豬鏈球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表達(dá)及催化特性分析

孫文，張永毅，陸暢，朱德文，尹媛媛，徐泉明，2*，陳葉*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，閩臺動物病原生物學(xué)福建省高校重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350002；2.福建警察學(xué)院，福建 福州 350007)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種人畜共患的革蘭陽性兼性厭氧球菌[1]。豬鏈球菌2型(SS2)是諸多血清型中毒力最強(qiáng)、流行最廣、臨床分離率較高的一種血清型，宿主感染后往往呈現(xiàn)腦膜炎、心內(nèi)膜炎、中毒性休克綜合征等臨床癥狀[2]。

為了快速適應(yīng)環(huán)境的變化，細(xì)菌需要調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄以及某些RNA的加工、衰變。有研究報道，核糖核酸酶(ribonuclease，RNases)是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子，可以控制各類RNA的降解和穩(wěn)態(tài)水平來維持各項生命活動[3]。在多種細(xì)菌中有對RNases催化特性和作用進(jìn)行探究[4-6]，其中核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)是一類雙鏈特異性核糖核酸內(nèi)切酶，廣泛存在于原核生物和真核生物中[7]。細(xì)菌RNase Ⅲ可以調(diào)節(jié)自身mRNA的合成以及特定RNA的降解和成熟[8]，在對數(shù)期生長的大腸桿菌中，有超過10%的mRNA穩(wěn)態(tài)水平受RNase Ⅲ調(diào)控[9]，多核苷酸磷酸化酶(PNPase)也是一種具有催化切割RNA功能的外切核糖核酸酶，研究發(fā)現(xiàn)編碼PNPase的pnpmRNA和編碼RNase Ⅲ的rncmRNA均可被RNase Ⅲ催化降解[10]。在多種細(xì)菌研究中發(fā)現(xiàn)，RNase Ⅲ的催化活性需要金屬離子的輔助，例如大腸桿菌RNase Ⅲ可在Mg2+或Mn2+催化下選擇性識別并切割雙鏈RNA(dsRNA)[11]。RNase Ⅲ會根據(jù)特異性的切割位點(diǎn)切割dsRNA[12]，此外切割位點(diǎn)附近的特定堿基配對模式也可能影響RNase Ⅲ的切割效率[13]。RNase Ⅲ往往特異性催化某些天然或合成的dsRNA，細(xì)菌RNase Ⅲ將多種前體RNA，如rRNA、tRNA及sRNA等加工成為成熟RNA[14]。早期研究發(fā)現(xiàn)Rc mini RNA和N44 RNA能被大腸桿菌和莢膜紅桿菌RNase Ⅲ特異性切割[15]。同時也有研究表明，RNase Ⅲ的活性影響某些致病菌的形態(tài)，Maeda等[16]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌RNase Ⅲ可以催化降解mraZmRNA的編碼區(qū)來維持細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定。RNase Ⅲ的活性還影響某些致病菌的毒力性狀，尤其在沙門菌中，RNase Ⅲ參與調(diào)控生物被膜形成、對宿主定殖和抗生素的敏感性等[8]

在模式細(xì)菌大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的研究中，RNase Ⅲ的催化特性已有很多報道，然而關(guān)于鏈球菌RNase Ⅲ的研究卻鮮有報道[17-18]。豬鏈球菌是當(dāng)前廣受重視的人獸共患病原之一，目前尚未見關(guān)于豬鏈球菌2型RNase Ⅲ(SS-RNase Ⅲ)的研究報道，因此挖掘其催化特性具有重要意義。本研究對SS-RNase Ⅲ進(jìn)行了遺傳演化分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過克隆表達(dá)SS-RNase Ⅲ并對其進(jìn)行表征，比較與其他種類細(xì)菌RNase Ⅲ在底物催化特性方面的異同，通過比較差異性，進(jìn)一步了解豬鏈球菌RNase Ⅲ底物催化特異性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SS2野生菌株(05ZYH33)由浙江大學(xué)馮友軍教授饋贈，質(zhì)粒pET28a由本實驗室保存。所用菌株大腸桿菌Top10和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(T7高效轉(zhuǎn)錄試劑盒,貨號:JT101-0)和RNA純化回收試劑盒均購自北京全式金生物有限公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒購自O(shè)mega公司。用于PCR擴(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄的RNA底物引物序列見表1，16 mer ssRNA、30 mer ssRNA及引物由福州鉑尚生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 SS-RNase Ⅲ遺傳進(jìn)化及二級結(jié)構(gòu)分析

