鄧宇,趙瑞霞,李寶棟*,劉樹(shù)才,榮迪,阿拉坦莎,李巍巍,趙禹凱
(1.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所畜牧研究室,內(nèi)蒙古 赤峰 024000;2.巴林右旗農(nóng)牧業(yè)局農(nóng)牧技術(shù)推廣中心,內(nèi)蒙古 赤峰 025150)
赤峰市巴林右旗地處內(nèi)蒙古自治區(qū)中東部,為典型的農(nóng)牧交錯(cuò)帶肉羊養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)區(qū)域[1],養(yǎng)殖的綿羊既有常年發(fā)情、多胎的小尾寒羊,也有季節(jié)性發(fā)情、單胎的蒙古羊[2]。2013年以來(lái)孕激素陰道海綿栓+孕馬血清促性腺激素(PMSG)的綿羊同期發(fā)情處理方法雖然在本地區(qū)得到應(yīng)用,但春季受胎率仍下降明顯,不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。
近年來(lái)有關(guān)提高綿羊同期發(fā)情與人工授精效果的研究報(bào)道較多,田樹(shù)軍等[3]、辛?xí)粤岬萚4]都采用撤栓前注射PMSG,可顯著提高母羊的同期發(fā)情率和發(fā)情集中度。有多項(xiàng)研究表明,在母羊首次輸精時(shí)注射促黃體素釋放激素A3(LHRH-A3)可進(jìn)一步促進(jìn)排卵[5-7]。吳奇強(qiáng)等[8]和勞劍[9]在豬和牛精液中添加催產(chǎn)素(OXT),提高了母豬配種分娩率、窩均產(chǎn)活仔數(shù)、窩均總產(chǎn)仔數(shù)和母牛受胎率。
本試驗(yàn)以春季的小尾寒羊、蒙古羊?yàn)閷?duì)象,分析不同外源激素處理對(duì)兩個(gè)品種綿羊繁殖指標(biāo)、血液生殖激素濃度的影響,為改進(jìn)綿羊春季同期發(fā)情與人工授精的應(yīng)用效果提供參考。
試驗(yàn)所用小尾寒羊母羊?yàn)榘土钟移觳楦芍Z爾蘇木規(guī)?;B(yǎng)殖戶(hù)飼養(yǎng),采用定時(shí)飼喂、自由飲水、欄內(nèi)散放;蒙古羊母羊?yàn)榘土钟移煨腋V诽K木規(guī)?;B(yǎng)殖戶(hù)飼養(yǎng),采用放牧加補(bǔ)飼,歸牧?xí)r飲水。
2022年3—4月,選擇空懷、斷奶1 個(gè)月以上、體重45~55 kg、胎次為2~4胎的小尾寒羊母羊和蒙古羊母羊各120只,小尾寒羊、蒙古羊按不同外源激素處理分別隨機(jī)均分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10只,分組情況詳見(jiàn)表1。
表1 各試驗(yàn)組同期發(fā)情與人工授精方法
孕激素陰道海綿栓,氟孕酮(FGA)含量為45 mg/枚,由澳大利亞法佩斯制藥廠生產(chǎn);注射用PMSG(1 000 U/支),注射用LHRH-A3(25 μg/支),OXT注射液(20 U/支),均由寧波第二激素廠生產(chǎn)。
綿羊雌激素(E2)、孕激素(P4)、促黃體素生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)的ELISA檢測(cè)試劑盒均由上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn),采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
根據(jù)前期研究實(shí)踐,春季存在試情公羊不能檢出所有發(fā)情母羊的情況,為了不遺漏隱性發(fā)情母羊,所以對(duì)所有試驗(yàn)?zāi)秆蚨歼M(jìn)行了人工授精。各組同期發(fā)情與人工授精方法見(jiàn)表1。
小尾寒羊、蒙古羊每個(gè)重復(fù)組挑選5只母羊,根據(jù)前期研究實(shí)踐,分別于放栓當(dāng)天(第0天)上午(對(duì)試驗(yàn)?zāi)秆蜻M(jìn)行同期發(fā)情激素處理前),第13天下午(試驗(yàn)?zāi)秆蚣斜憩F(xiàn)發(fā)情時(shí))和第14天下午(試驗(yàn)?zāi)秆蚣信怕咽茉袝r(shí)),使用抗凝采血管頸靜脈采血10 mL,3 000 r/min離心30 min制備血漿后于-20 ℃保存。根據(jù)撤栓后48 h試情時(shí)母羊發(fā)情的情況,每個(gè)重復(fù)組挑選3只表現(xiàn)發(fā)情的母羊血漿,測(cè)定血漿中E2、P4、LH、FSH和GnRH濃度。
