豬流行性腹瀉病毒解旋酶Nsp13表達(dá)純化及其RNA解旋活性鑒定

沈熹涓，姬晶晶，金慧琴，李宇哲，劉斐，單衍可

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高流行性、高死亡率傳染病，患病豬的主要癥狀為腹瀉、嘔吐和脫水，任何年齡段豬均可感染[1]，其中1周齡以內(nèi)仔豬受影響最大，其癥狀最為嚴(yán)重，病死率最高[2]。PED于1971年在英國首次發(fā)現(xiàn)，并在1982年被正式命名，多個(gè)國家及我國南方省份均有PED大規(guī)模暴發(fā)的記錄，給國內(nèi)外的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失和打擊[3-4]。

PEDV是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科α冠狀病毒屬[5]，基因組全長約為28 kb，編碼2個(gè)開放閱讀框(ORF)1a和1b，能夠分別被翻譯成多聚蛋白1a (pp1a)和多聚蛋白1ab (pp1ab)，并被病毒蛋白酶加工成16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，共同參與基因組的轉(zhuǎn)錄[6-7]。其中，PEDV Nsp13是一種屬于1超家族(SF1)的解旋酶，高度保守，能夠以NTP依賴的方式以及5′→3′的極性解開雙鏈DNA或RNA，是重要的抗病毒藥物設(shè)計(jì)潛在靶點(diǎn)[8]。

病毒的RNA解旋酶在其他病毒的研究中已被廣泛證實(shí)能夠在RNA合成過程中起到關(guān)鍵作用，能夠參與病毒的復(fù)制，還能夠刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[9-11]，但PEDV Nsp13是否存在以上特點(diǎn)尚待研究。Ren等[8]研究證實(shí)了PEDV Nsp13的5′→3′雙鏈DNA和RNA解旋極性，且在體外對(duì)雙鏈DNA的解旋能力高于雙鏈RNA。然而迄今為止，針對(duì)PEDV Nsp13的可溶性表達(dá)純化及其RNA解旋活性的研究仍然較少。

本文利用大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)PEDV Nsp13進(jìn)行可溶性表達(dá)，并利用鎳親和層析技術(shù)對(duì)該蛋白進(jìn)行純化及其條件優(yōu)化，得到了0.9 mg/mL PEDV Nsp13蛋白，驗(yàn)證了其具有RNA解旋活性，并比較了相同時(shí)間內(nèi)不同溫度條件下的解旋效果，為進(jìn)一步深入研究PEDV Nsp13的RNA解旋作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種

參考GenBank提供的PEDV (JX188454.1)中Nsp13基因序列，委托通用生物(安徽)股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化、合成及構(gòu)建。pET28a(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。Trans5α與Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 RNA單鏈

參考Ren等[8]與Shu等[12]對(duì)RNA底物的設(shè)計(jì)，并對(duì)RNA鏈中存在的能夠造成自身互補(bǔ)序列及二硫鍵序列進(jìn)行調(diào)整。RNA1序列：5′-(Cy5)CAUAC-AGUACAGGGAUCACCUCAGUUCGACUAUCGAGUAAUC-3′，RNA2序列：5′-GAUUACUCGAUAGUCGAA-CUGAGG-3′，trap RNA序列：5′-CCUCAGUUCGACUAUCGAGUAAUC-3′。上述序列均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

蛋白Marker (180 kDa)與ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海源葉生物科技有限公司，BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐變性劑型)、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RNase抑制劑、ATP及脫脂奶粉購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗His抗體購自Proteintech公司，HRP-羊抗鼠IgG購自蘇州博奧龍科技有限公司，硝酸纖維素(NC)膜購自Cytiva公司，透析袋(截留分子量14 kDa)購自上海翊圣生物科技有限公司，二硫蘇糖醇(DTT)購自北京索萊寶科技有限公司，DEPC購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，NaCl與MgCl2購自國藥集團(tuán)上海有限公司，SpectraTM多色寬范圍蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo Fisher公司。