通過在線生物信息學(xué)網(wǎng)站(https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測RNase Ⅲ潛在的氨基酸修飾位點(diǎn)。使用NCBI BLAST對包括豬鏈球菌在內(nèi)的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的RNase Ⅲ氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，再經(jīng)多序列比對，遺傳進(jìn)化樹采用Mega軟件進(jìn)行繪制。以超嗜熱菌RNase Ⅲ蛋白為模板(PDB：1yz9)進(jìn)行同源建模，經(jīng)ESPript 3.0分析處理后得到豬鏈球菌RNase Ⅲ蛋白的二級結(jié)構(gòu)，所用參考序列見表2。

表2 細(xì)菌RNase Ⅲ蛋白參考序列

1.3 體外轉(zhuǎn)錄合成底物RNA及純化

模式底物RNA：RNA 1.1以及細(xì)菌內(nèi)源性底物RNA：5S rRNA、tRNAtyr、tRNAser、rncmRNA、rngmRNA均利用表1中的相關(guān)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增及膠回收獲得用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板，再通過體外轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取相關(guān)RNA產(chǎn)物。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：1 μg模板DNA，4 μL 5×T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，8 μL 10 mmol/L NTP Mix，2 μL T7轉(zhuǎn)錄酶mix，無酶水補(bǔ)至20 μL。充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應(yīng)2 h，隨后添加1 μL DNase I，37 ℃反應(yīng)15 min，最后添加1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)終止反應(yīng)，利用純化回收體外轉(zhuǎn)錄試劑盒回收純化RNA產(chǎn)物，最后置于-80 ℃保存。

1.4 重組質(zhì)粒pET28a-rnc的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以豬鏈球菌05ZYH33基因組DNA為模板擴(kuò)增RNase Ⅲ編碼的rnc基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收得到目的DNA片段。用NcoⅠ和EcoRⅠ對質(zhì)粒pET28a和目的片段進(jìn)行雙酶切。所用體系為：質(zhì)粒pET28a或目的片段6 μL，酶切Buffer 1 μL，NcoⅠ和EcoRⅠ各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)至10 μL。于37 ℃水浴酶切4 h，酶切產(chǎn)物分別使用清潔回收試劑盒回收。回收產(chǎn)物連接體系如下：目的基因片段回收產(chǎn)物6 μL，質(zhì)粒pET28a酶切回收產(chǎn)物2 μL，連接緩沖液1 μL，最后加入T4 DNA連接酶1 μL于16 ℃金屬浴中連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴放置30 min，42 ℃水浴熱激90 s，繼續(xù)冰浴2 min，隨后加入400 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，輕輕混勻后于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)1 h，取出菌液以5 000 r/min離心1 min，吸棄200 μL上清液后混勻取適量菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于600 μL含卡那霉素LB培養(yǎng)基(終濃度為50 μg/mL)中，37℃搖床培養(yǎng)8 h，菌液PCR鑒定為陽性后提取質(zhì)粒，再經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測序無誤后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株大腸桿菌 BL21(DE3)中。

1.5 SS-RNase Ⅲ誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性菌落轉(zhuǎn)接于10 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過夜，以1%接菌量至200 mL含有卡那霉素(終濃度為50 μg/mL)LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，待菌液OD600≈0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.2 mmol/L)，18 ℃、150 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h，8 000 r/min離心10 min收獲菌體沉淀，PBS洗滌并重懸沉淀，重懸液高速離心后棄上清液，重復(fù)洗滌1次，收集菌體保存于-80 ℃。

