神經介素B及受體NMBR和PD-L1在H9N2亞型流感病毒感染過程中的相互作用研究

李春雨，田世茂，孔迎迎，陳燦輝，田也，劉莎莎，陳吉龍，楊桂紅

(福建農林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是困擾養(yǎng)殖業(yè)的一種重要的病原微生物，屬于正黏病毒科、單股負鏈RNA病毒，根據病毒表面的18種血凝素(HA)和11種神經氨酸酶(NA)而被劃分為若干亞型[1]。目前，在我國養(yǎng)殖業(yè)流行的亞型主要有雞群H9N2[2]、犬群H3N2[3]以及豬群H1N1、H1N2和H3N2[4]。IAV可通過空氣傳播，季節(jié)性引起人或動物急性上呼吸道感染，造成細胞因子風暴，誘發(fā)急性肺損傷，導致人和大量動物的死亡，給公共衛(wèi)生健康帶來嚴重的威脅[5]。H9N2亞型流感病毒是家禽中的優(yōu)勢毒株，并為多種亞型禽流感病毒提供基因片段[6-7]。因此，開展H9N2亞型IAV的相關研究對公共衛(wèi)生和動物健康的意義重大。

神經介素B(neuromedin B，NMB)是神經內分泌免疫系統(tǒng)中的重要生物活性肽，可與G蛋白偶聯受體(NMBR)結合發(fā)揮多種生理功能[8]。本項目組前期研究發(fā)現，NMB與NMBR可以通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗IAV/H1N1的先天性免疫反應[9-10]。在分析NMB與NMBR在IAV誘導的肺炎癥損傷反應中發(fā)現，NMB與NMBR發(fā)揮抗流感的作用途徑與IAV誘導細胞程序性死亡配體(程序性死亡配體1，簡稱PD-L1)介導的信號通路均為NF-κB信號通路。目前，部分研究發(fā)現PD-L1參與IAV感染誘導的免疫調節(jié)反應。IAV感染誘導人樹突狀細胞和T細胞上PD-L1的表達上升，阻斷PD-L1可顯著降低 CD8+T細胞凋亡并增加 CD4+T細胞誘導的γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子(TNF)表達，從而改變IAV的感染進程[11]。研究表明，PD-L1對T細胞功能的影響主要是通過NF-κB通路實現的[12]。以上研究表明，IAV感染誘導的NMB與NMBR信號和PD-L1表達之間可能存在一定的作用關系。因此，本研究利用H9N2亞型流感病毒毒株感染宿主細胞，分析NMB與NMBR和PD-L1之間的調節(jié)關系，為尋找更有效的新型抗IAV感染藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞與病毒

人肺腺癌細胞(A549細胞)、人胚腎細胞(293T細胞)購買自中國科學院上海細胞庫。甲型流感病毒H9N2亞型毒株(A/Chicken/Fujian/MQ01/2015)由本實驗室分離、鑒定后保存。

A.RT-PCR結果顯示干擾NMBR導致H9N2感染誘導的PD-L1表達增強；B.RT-PCR結果顯示過表達NMBR導致H9N2感染誘導的PD-L1表達下調；C.RT-PCR結果顯示外源性NMB刺激導致H9N2感染誘導的PD-L1表達下調；D.Western blot結果顯示干擾NMBR導致H9N2感染誘導的PD-L1表達增強；E.Western blot結果顯示過表達NMBR導致H9N2感染誘導的PD-L1表達下調；F.Western blot結果顯示外源性NMB刺激導致H9N2感染誘導的PD-L1表達下調。

A.RT-PCR結果顯示干擾PD-L1導致H9N2感染誘導的NMBR表達增強；B.RT-PCR結果顯示過表達PD-L1導致H9N2感染誘導的NMBR表達下調；C.Western blot結果顯示干擾PD-L1導致H9N2感染誘導的NMBR表達增強；D.Western blot結果顯示過表達PD-L1導致H9N2感染誘導的NMBR表達下調。