1.1.4 主要儀器

NanoDrop One超微量分光光度計(jì)、生物安全柜、低溫?fù)u床及恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司，高速離心機(jī)與渦旋振蕩儀購自Eppendorf公司，垂直電泳儀購自Bio-Rad公司，轉(zhuǎn)印儀購自上海天能科技有限公司，多功能成像儀與Typhoon多功能激光掃描儀購自Cytiva公司，掃描儀購自Epson公司，恒溫?fù)u床購自Crystal公司，超聲波細(xì)胞破碎儀購自南京先歐儀器制造有限公司，多功能酶標(biāo)儀購自Tecan公司，恒溫金屬浴購自上海米歐儀表機(jī)械制造有限公司，垂直電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 PEDV Nsp13重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化液涂布于卡那霉素抗性的LB固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落接種到卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，將菌液送至通用生物(安徽)股份有限公司測序，其測序結(jié)果與GenBank中PEDV(JX188454.1)的Nsp13序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 PEDV Nsp13蛋白的可溶性表達(dá)

將pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，隨后將重組菌Transetta (DE3)/pET28a(+)-PEDV Nsp13接種于卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，以1∶100比例轉(zhuǎn)接至200 mL卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)16 h。8 000 r/min離心15 min收集菌體，用20 mL的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸菌體后，進(jìn)行超聲破碎(350 W，工作3 s，間歇6 s)，至菌液澄清。8 000 r/min離心15 min，分別收集上清液與沉淀，取一半上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。以上樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.4 PEDV Nsp13蛋白純化及條件優(yōu)化

依次使用ddH2O和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗鎳親和層析柱，將大量表達(dá)的PEDV Nsp13蛋白所在上清液自由流穿層析柱。用含0、10、20、50、100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液依次洗脫雜蛋白，再依次用200、300、500 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白，并采用10% SDS-PAGE分析其純化效果。

在上述條件未能得到較好純化效果的前提下，對(duì)鎳親和層析純化上樣速度進(jìn)行優(yōu)化。清洗層析柱后，將上清液流穿層析柱的速度由自由流穿降至1 min/mL，再用含0、10、20、50、100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液依次洗脫雜蛋白，最后，依次用200、300、500 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白，采用10% SDS-PAGE分析其純化效果。

1.5 蛋白樣品的透析

剪取適當(dāng)長度的透析袋(截留分子量為14 kDa),煮沸冷卻后加入純化的目的蛋白，將透析袋置于500 mL不含咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，置于磁力攪拌器上，4 ℃下低速旋轉(zhuǎn)透析過夜。

1.6 蛋白濃度測定

將純化透析后的蛋白樣品，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒，在562 nm波長下進(jìn)行可見光吸收光譜測定，根據(jù)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品濃度。

1.7 SDS-PAGE及Western blot鑒定

將誘導(dǎo)后Transetta (DE3)/pET28a(+)和純化透析后的蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色及脫色后進(jìn)行成像。將上述樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)印至NC膜，隨后用5%脫脂奶于37 ℃封閉1 h；PBST洗滌5次，鼠源His抗體(1∶20 000稀釋)4 ℃孵育過夜；PBST洗滌5次，HRP-羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h；PBST洗滌5次，最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色，使用多功能成像儀成像，從而驗(yàn)證PEDV Nsp13的正確表達(dá)和純化。

1.8 RNA底物的設(shè)計(jì)與制備

設(shè)計(jì)1對(duì)單鏈RNA序列(RNA1/RNA2)，構(gòu)建體外RNA退火體系：10 mmol/L Tris，20 mmol/L NaCl，pH=7.5。RNA1與RNA2在此體系中經(jīng)金屬浴95 ℃孵育5 min后冷卻至室溫，RNA1部分序列可以和RNA2全部序列退火為雙鏈，形成具有5′-overhang結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，Cy5為熒光分子。

為避免解開的雙鏈RNA (RNA1/RNA2)自動(dòng)退火為雙鏈，本研究設(shè)計(jì)1段trap RNA序列，該序列與RNA2序列反向互補(bǔ)，可與熒光標(biāo)記的RNA1競爭結(jié)合RNA2序列。