第3次人工授精后第37天,母羊站立保定,使用B超儀的線(xiàn)陣探頭進(jìn)行直腸孕檢,統(tǒng)計(jì)懷孕母羊數(shù)。
發(fā)情反應(yīng)率=發(fā)情母羊數(shù)/試驗(yàn)?zāi)秆驍?shù)×100%;同期受胎率=懷孕母羊數(shù)/輸精母羊數(shù)×100%,母羊是否懷孕以B超孕檢結(jié)果為準(zhǔn);同期妊娠率=妊娠母羊數(shù)/試驗(yàn)?zāi)秆驍?shù)×100%,母羊受孕并產(chǎn)羔作為認(rèn)定妊娠的依據(jù);產(chǎn)羔率=羔羊數(shù)/產(chǎn)羔母羊數(shù)×100%。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后,使用SPSS 20.0中單因素ANOVA的Duncan法進(jìn)行方差分析。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
由表2可知,對(duì)比發(fā)情反應(yīng)率,蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。對(duì)比同期受胎率,蒙古羊試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于其他3組(P<0.01)。對(duì)比同期妊娠率,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)I組(P<0.01)并顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05);蒙古羊試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.01)并顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。對(duì)比產(chǎn)羔率,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)。
表2 不同試驗(yàn)組母羊繁殖指標(biāo)對(duì)比 %
由表3血漿E2濃度檢測(cè)結(jié)果可知,放栓第13天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅱ組顯著低于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅲ組極顯著高于其他3組(P<0.01);放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)。蒙古羊在放栓后13 d和14 d,各組之間血漿E2濃度均無(wú)顯著差異。
表3 不同試驗(yàn)組母羊血漿E2和P4濃度對(duì)比 pg/mL
由表3血漿P4濃度檢測(cè)結(jié)果可知,放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05);蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
由表4血漿LH濃度檢測(cè)結(jié)果可知,放栓第13天,蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著低于對(duì)照組(P<0.01);放栓第14天,蒙古羊試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。小尾寒羊在放栓后13 d和14 d,各組之間血漿LH濃度均無(wú)顯著差異。
表4 不同試驗(yàn)組母羊血漿LH和FSH濃度對(duì)比 mU/mL
由表4血漿FSH濃度檢測(cè)結(jié)果可知,放栓第13天,蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ組極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05)。放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅰ組極顯著高于其他3組(P<0.01);蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于其他3組(P<0.01)。