1.6 SS-RNase Ⅲ純化

誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用40 mL PBS重懸，冰浴超聲破碎菌體細(xì)胞(200 W，超聲1 s，間歇3 s，時間10 min)，8 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀(沉淀用等量PBS重懸)，按照1∶5的比例分別加入6×Loading Buffer混勻，煮沸8 min將蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析，檢測目的蛋白分別在上清液和包涵體中的表達(dá)情況。使用鎳親和層析柱進(jìn)一步純化，再經(jīng)超濾管替換、濃縮得到更高純度的SS-RNase Ⅲ蛋白，最后用12.5%的SDS-PAGE檢測表達(dá)量和純度。

1.7 SS-RNase Ⅲ化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)

設(shè)置反應(yīng)體系為10 μL，將純化后的SS-RNase Ⅲ蛋白與不同濃度(0，2.5，5.0，10.0 μmol/L)的乙二醇雙丁二酰琥珀酸酯(EGS)室溫進(jìn)行交聯(lián)60 min，然后添加50 mmol/L甘氨酸終止反應(yīng)。通過12.5%濃度的SDS-PAGE以及銀染顯示結(jié)果。

1.8 SS-RNase Ⅲ體外催化反應(yīng)

1.8.1 金屬離子對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

為了探究金屬離子對SS-RNase Ⅲ的輔助催化作用，配制10 mmol/L濃度的不同金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+)催化反應(yīng)體系(反應(yīng)體系10 μL)，其中包含30 mmol/L Tris-HCl(pH =7)1 μL，160 mmol/L NaCl 1 μL，0.1 mmol/L DTT 1 μL和500 ng RNA 1.1，最后加入1 μmol/L SS-RNase Ⅲ，此時開始計時；另設(shè)置1組不添加SS-RNase Ⅲ為對照組。37 ℃反應(yīng)15 min和45 min，加入10×RNA Loading Buffer終止反應(yīng)，通過20%(含7 mol/L尿素)SDS-PAGE檢測催化效果。同時探究不同金屬離子濃度對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響，僅更改催化反應(yīng)體系中金屬離子濃度(0.1、1、5、10、50和100 mmol/L)，其余步驟與上述一致，最后通過SDS-PAGE以及銀染染色檢測催化效果。

1.8.2 pH值對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

為探究pH值對催化活性的影響，向反應(yīng)體系中加入相同濃度(10 mmol/L)的金屬離子，催化反應(yīng)體系pH值調(diào)整為5、6、7、8、9、10，其余步驟與1.8.1一致，采用SDS-PAGE以及銀染檢測催化效果。

1.8.3 SS-RNase Ⅲ對不同底物RNA的催化反應(yīng)

確定最適反應(yīng)體系pH值為7，Mg2+濃度為10 mmol/L，向反應(yīng)體系施加不同類型RNA底物(16 mer ssRNA、30 mer ssRNA、16：30 dsRNA、30：30 dsRNA、tRNAser、tRNAtyr、5S rRNA、rncmRNA和rngmRNA)，SS-RNase Ⅲ對底物RNA的催化反應(yīng)過程與1.8.2一致。

2 結(jié)果

2.1 SS-RNase Ⅲ序列分析

首先通過在線分析網(wǎng)站比對確定豬鏈球菌05ZYH33菌株基因組上的RNase Ⅲ氨基酸序列，同時結(jié)合基因組重測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在05ZYH33菌株基因組上的SSU05_1191和SSU05_1192合并為一個開放閱讀框，共同編碼RNase Ⅲ蛋白(圖1)。進(jìn)一步利用在線軟件Motif Scan解析05ZYH33菌株RNase Ⅲ的氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNase Ⅲ氨基酸序列存在3個磷酸化位點(diǎn)，分別為酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(41～44 aa、137～140 aa)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(211～213 aa)，以及1個N-酰基化位點(diǎn)(13～18 aa)，提示了蛋白質(zhì)磷酸化可能參與調(diào)控RNase Ⅲ的活性。如圖2的結(jié)構(gòu)分析所示，RNase Ⅲ包含2個結(jié)構(gòu)域(催化結(jié)構(gòu)域RⅢD和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域dsRBD)，主要通過11個α-螺旋和3個β-折疊連接部分卷曲螺旋的方式形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，其中催化基序由ERLEFLGDA共9個保守氨基酸組合而成。