1.9 PEDV Nsp13解旋活性鑒定

構(gòu)建體外解旋反應(yīng)體系(10 μL)：30 mmol/L Tris (pH=7.5)，0.1 mg/mL BSA，1%甘油，3 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT，4 U/μL RNase抑制劑，4 nmol/L dsRNA，8 nmol/L trap RNA，3 mmol/L ATP，60 nmol/L PEDV Nsp13。將上述液體混合后置于16 ℃反應(yīng)10 min，與等體積的2×終止緩沖液(50 mmol/L EDTA·Na2·2H2O、1% SDS、10%甘油)混合后置于冰上，經(jīng)10%非變性PAGE電泳3 h后，用Typhoon多功能激光掃描儀成像分析。

1.10 溫度對(duì)解旋活性的影響

根據(jù)1.9節(jié)構(gòu)建體外解螺旋反應(yīng)體系，將上述液體混合后分別置于16、25和37 ℃反應(yīng)10 min，與等體積的2×終止緩沖液混合后置于冰上，經(jīng)10%非變性PAGE分析3 h后，用Typhoon多功能激光掃描儀成像分析，并利用Image J軟件對(duì)解旋幅度進(jìn)行定量分析，利用GraphPad軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 PEDV Nsp13可溶性表達(dá)效果

經(jīng)生物公司測序，測序結(jié)果與GenBank中PEDV (JX188454.1)的Nsp13序列進(jìn)行比對(duì)，其氨基酸序列完全一致，表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-PEDV Nsp13構(gòu)建成功。

通過10% SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，含pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質(zhì)粒的大腸桿菌Transetta(DE3)通過IPTG誘導(dǎo)在70 kDa處有明顯條帶，大小與目的蛋白基本一致，且上清液中目的條帶較為明顯，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌液在此處無明顯條帶(圖1)。表明在該誘導(dǎo)表達(dá)條件下，PEDV Nsp13成功表達(dá)且可溶性表達(dá)效果較好。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.誘導(dǎo)前Transetta (DE3)菌體；2.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)菌體；3.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)上清液(過濾前)；4.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)上清液(過濾后)；5.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)沉淀。

2.2 PEDV Nsp13鎳親和層析純化及條件優(yōu)化

對(duì)上清液中大量表達(dá)的PEDV Nsp13蛋白進(jìn)行鎳親和層析純化。10% SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)純化后目的蛋白條帶過淺，目的蛋白濃度過低(圖2)，純化仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.誘導(dǎo)前Transetta (DE3)菌體；2.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)菌體；3.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)沉淀；4.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)上清液；5.蛋白上樣流穿液；6～9.咪唑洗脫液濃度分別為0、10、20 和50 mmol/L；10～13.咪唑洗脫液濃度均為100 mmol/L；14～16.咪唑洗脫液濃度均為200 mmol/L；17～19.咪唑洗脫液濃度均為300 mmol/L；20.咪唑洗脫液濃度為500 mmol/L。

10% SDS-PAGE結(jié)果顯示，上樣速度優(yōu)化至1 min/mL，純化后在70 kDa附近有明顯單一條帶，且雜帶較少(圖3)。這一方案延長了目的蛋白His標(biāo)簽與鎳親和層析柱的結(jié)合時(shí)間，有效增強(qiáng)了目的蛋白His標(biāo)簽與鎳離子的結(jié)合效果，從而在洗脫液中得到濃度更高的目的蛋白。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.誘導(dǎo)前Transetta (DE3)菌體；2.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)菌體；3.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)上清液；4.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)沉淀；5.蛋白上樣流穿液；6～8.咪唑洗脫液濃度分別為0、10和20 mmol/L；9～10.咪唑洗脫液濃度均為50 mmol/L；11～12.咪唑洗脫液濃度均為100 mmol/L；13～16.咪唑洗脫液濃度均為200 mmol/L；17～20.咪唑洗脫液濃度均為300 mmol/L；21.咪唑洗脫液濃度為500 mmol/L。