A.干擾NMBR抑制H9N2感染誘導的ERK磷酸化水平；B.外源NMB刺激抑制PD-L1表達和ERK磷酸化。

1.1.2 質粒與抗體

Package、Pvsvg和pNL-EGFP-CMV-WPREdU3質粒均由本實驗室保存。本課題組前期使用pNL-EGFP-CMV-WPREdU3載體于酶切位點NheⅠ和XhoⅠ插入NMBR、PD-L1片段構成pNL-NMBR、pNL-PD-L1重組質粒，用于構建NMBR過表達細胞系(NMBR+/+)、PD-L1過表達細胞系(PD-L1+/+)，并將該質粒保存于本實驗室。

GAPDH抗體(貨號:HC301-01)購自TransGen Biotech公司；NMBR抗體(貨號：ab134141)、ERK抗體(貨號：ab184699)均購自Abcam公司；pERK抗體(貨號：#ET1603-22)購自華安生物公司；PD-L1抗體(貨號：#13684)購自Cell Signaling Technology公司；NP抗體由本實驗室制備并保存；鼠抗兔(貨號：211-005-109)二抗購自Jackson Immunoresearch公司。

1.1.3 引物序列

使用NCBI數據庫在線引物設計工具Primer-BLAST設計引物，序列的合成在生工生物工程(上海)股份有限公司完成，具體信息見表1。

表1 RT-PCR引物

1.1.4 多肽合成

本研究中使用到的NMB由中國杭州專肽生物技術有限公司合成，采用PBS緩沖液溶解NMB(100 μmol/L)，分裝保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

NMB氨基酸序列：Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Asp-Leu-Pro-Glu-Pro-Arg-Ser-Arg-Ala-Gly-Lys-Ile-Arg-Val-His-Pro-Arg-Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2。

1.2 細胞培養(yǎng)

將A549細胞或293T細胞從37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中拿出，棄完全培養(yǎng)基，PBS清洗2遍；用0.25%胰酶溶液消化細胞，視細胞情況而定消化時長，A549細胞消化3 min，293T細胞消化30 s，待細胞變圓并輕敲后脫落即可；用2 mL完全培養(yǎng)基吹下細胞終止消化，各吸1 mL轉移到2盤含6 mL完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，或各吸166 μL轉移到每孔含2 mL完全培養(yǎng)基的6孔板中，蓋上蓋子搖勻，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 NMBR和PD-L1過表達細胞系的構建

取1.5 mL EP管配制轉染試劑：A管中加入8 μg重組質粒(pNL-NMBR或pNL-PD-L1或對照質粒pNL-GFP)和8 μg包裝質粒(Package和Pvsvg)，再加入轉染液至總體積為500 μL，溫和地混勻后靜置5 min；B管中加入10 μL轉染試劑VigoFect[威格拉斯生物技術(北京)有限公司]到490 μL轉染液中，輕輕混勻后靜置5 min。輕輕混勻A管和B管試劑，室溫放置20～25 min后，滴入到生長良好的293T細胞中，搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。4～6 h后，換成含8 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，用0.22 μm孔徑濾膜過濾上清液，加入濃度為0.1%的polybrene(碧云天-C0351)，用上清液吹下提前消化好的A549細胞放入6孔板培養(yǎng)，每孔約2.5 mL病毒液。懸浮感染120 min (2 100 r/min，32 ℃)后，在6孔板中補加1 mL完全培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后進行細胞傳代，利用RT-PCR或Western blot檢測目的基因的過表達效果，最終可獲得具有穩(wěn)定過表達NMBR(NMBR+/+)或PD-L1(PD-L1+/+)的細胞系以及對照組細胞系(Cont)。

1.4 siRNA的轉染

待A549細胞匯合度達到70%～80%時更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，將細胞分別設為siPD-L1和siNMBR轉染組，同時設置平行陰性對照組(NC)，即siNC。轉染組及其對照組各設置3個復孔。按LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明書分別配置轉染試劑，將配置好的轉染試劑混合后孵育15 min，然后在每孔細胞培養(yǎng)液中各加入200 μL，輕搖混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細胞4～6 h，棄混合液換新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后利用RT-PCR或Western blot檢測目的基因的干擾效果后，用于后續(xù)試驗。

