大片吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆表達(dá)和免疫原性分析

姚文浩，吳興隆，秦志博，李文豪，朱惠麗，王磊，胡建和，韓艷輝

(河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

片形吸蟲病是大片吸蟲(Fasciolagigantica)和肝片吸蟲(Fasciolahepatica)寄生于反芻動物和人的肝臟、膽管中引起的一種人獸共患寄生蟲病[1-2]。片形吸蟲病是一種食源性寄生蟲病，人類是偶感宿主，通過飲用受污染的水或水生植物而感染。該病影響全球超過75個國家的240萬人，感染了全球數(shù)百萬反芻動物，每年造成超過30億美元的經(jīng)濟(jì)損失[3]。近年來，農(nóng)田灌溉面積擴(kuò)大、濕地改造等人為活動使片形吸蟲病的感染率呈上升趨勢[4]，世界衛(wèi)生組織將其歸類為一種被忽視的熱帶疾病[5]。目前，三氯苯達(dá)唑(TCBZ)是治療片形吸蟲病的首選藥物，然而過度使用會導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，荷蘭、智利、土耳其和秘魯?shù)鹊鼐霈F(xiàn)了抗TCBZ蟲株，這對該病的預(yù)防和控制產(chǎn)生了巨大影響[6]，開發(fā)新的抗片形吸蟲病疫苗候選分子迫在眉睫。

大片吸蟲主要依賴糖酵解獲取能源賴以生存[7]，而磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)是糖酵解過程中必不可少的酶，它可以將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛[8]。TPI作為糖酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于各類生物中，科學(xué)家已從多種生物體中克隆并成功表達(dá)出該基因[9]。有研究顯示，TPI可用于開發(fā)藥物或疫苗，不僅用于克服華支睪吸蟲病，還包括其他人畜共患的蠕蟲病[10]。目前，對大片吸蟲TPI(FgTPI)的研究微乎其微。本試驗以大片吸蟲的TPI為研究對象，對該基因的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析，為評價其作為抗大片吸蟲病疫苗候選分子的潛在能力，以及深入研究FgTPI的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、實驗動物

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)和大片吸蟲cDNA模板均由河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院實驗室保存；6周齡SPF級BALB/c雄性小鼠購自河南斯克貝斯生物有限公司。

1.2 主要試劑和酶

DNA凝膠回收試劑盒(離心柱型)、高純度質(zhì)粒DNA小提試劑盒(離心柱型)、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)志物均購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni Sepharose excel購自美國General Electric公司。酶活性測定試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.FgTPI PCR產(chǎn)物。

1.3 引物的設(shè)計與合成

參照NCBI收錄的肝片吸蟲基因(No.KC164346.1)核苷酸序列，通過軟件設(shè)計含有限制性酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ的引物，引物由TaKaRa生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 目的基因的克隆

以大片吸蟲的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。凝膠電泳鑒定并回收目的片段。目的片段與pMD19-T連接過夜，按照轉(zhuǎn)化說明書將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，PCR鑒定并測序。

1.5 FgTPI基因的序列測定及生物信息學(xué)分析

對鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用BLAST軟件進(jìn)行基因序列分析，并進(jìn)行序列相似性比較。運用在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protscale/)對FgTPI蛋白序列進(jìn)行親疏水性分析，并在網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)上進(jìn)行參數(shù)分析，最后利用在線網(wǎng)站(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。運用DNAStar軟件分析FgTPI的蛋白分子量和理論等電點(PI)。

1.6 重組質(zhì)粒FgTPI-pET-28a(+)的構(gòu)建

對1.4中的測序正確樣品提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切，并與雙酶切的pET-28a(+)質(zhì)粒16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒FgTPI-pET-28a(+)。

1.7 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的純化

按照轉(zhuǎn)化說明書將1.6中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切及測序鑒定正確后，大量擴(kuò)增，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。獲得可溶性重組蛋白rFgTPI，用 Ni Sepharose excel 進(jìn)行蛋白的純化，SDS-PAGE驗證純化效果。

1.8 動物免疫與免疫血清制備

選擇6周齡SPF級BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分成3組，分別為免疫組(FgTPI-Adjuvant)、佐劑對照組(206-Adjuvant)和空白對照組(PBS)。免疫組每次每只注射100 μL含206佐劑和20 μg純化的重組蛋白rFgTPI的乳化劑；佐劑對照組每次每只注射100 μL 含206佐劑和PBS的乳化劑；空白對照組每次每只注射100 μL的PBS。3組均腹腔注射，每隔1周免疫1次，共免疫3次。小鼠免疫之前(陰性血清)以及每次免疫之后1周采血，分離并收集血清，備用。