圖1 豬鏈球菌05ZYH33菌株中rnc基因座示意

圖2 RNase Ⅲ蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

2.2 SS-RNase Ⅲ同源蛋白比較

選取3種鏈球菌(無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌)、3種葡萄球菌(豬葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌)以及4種不同的革蘭陰性菌(大腸桿菌、超嗜熱菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌)與SS2的RNase Ⅲ進(jìn)行多序列比對分析。結(jié)果顯示，相比于其他細(xì)菌，SS2與3種鏈球菌RNase Ⅲ具有極高的同源性(圖2)。此外，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，SS2的RNase Ⅲ與所選3種鏈球菌處于相同遺傳分支，其中親緣關(guān)系最近的是肺炎鏈球菌；而與選取的4種革蘭陰性菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，位于不同的遺傳分支(圖3)。

注：○為本研究細(xì)菌。

2.3 SS-RNase Ⅲ的表達(dá)與純化

通過PCR擴(kuò)增SS-RNase Ⅲ編碼的rnc基因并將其克隆至pET28a載體，雙酶切(NcoⅠ和EcoRⅠ)鑒定，結(jié)果條帶與預(yù)期大小一致(圖4A)，將該重組表達(dá)載體命名為pET28a-rnc，經(jīng)DNA測序鑒定無誤后將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SS-RNase Ⅲ，SDS-PAGE分析結(jié)果(圖4B)顯示在25 kDa附近出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小一致的差異表達(dá)條帶。優(yōu)化表達(dá)條件，分析上清液和沉淀，發(fā)現(xiàn)在低溫且低誘導(dǎo)劑濃度下外源表達(dá)的目的蛋白大部分可溶，但仍有部分以包涵體形式存在(圖4B)。為了獲得純化的SS-RNase Ⅲ，利用SS-RNase Ⅲ蛋白上融合的6×His標(biāo)簽，使用鎳親和層析柱純化上清液中的目的蛋白，結(jié)合超濾管對純化的目的蛋白及緩沖液進(jìn)行濃縮和替換，SDS-PAGE檢測顯示成功獲取高純度的SS-RNase Ⅲ(圖4C)。

注：A.對重組質(zhì)粒pET28a-rnc進(jìn)行雙酶切(NcoⅠ和EcoRⅠ)，其中M為DNA Marker，1為重組質(zhì)粒pET28a-rnc；B.重組蛋白SS-RNase Ⅲ在大腸桿菌BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測，其中M為蛋白Marker，1為未添加IPTG條件，2為添加IPTG并低溫誘導(dǎo)條件，3為上清液SS-RNase Ⅲ蛋白，4為沉淀SS-RNase Ⅲ蛋白；C.重組蛋白經(jīng)純化后SS-RNase Ⅲ的SDS-PAGE檢測，其中M為蛋白Marker，1為SS-RNase Ⅲ。

2.4 SS-RNase Ⅲ的化學(xué)交聯(lián)分析

RNase Ⅲ內(nèi)切核糖核酸酶通常作為同源二聚體起作用[4]，為了驗證SS-RNase Ⅲ是否二聚化，將純化后的SS-RNase Ⅲ與不同濃度的交聯(lián)劑EGS共同孵育進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，SS-RNase Ⅲ二聚體會隨著EGS濃度的升高而增加，表明SS-RNase Ⅲ具有與其他RNase Ⅲ同源物相同的二聚化潛力。