由表5血漿GnRH濃度檢測(cè)結(jié)果可知,放栓第13天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05),極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.01);蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組極顯著低于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)。放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01);蒙古羊試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于對(duì)照組(P<0.05),極顯著低于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01),試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
表5 不同試驗(yàn)組母羊血漿GnRH濃度對(duì)比 mU/mL
綿羊同期發(fā)情與人工授精的處理方法通常是將孕激素陰道海綿栓與PMSG結(jié)合使用,馮建忠[10]指出,孕激素栓劑可抑制卵泡生長(zhǎng)發(fā)育,放置一定時(shí)間撤除后,由于失去外源P4控制且周期性黃體已退化,母羊?qū)⑼瑫r(shí)出現(xiàn)卵泡發(fā)育進(jìn)而集中發(fā)情。然而該方法也存在一定缺陷,Haresign[11]報(bào)道,撤栓后母羊血漿P4濃度的下降極顯著快于黃體自然溶解時(shí),LH濃度會(huì)快速升高到排卵時(shí)的峰值,從而可能引起精子運(yùn)輸障礙和E2分泌異常。
田樹(shù)軍等[3]、辛?xí)粤岬萚4]研究表明,撤栓前注射PMSG可顯著提高母羊的同期發(fā)情率和發(fā)情集中度。根據(jù)上述研究,為了在P4緩慢下降時(shí)更好地發(fā)揮PMSG對(duì)母羊發(fā)情受孕的促進(jìn)作用,本研究中試驗(yàn)Ⅰ組即采用撤栓前24 h注射PMSG。
張英杰等[12]認(rèn)為,小尾寒羊在4—6月和9—11月的FSH、LH分泌量更高,此時(shí)小尾寒羊發(fā)情也最為旺盛。賀建寧等[13]研究指出,小尾寒羊外周血液中E2、P4、FSH、LH在四季變化基本穩(wěn)定,但具體分泌量春季仍較低。孫曉萍等[14]報(bào)道,GnRH由下丘腦神經(jīng)纖維分泌,其引起垂體前葉分泌FSH和LH,F(xiàn)SH和LH通過(guò)血液與卵巢上特定的受體結(jié)合,促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟和排卵。熊柱[15]報(bào)道,對(duì)切除垂體的動(dòng)物在高濃度FSH制劑下能促使卵泡生長(zhǎng),但不能使其排卵;而單獨(dú)給予LH制劑時(shí)對(duì)卵巢也無(wú)明顯作用,除非FSH提前刺激卵巢,LH才有可能促使成熟的卵泡排卵。本研究中,提前注射PMSG后,小尾寒羊血漿E2濃度先降低后升高但不顯著,P4、LH濃度升高但不顯著,F(xiàn)SH濃度極顯著升高,GnRH濃度顯著升高。結(jié)合前人研究推測(cè),提前注射PMSG對(duì)于小尾寒羊P4、LH、FSH、GnRH的分泌有促進(jìn)作用,可使小尾寒羊生殖激素分泌更加符合發(fā)情旺盛期的狀態(tài);盡管FSH、GnRH濃度升高明顯,但由于缺少較高濃度P4、LH的協(xié)同作用而未能有效提高母羊繁殖力相關(guān)的4項(xiàng)指標(biāo)。
常璐等[16]報(bào)道,卵子發(fā)育對(duì)發(fā)情時(shí)的E2高濃度水平有積極的反饋?zhàn)饔?,而E2濃度的下降對(duì)配種后促進(jìn)胚胎著床和維持正常妊娠活動(dòng)有重要作用。賀建寧等[13]研究發(fā)現(xiàn),P4控制FSH分泌峰的周期性,可使卵巢由靜止變?yōu)榛钴S,恢復(fù)母羊正常的發(fā)情和排卵。田占偉等[17]研究指出,自然發(fā)情的哈薩克綿羊,發(fā)情期時(shí)母羊的P4分泌量顯著大于乏情期。Soriano等[18]認(rèn)為,季節(jié)性發(fā)情的綿羊品種,其LH的分泌存在著季節(jié)性變化,在繁殖季節(jié)升高,在非繁殖季節(jié)降低。