1.9 重組蛋白的Western blot分析

將10 μg重組蛋白rFgTPI進(jìn)行SDS-PAGE，后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入0.5%的PBST-脫脂奶粉，4 ℃封閉過夜。隨后分別與感染大片吸蟲羊的血清(1∶500)、未感染的陰性血清(1∶500)共孵育，室溫靜置2 h，PBST洗滌3次，與兔抗羊IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，用自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

1.10 ELISA檢測特異性IgG抗體水平

以純化的重組蛋白rFgTPI為抗原包被ELISA板，以1.8中制備的免疫血清為一抗，檢測3組小鼠免疫前后血清中抗rFgTPI特異性抗體IgG的效價變化。以包被緩沖液稀釋抗原濃度至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃ 過夜。用PBST洗滌3次后，每孔加入150 μL PBST-1.5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，每孔加入100 μL被檢血清(1∶100)，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次，加入羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，然后加入可溶性TMB底物100 μL，避光顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔)終止反應(yīng)，用BioTek公司的酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

1.11 重組蛋白的酶活性分析

采用α-磷酸甘油脫氫酶偶聯(lián)法對該重組蛋白進(jìn)行酶活性研究[11]，偶聯(lián)反應(yīng)式如下：

反應(yīng)的溶液為TE緩沖液(100 mmol/L三乙醇胺，10 mmol/L EDTA)添加0.2 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，0.9個單位的α-磷酸甘油脫氫酶(α-GDH)和1 mmol/L D型甘油醛-3-磷酸(GAP)。加入5 ng/mL的FgTPI開始反應(yīng)。以質(zhì)粒pET-28a(+)作為陰性對照。

1.11.1 pH值對酶活性的影響

調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值依次為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。分別測定上述反應(yīng)體系在各個pH條件下3 min內(nèi)340 nm處吸光度的變化情況。

1.11.2 溫度對酶活性的影響

選用20、25、30、35、40、45和50 ℃共7個溫度點，分別測定上述反應(yīng)體系在各溫度條件下3 min內(nèi)340 nm處吸光度的變化情況。

1.11.3 動力學(xué)參數(shù)測定

反應(yīng)混合物的最終體積為1 mL的TE緩沖液，含有GAP(1 mmol/L)、NADH(0.2 mmol/L)、0.9單位的α-GDH和5 ng/mL的FgTPI。通過在最佳溫度和最佳pH值下改變GAP濃度 (0～3 mmol/L)，測量初始速度，然后采用雙倒數(shù)法作圖，確定GAP的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度。

2 結(jié)果

2.1 FgTPI基因擴(kuò)增

PCR克隆基因FgTPI，DNA凝膠電泳顯示，在762 bp處可見明顯片段(圖1)。

2.2 相似物種TPI的BLAST分析

選擇分別來自肝片吸蟲(Fasciolahepatica，簡稱FhTPI)253 aa (GenBank：AGJ83762.1)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus，簡稱HcTPI)247 aa(GenBank：ADR66027.1)，日本血吸蟲(Schistosomajaponicum,簡稱SjTPI)252 aa(GenBank:AAC47855.1),曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni,簡稱SmTPI)252 aa(GenBank:XP_018647623.1),馬來絲蟲(Brugiamalayi,簡稱BmTPI) 247 aa (GenBank:XP_001897269.1)，秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans，簡稱CelTPI)247 aa(GenBank：NP_001366651.1)和人(Homosapiens，簡稱HsTPI)249 aa(GenBank：AAH17917.1)7個物種的TPI與所得大片吸蟲的TPI序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示FgTPI編碼的氨基酸序列與其他物種TPI基因相似性分別為99.60%(肝片吸蟲)、68.25%(人)、67.86%(血吸蟲)。用DNAStar軟件將該ORF所編碼的氨基酸序列與上述GenBank中已經(jīng)公布的其他物種的TPI氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有TPI活性功能位點序列AYEPVWAIGTG(圖2)。

A.二級結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞抗原表位分析；B.疏水性分析；C.三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2.3 FgTPI基因編碼蛋白的分析