1.5 H9N2感染細胞系和小鼠

siNMBR細胞、NMBR+/+細胞、siPD-L1細胞和PD-L1+/+細胞分別生長至80%后，棄完全培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入1 mL維持液(基礎培養(yǎng)基+雙抗+2 μg/mL TPCK胰酶)；每孔加入H9N2病毒(MOI=1)后置于培養(yǎng)箱吸附1 h，每15 min搖1次；1 h后，棄維持液，PBS清洗2次，加入2 mL新鮮維持液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在病毒感染后設定的時間點(感染后小時數，簡稱hpi)收取各組細胞樣品。

6～8周齡C57BL/6小鼠購自上海吳化實驗動物，平均體重至(18±2)g/只。用揮發(fā)性麻醉藥乙醚麻醉小鼠，試驗組小鼠滴鼻感染H9N2病毒液，陰性對照組小鼠滴鼻等體積1×PBS，滴鼻后繼續(xù)放回籠中飼養(yǎng)，在病毒感染后設定的時間點用乙醚麻醉處死小鼠收取各組肺臟組織樣品。

1.6 NMB處理H9N2感染的A549細胞和小鼠

基于H9N2感染A549細胞，添加100 nmol/L 外源性NMB作用于細胞，試驗分為4組：①對照組，②攻毒組，③攻毒+NMB組，④對照+NMB組，每組重復6個孔。具體操作如下：將A549細胞預先鋪在6孔板細胞板，待細胞的生長狀態(tài)良好時，棄掉完全培養(yǎng)基，用1×PBS緩沖液清洗細胞2次，①和④組加入1 mL維持液，②和③組加入1 mL維持液(含10 μL病毒)，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間每15 min搖1次。1 h后，棄掉6孔板中維持液，用1×PBS緩沖液清洗細胞2次。①和②組加2 mL維持液，③和④組加入2 mL維持液(含100 nmol/L NMB)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后收取各組RNA樣或蛋白樣。

按1.5方法攻毒感染小鼠12 h后，在小鼠后腿肌肉注射NMB，連續(xù)注射3 d，觀察小鼠感染情況與死亡情況，3 d后乙醚麻醉處死小鼠，取肺組織進行后續(xù)試驗。

1.7 RT-PCR

使用NucleoZol提取細胞RNA，按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。RT-PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共20～35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應結束后，取PCR擴增產物10 μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶。以GAPDH作為內參。

1.8 Western blot

提取上述細胞樣品蛋白，用SDS-PAGE分離蛋白后轉移到硝酸纖維素(NC)膜上；5%牛奶中封閉2 h，1×TBS中漂洗干凈，一抗孵育2～3 h，孵育結束后用1× TBS漂洗30 min，10 min/次；再用二抗孵育2 h，1×TBS漂洗30 min，10 min/次，將條帶置于tECL化學發(fā)光液(蘇州新賽美生物科技公司)后放入化學發(fā)光儀(Tanon 5200)曝光。

2 結果

2.1 NMB/NMBR調節(jié)H9N2感染誘導的PD-L1表達

分別收集H9N2(MOI=1)感染的siNMBR細胞、siNC細胞、NMBR+/+細胞、Cont細胞、H9N2感染后NMB處理的A549細胞和相應的陰性對照組的細胞于0、6和12 h的核酸樣品和蛋白樣品，采用RT-PCR和Western blot分別分析PD-L1在各組的表達變化。結果顯示：siNMBR細胞中PD-L1的表達水平在感染后6～12 h 明顯升高；NMBR+/+細胞中PD-L1的表達水平在感染后6～12 h出現了下降趨勢；NMB處理后，不僅可以刺激A549細胞中NMBR的表達水平上升，還可抑制PD-L1的表達(圖1)。該結果表明，NMB/NMBR可以直接調控H9N2感染誘導的PD-L1的表達。

2.2 PD-L1調節(jié)H9N2感染誘導的NMBR表達

分別收集上述H9N2(MOI=1)的siPD-L1細胞、siNC細胞、PDL-1+/+細胞、Cont細胞和陰性對照組細胞于0和18 h的核酸樣品和蛋白樣品，采用RT-PCR和Western blot分別分析PD-L1在各組細胞中的表達變化。結果如圖2顯示：H9N2感染誘導siPD-L1細胞中的NMBR表達水平明顯上升，H9N2感染誘導PD-L1+/+細胞中的NMBR的表達水平出現明顯下降趨勢。該結果表明，PD-L1也可以直接參與調控H9N2亞型流感病毒感染誘導的NMBR的表達水平。綜合以上結果顯示，NMBR和PD-L1在H9N2感染過程中可能存在著相互作用的關系。