M.蛋白Marker；1.未添加EGS；2.添加2.5 μmol/L EGS；3.添加5 μmol/L EGS；4.添加10 μmol/L EGS。

2.5 SS-RNase對金屬離子的依賴性分析

為了探究SS-RNase Ⅲ的催化特性，利用在其他細(xì)菌[4，19]中已有報道的具有雙鏈特性的RNA 1.1作為SS-RNase Ⅲ的催化底物，如圖6A所示，RNA 1.1由1個60 nt大小的RNA分子包含1個不對稱(4 nt/5 nt)的內(nèi)環(huán)組成，具有1個一級切割位點(diǎn)(a)和1個二級切割位點(diǎn)(b)。切割a或b單一位點(diǎn)分別產(chǎn)生(13 nt與47 nt)和(19 nt和41 nt)大小的RNA片段，同時切割a和b位點(diǎn)將產(chǎn)生大小為28 nt的RNA片段。

注：A.模式底物RNA 1.1二級結(jié)構(gòu)示意，a和b為2個特異性切割位點(diǎn)；B.添加不同金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性變化。

在pH值為7的反應(yīng)體系中添加10 mmol/L不同的金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Cu2+)進(jìn)行催化反應(yīng)，催化產(chǎn)物經(jīng)含7 mol/L尿素的20% SDS-PAGE膠檢測。結(jié)果如圖6B所示，僅在添加Mg2+或Mn2+條件下的SS-RNase Ⅲ才具有催化活性，能夠?qū)⑼暾?0 nt的RNA 1.1切割成不同大小的RNA片段，其中在添加Mg2+條件下，出現(xiàn)了大小為28 nt的切割產(chǎn)物，表明Mg2+的存在會導(dǎo)致SS-RNase Ⅲ同時切割RNA 1.1的a和b位點(diǎn)。

進(jìn)一步通過改變反應(yīng)體系中Mg2+或Mn2+的濃度，結(jié)果如圖7A所示，SS-RNase Ⅲ的催化切割產(chǎn)物的量會隨著Mg2+的濃度升高而增多，且濃度達(dá)到5 mmol/L時SS-RNase Ⅲ催化切割活性達(dá)到峰值；如圖7B所示，SS-RNase Ⅲ在Mn2+存在下的催化切割活性與Mg2+類似，在Mn2+濃度達(dá)到1 mmol/L時其催化切割活性達(dá)到峰值。對Mg2+和Mn2+進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在5 mmol/L同樣濃度的Mg2+或Mn2+體系中，SS-RNase Ⅲ催化RNA 1.1切割位點(diǎn)不同，產(chǎn)生的小RNA片段不同。研究結(jié)果表明，SS-RNase Ⅲ作為一種內(nèi)切核糖核酸酶發(fā)揮作用同樣需要金屬離子的輔助，而且在不同金屬離子體系和反應(yīng)濃度條件下均顯著影響SS-RNase Ⅲ對 RNA 1.1催化切割位點(diǎn)的偏好性。

注：A.控制反應(yīng)體系pH值不變，添加不同濃度Mg2+(0.1、1、5、10、50、100 mmol/L)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化；B.控制反應(yīng)體系pH值不變，添加不同濃度Mn2+(0.1、1、5、10、50、100 mmol/L)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化。

2.6 不同pH值對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

在多種細(xì)菌研究中發(fā)現(xiàn)，不同的pH值可以作為影響RNase Ⅲ催化切割活性的因素，因此我們分析了SS-RNase Ⅲ的催化活性是否也受pH值的影響。結(jié)果如圖8A所示，在相同濃度Mg2+(10 mmol/L)不同pH條件下，SS-RNase Ⅲ催化切割RNA 1.1的位點(diǎn)出現(xiàn)不同。在酸性或中性條件中，SS-RNase Ⅲ更傾向于同時切割RNA 1.1的a以及b位點(diǎn)(28 nt大小的切割產(chǎn)物條帶更明顯)，表明在Mg2+催化下，不同pH值會影響SS-RNase Ⅲ對底物切割位點(diǎn)的偏好性。然而在相同濃度Mn2+(10 mmol/L)不同pH值條件下，如圖8B所示，SS-RNase Ⅲ僅在酸性及中性環(huán)境中表現(xiàn)出較高的催化切割活性，在弱堿性環(huán)境中的催化活性并不突出，且隨著pH值升高其催化切割活性逐漸消失。在相同的酸性環(huán)境條件下，比較不同金屬離子Mn2+與Mg2+條件下RNase Ⅲ對RNA 1.1的切割位點(diǎn)的偏好，與添加相同濃度Mg2+相比，在金屬離子Mn2+催化作用下，SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1的催化切割更偏好b位點(diǎn)(圖8)。研究表明SS-RNase Ⅲ發(fā)揮作用時，不同pH值顯著影響了RNase Ⅲ對雙鏈特異性RNA的催化切割位點(diǎn)的偏好性。