FgTPI基因開放閱讀框為762 bp，編碼253個氨基酸，如圖3A所示。分析FgTPI的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白以α螺旋為主，分別位于24～32、51～63、81～85、105～121、127～161、185～198、216～228、240～247；β折疊相對α螺旋較少，主要位于37～50、90～95、99～104、116～126、162～174、203～211；β轉(zhuǎn)角區(qū)較少；較長的無規(guī)則卷曲分別位于13～19、176～181。結(jié)合柔性區(qū)域和表面可及性的預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)gTPI蛋白主要含有6個線性B細(xì)胞抗原表位，分別位于氨基酸序列的第3～5、16～20、86～88、178～184、229～231、250～253位。此外，對目的蛋白親疏水性(圖3B)以及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖3C)均進(jìn)行了分析。

DNAStar分析顯示,該蛋白分子量為27 794.81 Da,理論等電點pI為8.07。

2.4 重組質(zhì)粒FgTPI-pET-28a(+)的鑒定

重組質(zhì)粒FgTPI-pET-28a(+)酶切鑒定分別能得到762 bp的目的基因和相應(yīng)大小的重組質(zhì)粒片段，說明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功 (圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；1.BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切FgTPI-pET-28a(+)質(zhì)粒；2.未酶切的FgTPI-pET-28a(+)質(zhì)粒。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未純化的 rFgTPI；2.純化后的rFgTPI。

2.5 rFgTPI純化

大量擴(kuò)增的重組菌菌液OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)6 h，此時上清液表達(dá)量最高。菌液12 000 r/min離心20 min，收取上清液，用Ni Sepharose excel純化柱進(jìn)行蛋白純化。SDS-PAGE分析表明，在上清液中收集到了重組蛋白 rFgTPI(圖5)。

2.6 重組蛋白的Western blot分析

將重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE之后進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，用感染大片吸蟲的羊血清作為一抗時，32 kDa處有一明顯的識別條帶，而陰性對照組在32 kDa處未有條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性(圖6)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.一抗為大片吸蟲感染羊的血清；2.一抗為陰性血清。

2.7 小鼠血清抗rFgTPI蛋白特異性抗體的檢測

ELISA檢測3組小鼠免疫前后血清中抗體IgG的效價變化。結(jié)果顯示，重組蛋白一免、二免、三免后特異性抗體水平較206佐劑組和空白對照組顯著升高(P<0.01)，在三免后其抗體水平達(dá)到最大值；而佐劑對照組和空白對照組血清中抗rFgTPI的特異性IgG抗體水平均未出現(xiàn)明顯變化(圖7)。

圖7 ELISA檢測小鼠抗rFgTPI特異性IgG抗體水平

2.8 酶活性的測定

采用α-磷酸甘油脫氫酶偶聯(lián)法對rFgTPI進(jìn)行酶活性的測定，并進(jìn)一步研究了pH值和溫度對其活性的影響。結(jié)果顯示(圖8)，重組蛋白rFgTPI具有一定的TPI活性，其酶促反應(yīng)最佳pH值為7.5，最佳溫度為35 ℃；pET-28a(+)空載體蛋白不具有TPI活性。

圖8 pH值(a)和溫度(b)對TPI酶活性的影響

酶促反應(yīng)動力學(xué)結(jié)果顯示，米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度分別為(0.57±0.1)mmol/L和3 102.4 mmol/(min·L)。

3 討論

隨著現(xiàn)代社會的進(jìn)步，人們對糧食的需求不斷提高，綠色食品、人與自然和諧共存的概念已成為當(dāng)今時代的主流，因此，大片吸蟲病作為一種重要的食源性疾病引起了人們的廣泛關(guān)注[12]。吸蟲感染是許多發(fā)展中國家人類殘疾和死亡的主要原因，并且仍然是 21 世紀(jì)醫(yī)學(xué)面臨的最重要挑戰(zhàn)之一[7]。診斷片形吸蟲病有2種常見的方法：一種是依賴于被屠宰動物肝組織中成蟲的宏觀鑒定，另一種是基于糞便樣本中寄生蟲蟲卵的顯微鏡檢測。然而，這2種方法準(zhǔn)確性較低且具有一定的缺點：第1種方法局限性在于不能應(yīng)用于人類疾病的檢測；第2種方法的缺點在于直到感染晚期才能檢測到蟲卵，而且蟲卵會間歇性地從膽管中分泌出來[13]。近年來，與糞便標(biāo)本的常規(guī)顯微鏡檢查相比，免疫學(xué)技術(shù)變得更加敏感和特異，并且更受青睞[14]。TCBZ為苯并咪唑類中專用于治療片形吸蟲病的藥物，對片形吸蟲有明顯驅(qū)殺效果，對牛和鹿大片吸蟲病等均有效[15]。然而，TCBZ耐藥性蟲株的出現(xiàn)給本病的防治帶來了極大困難，因此，對單一藥物治療大片吸蟲病的依賴性是該病未來面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。尋求抗大片吸蟲病候選疫苗成為一種新的治療方法。