2.3 PEDV Nsp13純化鑒定及濃度測定

將純化得到的PEDV Nsp13蛋白進(jìn)行透析，從而去除絕大部分的咪唑，以避免咪唑殘留對(duì)后續(xù)解旋試驗(yàn)的影響。將透析后得到的蛋白樣品，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度測定，測定純化后的PEDV Nsp13蛋白濃度為0.9 mg/mL。對(duì)透析后收集到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定，結(jié)果顯示，在70 kDa附近有一明顯的特異性條帶(圖4)，表明通過前期試驗(yàn)，準(zhǔn)確得到了可溶性表達(dá)的PEDV Nsp13蛋白。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1.誘導(dǎo)后Transetta (DE3)/pET28a(+)；2.純化后的PEDV Nsp13。

綜上，通過在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)及純化條件的優(yōu)化，得到了較高純度的PEDV Nsp13蛋白，濃度為0.9 mg/mL。

2.4 PEDV Nsp13 RNA解旋活性的鑒定

對(duì)表達(dá)純化并透析后的PEDV Nsp13蛋白進(jìn)行解旋活性鑒定。經(jīng)95 ℃處理后的雙鏈RNA會(huì)變性為單鏈RNA，只有ATP或只有PEDV Nsp13的體系不能產(chǎn)生單鏈條帶。結(jié)果顯示，同時(shí)具有ATP和PEDV Nsp13的體系在16 ℃孵育10 min的條件下能夠產(chǎn)生單鏈條帶(圖5)，表明本研究可溶性表達(dá)純化得到的PEDV Nsp13具有ATP依賴的RNA解旋活性。

1.95 ℃處理對(duì)照；2.有ATP無PEDV Nsp13對(duì)照；3.有PEDV Nsp13無ATP對(duì)照；4.有ATP有PEDV Nsp13；黑色線段表示RNA鏈；五角星代表Cy5。

2.5 溫度對(duì)RNA解旋效果的影響

本研究設(shè)計(jì)了不同溫度條件下對(duì)PEDV Nsp13解旋效果的探究。使用Image J軟件分別對(duì)解旋幅度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在相同時(shí)間條件下，一定范圍內(nèi)的溫度升高能夠提升PEDV Nsp13的解旋幅度(圖6)。

A.非變性PAGE結(jié)果，其中泳道1為95 ℃處理對(duì)照，2為有ATP無PEDV Nsp13對(duì)照，3為有PEDV Nsp13無ATP對(duì)照，4為有ATP有PEDV Nsp13 (16 ℃)，5為有ATP有PEDV Nsp13 (25 ℃)，6為有ATP有PEDV Nsp13 (37 ℃)，黑色線段表示RNA鏈，五角星代表Cy5；B.解旋幅度趨勢圖。

3 討論

3.1 PEDV Nsp13可溶性表達(dá)與純化分析

本文利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PEDV Nsp13進(jìn)行可溶性表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有周期短、成本低、操作簡便、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白表達(dá)最常用的方法之一[13-14]。重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)經(jīng)常發(fā)生蛋白聚集，形成不可溶的、無活性的包涵體[15]，在純化過程中需要變性才能溶解，溶解后又需復(fù)性才能恢復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[16]，因此包涵體蛋白通常不具備蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和完整的生物功能。而PEDV Nsp13蛋白作為一種解旋酶，在上清液中的可溶性表達(dá)能夠使其在表達(dá)過程中避免形成錯(cuò)誤的空間三維結(jié)構(gòu)，從而避免了對(duì)其解旋酶活性的影響。

鎳親和層析技術(shù)作為一種常用的蛋白純化技術(shù)，其原理是填料中鎳離子與目的蛋白中的His標(biāo)簽存在特異性相互作用，當(dāng)二者結(jié)合后，再利用咪唑與目的蛋白中的His標(biāo)簽競爭鎳離子，從而使目的蛋白被洗脫。而在實(shí)際操作中，由于雜蛋白與填料中的鎳離子存在一定的非特異性結(jié)合，其結(jié)合效果往往低于目的蛋白His標(biāo)簽與鎳離子的特異性結(jié)合，因此常采用咪唑梯度洗脫的方式，使目的蛋白與雜蛋白在不同濃度的咪唑中被洗脫，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白與雜蛋白的分離。本研究在鎳親和層析純化環(huán)節(jié)，首先將目的蛋白所在上清液在重力作用下自由流穿鎳親和層析柱，并從低濃度到高濃度進(jìn)行咪唑濃度梯度洗脫，最終在洗脫液中得到的目的蛋白條帶較淺；通過對(duì)上清液流速的優(yōu)化，最終在流速1 mL/min的方案下，在洗脫液中得到了更大濃度的目的蛋白。該上樣流速既能夠避免目的蛋白與鎳離子結(jié)合時(shí)間過短，造成目的蛋白的損失，也能夠避免結(jié)合時(shí)間過長，造成雜蛋白非特異性結(jié)合效果增強(qiáng)，純化后蛋白樣品中雜蛋白濃度過大。