注：A.Mg2+濃度為10 mmol/L，在不同pH值(5、6、7、8、9、10)下分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化；B.Mn2+濃度為10 mmol/L，在不同pH值(5、6、7、8、9、10)下分別作用0、15、45 min檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化。

2.7 SS-RNase Ⅲ對dsRNA的特異性切割作用

為了更深入地探究SS-RNase Ⅲ的催化特征，利用化學(xué)合成單鏈或雙鏈RNA催化底物，包括2個單鏈RNA(ssRNA)：16 mer ssRNA和30 mer ssRNA，以及3種雙鏈RNA：16：16 dsRNA、30：16 dsRNA及30：30 dsRNA。在最佳催化反應(yīng)體系(10 mmol/L Mg2+，pH=7)中添加這5種催化底物，分析SS-RNase Ⅲ催化切割能力。結(jié)果如圖9所示，SS-RNase Ⅲ無法催化切割單鏈RNA(16 mer ssRNA和30 mer ssRNA)，以及底物長度為16 bp的dsRNA(16：16 dsRNA、30：16 dsRNA)，但SS-RNase Ⅲ能夠充分切割長度為30 bp的dsRNA(30：30 dsRNA)，并將其切割成特定的分解產(chǎn)物。以上結(jié)果表明SS-RNase Ⅲ對RNA底物的切割具有雙鏈特異性，且催化切割dsRNA的最小長度要求與已研究報道過的大腸桿菌同源RNase Ⅲ也略有不同。

注：在最適反應(yīng)條件(Mg2+10 mmol/L、pH=7)下分別作用0、15、45、90 min，檢測SS-RNase Ⅲ對不同長度RNA底物(16 mer ssRNA、30 mer ssRNA、16：16 dsRNA、30：16 dsRNA、30：30 dsRNA)的催化活性。

2.8 SS-RNase Ⅲ對不同內(nèi)源性RNA催化切割特性

研究表明細(xì)菌RNase Ⅲ具有降解或加工多種內(nèi)源性RNA(如rRNA、tRNA和mRNA等)的功能[4]。因此，為了驗證SS-RNase Ⅲ對自身編碼的內(nèi)源性RNA催化切割特性，本試驗通過體外轉(zhuǎn)錄的方式獲取多種豬鏈球菌內(nèi)源性RNA，包括1種rRNA(5S rRNA)、2種tRNA(tRNAtyr、tRNAser)以及2種mRNA(rnc、rng)。結(jié)果如圖10所示，在最適催化條件下(Mg2+10 mmol/L、pH=7)，SS-RNase Ⅲ對2種tRNA轉(zhuǎn)錄本催化切割效率較弱，可充分催化切割mRNA(rnc)，難以切割mRNA(rng)，對5S rRNA具有一定催化能力。以上結(jié)果表明SS2多種內(nèi)源性RNA轉(zhuǎn)錄本受SS-RNase Ⅲ催化切割能力影響且具有不同的催化效率。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明核糖核酸酶Ⅲ作為細(xì)菌全局性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的催化因子[20]，具有識別并切割dsRNA的功能，在多種細(xì)菌中被認(rèn)為是病原菌致病過程的一種關(guān)鍵因素[21]。RNase Ⅲ作為一種在細(xì)菌中廣泛存在的金屬離子依賴性的雙鏈特異性內(nèi)切核糖核酸酶，在細(xì)菌的生命活動及致病過程中具有重要作用，但只在少數(shù)細(xì)菌中如大腸桿菌進(jìn)行了表征和功能研究[22]，并且目前還沒有對于豬鏈球菌RNase Ⅲ的深入研究。本研究對來自豬鏈球菌2型的RNase Ⅲ同源物進(jìn)行了表征及催化特性分析。