TPI是糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵酶，幾乎存在于所有類型的細(xì)胞中[16]。在高等動物中缺乏TPI酶可能會引起溶血性貧血，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致生物個體死亡。目前，在生物體內(nèi)，TPI的酶學(xué)活性沒有其他酶類可以替代。TPI屬于較古老的一類酶家族，其在真核原核分化之前就已經(jīng)形成[17]。本文成功地克隆了FgTPI基因，并且重組質(zhì)粒FgTPI-pET-28a(+)在大腸桿菌中呈現(xiàn)可溶性表達(dá)。運用BLAST對比，F(xiàn)gTPI與肝片吸蟲TPI的基因相似度高達(dá)99.60%。生物信息學(xué)分析顯示，該重組蛋白B細(xì)胞抗原表位較多，表達(dá)的分子量為27 794.81 Da，理論等電點pI為8.07。TPI的酶活性位點附近的殘基序列具有很高的保守性，目前已知的TPI都具有高度保守的序列特征[17]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gTPI活性功能位點序列為AYEPVWAIGTG。

目前，TPI在血吸蟲的研究中較為深入，被WHO/TDR推薦為曼氏血吸蟲病的6種候選抗原基因之一[18]。Shomemaker等[19]從曼氏血吸蟲中分離出一段與TPI序列同源的全長cDNA，并在大腸桿菌中表達(dá)了SmTPI，通過免疫親和純化可溶性表達(dá)產(chǎn)物，又進(jìn)一步證明該表達(dá)產(chǎn)物具有TPI活性，且能被具有免疫保護(hù)作用的單克隆抗體(McAb)M.1所識別，說明SmTPI是非常有前景的血吸蟲候選疫苗。此外，日本血吸蟲TPI已經(jīng)被成功地克隆并表達(dá)。Dai等[20]和Zhu等[21]克隆并優(yōu)化了日本血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶(SjTPI)的密碼子，同時構(gòu)建了不同類型的疫苗，包括DNA疫苗(pcDNA3.1-SjTPI、pcDNA3.1-SjTPI.opt)、重組蛋白疫苗(rSjTPI)和重組腺病毒疫苗(rAdV-SjTPI.opt)，均誘導(dǎo)了很好的減蟲率和減卵率。本試驗Western blot結(jié)果顯示，重組抗原 rFgTPI 具有較好的抗原性；ELISA結(jié)果指出，與佐劑對照組和空白對照組相比，rFgTPI誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了較高水平的特異性IgG抗體，推測重組蛋白在宿主體內(nèi)可以誘導(dǎo)一定的免疫保護(hù)效果，為以后的動物免疫保護(hù)試驗及DNA疫苗的制備提供依據(jù)。

TPI可以催化3-磷酸甘油醛與二羥丙酮磷酸之間的可逆反應(yīng)，這一轉(zhuǎn)換過程存在于幾乎所有包括三糖磷酸脂代謝途徑中，如糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑及脂肪酸的生物合成等[22]。關(guān)于TPI的酶活性分析，α-磷酸甘油脫氫酶偶聯(lián)法是常用的一種研究該酶活性的方法，本試驗運用此方法對rFgTPI進(jìn)行了酶活性測定，結(jié)果顯示，F(xiàn)gTPI酶活性測定的最佳反應(yīng)條件為pH=7.5、溫度35 ℃，而陰性對照pET-28a(+)并未顯示有TPI的活性；酶促反應(yīng)動力學(xué)分析顯示，米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度分別為(0.57±0.1)mmol/L和3 102.4 mmol/(min·L)。本試驗結(jié)果與之前報道的其他物種TPI的酶活性分析有一定的相似性，例如，肝片吸蟲TPI(pH =7.6，37 ℃)[23]，日本血吸蟲TPI (pH=7.5，37 ℃)[24]，賈第蟲TPI (pH=7.4，25 ℃)[25]，豬帶絳蟲TPI (pH=7.5，25 ℃)[26]和尖孢鐮刀菌TPI (pH=8.0，37 ℃)[27]。

綜上所述，本文成功克隆表達(dá)了FgTPI，并對其抗原性進(jìn)行了初步分析，為深入研究rFgTPI 的生物學(xué)功能及評價其作為大片吸蟲病疫苗候選的潛力奠定基礎(chǔ)。