本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和鎳親和層析技術(shù)，經(jīng)過10% SDS-PAGE、Western blot及濃度測定，驗(yàn)證了該可溶性表達(dá)純化方案能夠得到0.9 mg/mL較高純度PEDV Nsp13蛋白，以便開展后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 PEDV Nsp13解旋活性分析

本研究中設(shè)計(jì)了1組單鏈RNA底物，使用Cy5熒光分子標(biāo)記其中1條RNA單鏈，退火后能夠形成5′-overhang結(jié)構(gòu)，通過10%非變性PAGE分離單鏈RNA與雙鏈RNA，并利用Typhoon多功能激光掃描儀采集信號(hào)并成像。由于熒光標(biāo)記單鏈RNA與退火形成的帶有熒光標(biāo)記的雙鏈RNA的相對(duì)分子質(zhì)量不同，在相同時(shí)間內(nèi)具有不同的遷移距離，可以直觀展現(xiàn)單雙鏈RNA的位置，并結(jié)合數(shù)據(jù)分析，能夠計(jì)算其退火或解旋的幅度。由于在試驗(yàn)過程中存在雙鏈RNA解旋后重新自動(dòng)退火的情況，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)造成較大影響，因此本研究設(shè)計(jì)了1條無熒光標(biāo)記的trap RNA，能夠競爭結(jié)合無熒光標(biāo)記的RNA2[17]，且不影響熒光單鏈的成像結(jié)果。

利用本研究可溶性表達(dá)純化的PEDV Nsp13蛋白，結(jié)合1組RNA底物的設(shè)計(jì)及1套體外解旋反應(yīng)體系的建立，發(fā)現(xiàn)PEDV Nsp13蛋白能夠解旋本研究設(shè)計(jì)并退火的5′-overhang RNA底物，驗(yàn)證了本研究表達(dá)純化的PEDV Nsp13蛋白具有RNA解旋活性，并且驗(yàn)證了PEDV Nsp13的5′→3′的RNA解旋極性，與Ren等[8]研究結(jié)果一致。

此外，本研究還對(duì)PEDV Nsp13蛋白與雙鏈RNA底物解旋在16、25和37 ℃溫度下解旋情況進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，在10 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，PEDV Nsp13的RNA解旋活性隨溫度的升高而升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究表達(dá)純化得到的PEDV Nsp13的RNA解旋活性。由于PEDV Nsp13是一種解旋酶，而酶類通常在其最適溫度下具有最佳的酶活性，因此可以推測，PEDV解旋酶Nsp13在RNA解旋過程中的反應(yīng)溫度越接近其最適溫度，相同時(shí)間內(nèi)的解旋幅度越大。從微觀角度考慮，溫度的升高使得反應(yīng)物分子熱運(yùn)動(dòng)加快，提高了單位時(shí)間的有效碰撞次數(shù)，并且能夠增加反應(yīng)物中活化分子數(shù)，使得解旋進(jìn)程加快，從另一個(gè)角度解釋了在相同時(shí)間內(nèi)解旋幅度提高的原因。

4 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)并純化得到了濃度為0.9 mg/mL的較高純度PEDV Nsp13蛋白，并通過1組RNA底物的設(shè)計(jì)以及1套體外解旋反應(yīng)體系的建立，驗(yàn)證了表達(dá)純化得到的PEDV Nsp13蛋白的RNA解旋酶活性，在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)相同時(shí)間內(nèi)16、25和37 ℃溫度條件下RNA解旋效果的比較，發(fā)現(xiàn)PEDV Nsp13蛋白R(shí)NA解旋酶活性在一定范圍內(nèi)隨解旋溫度的升高而提高。