研究發(fā)現(xiàn)SS-RNase Ⅲ與已有報道的大腸桿菌RNase Ⅲ催化特性部分相似[23]，只有Mg2+或Mn2+可以輔助SS-RNase Ⅲ對底物的催化作用，而Ca2+同樣不支持催化作用，推測可能與Ca2+具有較大的半徑和不同的配體配位特性有關(guān)[24]。與苜蓿中華根瘤菌RNase Ⅲ[4]不同的是，更高濃度(>5 mmol/L)的Mn2+反而抑制了SS-RNase Ⅲ的催化活性，并且SS-RNase Ⅲ似乎更依賴Mg2+的輔助催化作用；而與苜蓿中華根瘤菌RNase Ⅲ類似的是，Mn2+使得SS-RNase Ⅲ對b位點(diǎn)切割更具有專一性。值得注意的是，在其他研究中發(fā)現(xiàn)金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+等)的存在可能會導(dǎo)致非特異性切割位點(diǎn)的產(chǎn)生[4，25-26]，因此推測，結(jié)果中出現(xiàn)的某些非特異性切割產(chǎn)物可能是反應(yīng)體系中存在的Mg2+或Mn2+將RNA底物片段化所產(chǎn)生的?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)證實了SS-RNase Ⅲ在模式底物RNA 1.1上具有嚴(yán)格金屬輔因子依賴性。此外，細(xì)胞內(nèi)pH值變化可以影響酶活性，在布魯菌或芽胞桿菌中，RNase Ⅲ只有在pH值大于7的堿性緩沖液環(huán)境中才能表現(xiàn)催化活性[25，27]，然而在Mn2+催化條件下，SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1的催化活性則會隨著堿性逐漸加強(qiáng)而消失，因此推測金屬離子在不同酸堿環(huán)境下調(diào)節(jié)SS-RNase Ⅲ活性可能有助于細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境脅迫。此外不同pH值催化條件下，SS-RNase Ⅲ的底物切割產(chǎn)物也存在差異，因此猜測酸堿環(huán)境的變化可能影響了SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1切割位點(diǎn)的偏好性。RNase Ⅲ已被證明能夠在體外切割具有雙鏈特征的RNA，包括細(xì)菌自身編碼或非編碼的RNA[28]，在大多數(shù)細(xì)菌如苜蓿中華根瘤菌及大腸桿菌中，RNase Ⅲ僅能降解dsRNA，并且對內(nèi)源性RNA底物表現(xiàn)出不同的偏好[4]，而毛霉菌RNase Ⅲ還可切割單鏈RNA[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌RNase類似，SS-RNase Ⅲ不能切割外源性的ssRNA，能夠有選擇性地催化切割dsRNA，并且針對不同類型的豬鏈球菌內(nèi)源性RNA(rncmRNA、rngmRNA、5S rRNA和tRNA)具有不同的切割效率，表明SS-RNase Ⅲ對內(nèi)源性的多種RNA轉(zhuǎn)錄本的加工存在差異性，可為該酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

綜上所述，本研究通過克隆純化得到的SS-RNase Ⅲ具有與其他細(xì)菌RNase Ⅲ家族成員相似的催化特征，通常以二聚體的形式存在，具有較嚴(yán)格的金屬輔助因子依賴性，能夠識別并催化切割部分特定的dsRNA結(jié)合基序。然而，在催化反應(yīng)條件或催化RNA底物不同時，豬鏈球菌RNase Ⅲ與其他種類細(xì)菌RNase Ⅲ的催化特性存在差異。以上結(jié)果為進(jìn)一步探究RNase Ⅲ在豬鏈球菌中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)，也為了解RNase Ⅲ在細(xì)菌中的催化特性提供了參考依據(jù)。