本研究中,蒙古羊提前注射PMSG后,血漿E2濃度先上升后下降,放栓第14天血漿P4濃度顯著升高,LH濃度升高但差異不顯著,F(xiàn)SH濃度極顯著升高,但GnRH濃度顯著下降。綜合前人研究推測(cè),與小尾寒羊相比,春季提前注射PMSG也使蒙古羊血液中P4、LH、FSH的分泌更有利于發(fā)情受孕;蒙古羊E2濃度變化更加符合卵泡發(fā)育需要且P4濃度顯著升高,從而促進(jìn)了發(fā)情反應(yīng)率極顯著提高,由于血液GnRH濃度顯著降低對(duì)繁殖調(diào)控造成不利影響,沒(méi)能顯著提高其他3項(xiàng)繁殖指標(biāo)。
綜上,提前注射PMSG有利于綿羊生殖激素的分泌,但對(duì)P4濃度的減緩下降和對(duì)繁殖的促進(jìn)作用,小尾寒羊弱于蒙古羊。
LHRH-A3是人工合成的多肽激素,為下丘腦分泌的促黃體素釋放激素(LH-RH)的類(lèi)似物,馮建忠[10]指出,生理劑量的LH-RH主要引起LH和FSH的合成與釋放,但以對(duì)LH的刺激作用為主。魏立明等[6]秋季對(duì)湖羊和小尾寒羊采用孕激素硅膠栓(CIDR)+PMSG進(jìn)行同期發(fā)情并在首次人工授精時(shí)肌肉注射LHRH-A312.5 μg/只,取得了較好的效果。趙冰茹等[7]秋季對(duì)薩??斯w母羊超數(shù)排卵時(shí),在母羊發(fā)情后14 h進(jìn)行腹腔鏡輸精的同時(shí)注射LHRH-A325 μg/只,可進(jìn)一步促進(jìn)排卵?;谏鲜鲅芯砍晒?,為了進(jìn)了一步提高血液中促性腺素的濃度,本研究中試驗(yàn)Ⅱ組在提前注射PMSG的基礎(chǔ)上,首次輸精時(shí)肌肉注射LHRH-A312.5 μg/只。
秋季仍是小尾寒羊的發(fā)情旺盛期,賀建寧等[13]研究得出,小尾寒羊、灘羊血液中LH濃度秋季顯著高于春季;Suttie等[19]研究發(fā)現(xiàn),秋季短日照可以促進(jìn)P4分泌,而春季長(zhǎng)日照則具有明顯的抑制作用。陳欣[20]認(rèn)為,LH濃度存在“閾值”和“上限”,在卵泡發(fā)育后期,隨著血漿FSH濃度的下降,排卵前卵泡發(fā)育對(duì)LH產(chǎn)生依賴(lài),當(dāng)LH的濃度高于閾值并低于上限值時(shí),才能起到正常的調(diào)節(jié)作用。本研究表明,與試驗(yàn)Ⅰ組相比,放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅱ組血漿E2和GnRH濃度降低但差異不顯著,P4和LH濃度繼續(xù)升高但差異不顯著,F(xiàn)SH濃度極顯著降低。結(jié)合前人研究推測(cè),提前注射PMSG并肌注LHRH-A3,可使小尾寒羊LH、P4的分泌更符合繁殖旺盛期的狀態(tài);LH濃度的增加雖仍差異不顯著,但可能高于調(diào)控閾值,已經(jīng)能使更多的成熟卵泡排卵,進(jìn)而使母羊產(chǎn)羔率極顯著提高;肌注LHRH-A3可能使垂體減少了GnRH的分泌,雖然LH濃度仍得到提高,但導(dǎo)致了FSH濃度的降低,這使得母羊卵泡的發(fā)育成熟受限,同期妊娠率因此有所提高但不顯著。
蒙古羊是內(nèi)蒙古特有的季節(jié)性發(fā)情綿羊品種,趙興緒[21]認(rèn)為,綿羊季節(jié)性繁殖可能是由于E2負(fù)反饋抑制了GnRH的脈沖式釋放,從而使LH的波動(dòng)式分泌頻率降低,最終導(dǎo)致母羊排卵前的生理變化終止。Karsch等[22]報(bào)道,春季長(zhǎng)日照使E2對(duì)其他生殖激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)加強(qiáng),從而抑制了雌性動(dòng)物的發(fā)情和排卵;秋季短日照時(shí)E2正反饋調(diào)節(jié)加強(qiáng),變?yōu)榇龠M(jìn)發(fā)情排卵。本研究中,與試驗(yàn)Ⅰ組相比,放栓第14天,蒙古羊試驗(yàn)Ⅱ組血漿E2、P4濃度降低但不顯著,LH濃度繼續(xù)升高但差異不顯著,F(xiàn)SH、GnRH濃度極顯著升高。結(jié)合上述研究推測(cè),提前注射PMSG并肌注LHRH-A3后,蒙古羊血液E2濃度進(jìn)一步降低,這可能有利于減弱E2對(duì)其他生殖激素的負(fù)反饋?zhàn)饔?;與小尾寒羊不同,蒙古羊肌注LHRH-A3使GnRH濃度明顯升高,增強(qiáng)了對(duì)FSH、LH分泌的促進(jìn)作用,可使更多的母羊排卵受孕,從而同期受胎率極顯著提高、同期妊娠率顯著提高。但可能由于LH濃度仍明顯低于小尾寒羊,所以未能提高產(chǎn)羔率。