2.3 NMBR通過ERK通路抑制H9N2感染誘導的PD-L1表達

本課題組前期發(fā)現，甲型流感病毒感染誘導的NMB/NMBR抗病毒免疫反應及PD-L1高表達均與NF-κB信號通路有直接關系，而NF-κB信號通路的激活受ERK信號通路的調控。因此，為進一步驗證H9N2亞型感染誘導的NMBR和PD-L1的作用關系，本試驗在上述明確干擾NMBR誘導PD-L1表達顯著增強的基礎上，對ERK的磷酸化水平進行了分析。如圖3A所示，H9N2感染誘導siNMBR細胞中的PD-L1表達水平明顯上升，而ERK的磷酸化水平明顯降低。該結果提示，干擾NMBR可以有效緩解H9N2誘導的ERK磷酸化水平。同時，用NMB刺激H9N2感染的小鼠，觀察小鼠肺組織中ERK磷酸化水平的變化。圖3B顯示，NMB刺激不僅可以誘導H9N2感染的小鼠肺組織中NMBR表達，也可以抑制PD-L1表達，促進ERK的磷酸化水平。該結果顯示，NMB刺激NMBR表達進而激活ERK信號通路參與H9N2亞型感染誘導的PD-L1的表達。

3 討論

IAV感染可誘發(fā)機體快速產生細胞因子，激活動員機體眾多防御機制，將免疫細胞募集到肺部，改變維持肺屏障結構的完整性和蛋白分子的功能，造成肺組織免疫病理性損傷。相對于病毒的高度變異性，宿主的抗病毒因子比較保守，通過穩(wěn)定調控宿主的抗病毒作用達到阻止病毒入侵的目的是動物疫病防控的一種新思路[13]。鑒于NMB多肽活性和NMBR屬于G蛋白偶聯受體而具有的重要的藥物靶標屬性的結構特征，以及二者在信號傳導中的穩(wěn)定調節(jié)作用，課題組前期將NMB與NMBR應用于IAV引起的免疫防控研究，發(fā)現其可以平衡調節(jié)H1N1亞型病毒A/PR/8/1934毒株誘導的IL-6和IFN-α表達，進而有效抑制該病毒復制[9-10]。本文在此基礎上進一步分析了NMB與NMBR信號軸和PD-L1在H9N2感染過程中的關聯性。

NF-κB信號通路在IAV復制中發(fā)揮著雙刃劍的作用[14-15]。現有的資料表明，NF-κB信號通路與IAV誘導的NMB與NMBR和PD-L1的表達均有密切關聯。但是，NF-κB信號通路是否關聯IAV誘導的NMB與NMBR和PD-L1的功能尚不明確。本研究證實，H9N2亞型病毒感染過程中，NMB與NMBR和PD-L1的表達存在互相調節(jié)的現象?；贜MB與NMBR抗IAV的免疫應答反應[12]和PD-L1在炎癥反應中的免疫抑制作用[10]，本研究證實NMB與NMB可以通過調節(jié)ERK的磷酸化水平參與H9N2感染誘導的PD-L1的表達而發(fā)揮抗IAV的免疫應答反應。研究表明，NF-κB信號通路的激活受ERK信號通路的調控[16-17]。因此，本研究結果也間接暗示了NF-κB信號通路在IAV誘導的NMB與NMBR和PD-L1相互作用中發(fā)揮著重要作用。

綜上，本研究揭示了H9N2亞型流感病毒感染誘導的NMB與NMBR和PD-L1之間存在著相互的調節(jié)關系，這種調節(jié)關節(jié)與H9N2感染激活的ERK信號通路密切相關。本文研究結果揭示了NMB與NMBR發(fā)揮抗IAV感染免疫調節(jié)作用的分子基礎，為深度剖析宿主-流感病毒之間的互作關系提供了理論基礎，也為篩選新型抗IAV藥物的作用靶標提供了新思路。