了突變，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后傳至第4代，發(fā)現(xiàn)病毒載量隨細(xì)胞傳代而不斷降低，且17～21 aa點(diǎn)突變株的Ct值上升至31.678，一般在Ct值為35時(shí)可以認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果為陰性，因此認(rèn)為17～21 aa突變后PCV2無(wú)法復(fù)制。為進(jìn)一步探究影響PCV2復(fù)制的具體位點(diǎn)，構(gòu)建一系列不同位點(diǎn)突變的PCV2點(diǎn)突變株，結(jié)果顯示：3 aa、5 aa和18 aa分別突變后PCV2的復(fù)制能力增強(qiáng)，在細(xì)胞中的載量明顯高于PCV2原毒株；2～4 aa和17～19 aa突變后病毒載量隨細(xì)胞傳代持續(xù)降低；4～6 aa和3～6 aa突變后病毒能被成功拯救但復(fù)制能力與PCV2原毒株相比減弱；而17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突變后病毒均無(wú)法成功拯救。以上結(jié)果顯示，PCV2 Rep 17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是PCV2復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)其中任意一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，PCV2都無(wú)法通過(guò)感染性克隆進(jìn)行拯救，其復(fù)制能力受到嚴(yán)重的影響。PCV2 Rep 2 aa也可能是PCV2復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，與不包含2 aa突變的3～6 aa突變相比，包含2 aa突變的2～4 aa突變和2～6 aa突變?cè)谶M(jìn)行病毒拯救的過(guò)程中呈現(xiàn)Ct值緩慢上升的狀態(tài)且Ct值明顯高于3～6 aa突變，顯示出2 aa突變對(duì)PCV2的復(fù)制產(chǎn)生影響。3 aa和5 aa突變后PCV2復(fù)制能力增強(qiáng)，已有研究證明6 aa突變后可使PCV2的復(fù)制能力增強(qiáng)[16]，但3～6 aa突變后PCV2雖然能拯救但病毒復(fù)制能力下降，說(shuō)明4 aa突變后降低了PCV2的復(fù)制能力。

已有研究結(jié)果表明，ssDNA可通過(guò)與Rep特定蛋白質(zhì)直接接觸，或通過(guò)有U型構(gòu)象的凹槽與Rep對(duì)接從而進(jìn)行間接接觸，Rep蛋白的17 aa至21 aa位于該結(jié)構(gòu)的同一個(gè)β折疊上[17]。因此，PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa可能正是Rep與ssDNA相互作用或幫助Rep形成相關(guān)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點(diǎn)，改變相關(guān)氨基酸可抑制或減弱Rep與ssDNA的相互作用，從而對(duì)PCV2的復(fù)制產(chǎn)生了不利的影響。

總之，本文探究了Rep蛋白影響PCV2復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，為后續(xù)開(kāi)展PCV2復(fù)制相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。