綜上,提前注射PMSG并肌注LHRH-A3,可增加小尾寒羊LH分泌從而促進(jìn)胎產(chǎn)多羔,可減弱蒙古羊E2負(fù)反饋?zhàn)饔谩⑻岣逩nRH分泌,進(jìn)而提高繁殖指標(biāo)。
OXT是一種主要由下丘腦神經(jīng)垂體分泌的肽類(lèi)激素。張效生等[23]認(rèn)為,精液中添加OXT和LHRH-A3可進(jìn)一步提高精子、卵子在生殖道里的運(yùn)行和卵子的受精力,進(jìn)而提高配種受胎率。張居農(nóng)等[24]進(jìn)行的大規(guī)模非繁殖季節(jié)誘導(dǎo)母羊發(fā)情研究中,采用母羊輸精同時(shí)將LHRH-A2加入精液并對(duì)精液進(jìn)行了OXT處理,他們認(rèn)為該措施的原理是通過(guò)激素的局部吸收,有利于配子的運(yùn)行和受精,從而可達(dá)到較好的受胎率。吳奇強(qiáng)等[8]對(duì)豬的研究表明,OXT具有促進(jìn)輸卵管和子宮平滑肌收縮的作用,能刺激母豬排卵,提高精液的吸收量和運(yùn)行速度,延緩和減少精液倒流。基于上述研究,為了增強(qiáng)人工授精后精卵間的結(jié)合,本研究中試驗(yàn)Ⅲ組采用在提前注射PMSG、肌注LHRH-A3基礎(chǔ)上,對(duì)稀釋后的精液按照1 U/mL添加OXT。
趙海全等[25]報(bào)道,OXT具有促進(jìn)子宮收縮(催產(chǎn))、乳腺排乳、卵泡發(fā)育及排卵、黃體形成和溶解、調(diào)節(jié)發(fā)情周期等重要作用,并參與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié),如下丘腦-垂體-性腺軸,下丘腦-垂體-腎上腺軸。Copland等[26]報(bào)道,OXT是一種促進(jìn)成熟卵泡變?yōu)辄S體的因子,對(duì)不同階段顆粒細(xì)胞的分化有作用,可影響其對(duì)P4合成的增加和減少。本研究中,與試驗(yàn)Ⅱ組相比,放栓第14天,小尾寒羊試驗(yàn)Ⅲ組血漿E2濃度顯著升高,P4、LH、GnRH濃度升高但差異不顯著,F(xiàn)SH濃度降低但差異不顯著。結(jié)合前人研究分析,提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對(duì)稀釋精液添加OXT,的確可使小尾寒羊同期受胎率、同期妊娠率有不同程度的提高,這可能不僅與子宮收縮和配子運(yùn)行增強(qiáng)有關(guān),也與其對(duì)E2、P4、LH和GnRH分泌的促進(jìn)作用有關(guān)。
OXT對(duì)腺垂體激素分泌的調(diào)節(jié)可能除了由門(mén)靜脈血管到達(dá)腺垂體起作用,還可通過(guò)神經(jīng)直接對(duì)腺垂體進(jìn)行調(diào)節(jié),其可促進(jìn)GnRH誘導(dǎo)LH的生成[27]。本研究中,與試驗(yàn)Ⅱ組相比,放栓第14天,蒙古羊試驗(yàn)Ⅲ組血漿E2、GnRH濃度降低但差異不顯著,P4、LH濃度升高但差異不顯著,F(xiàn)SH濃度極顯著降低。結(jié)合已有研究分析,與小尾寒羊不同,提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對(duì)稀釋精液添加OXT,蒙古羊同期受胎率、同期妊娠率極顯著降低,這可能是因?yàn)镺XT限制了GnRH的分泌與調(diào)節(jié)作用,具體的作用機(jī)理相關(guān)報(bào)道較少,需要開(kāi)展進(jìn)一步的針對(duì)性研究。
綜上,提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對(duì)稀釋精液添加OXT,提高了小尾寒羊的懷孕比率但卻使蒙古羊的懷孕比率降低,這可能是FSH、GnRH分泌水平不同造成的。
撤栓前24 h注射PMSG,可有效提高蒙古羊發(fā)情率;撤栓前24 h注射PMSG+LHRH-A3,可有效提高小尾寒羊產(chǎn)羔率、蒙古羊同期受胎率及同期妊娠率;撤栓前24 h注射PMSG+LHRH-A3+稀釋精液中添加OXT,可有效提高小尾寒羊同期妊娠率。
提前注射PMSG可促進(jìn)母羊生殖激素分泌,LHRH-A3、OXT對(duì)小尾寒羊、蒙古羊GnRH、FSH的分泌影響不同。