高收率人凝血酶原復(fù)合物生產(chǎn)工藝優(yōu)化

趙良超 李冠軍 馬小偉 趙東生 王明華 宋博

(華蘭生物工程股份有限公司,河南 新鄉(xiāng) 453003)

人凝血酶原復(fù)合物(human prothrombin complex concentrates,PCC)是從健康人血漿中分離純化的一種促進(jìn)血液凝固的血漿蛋白制劑,PCC 中發(fā)揮功能的主要是人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ(FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ)4 種維生素K 依賴的凝血因子,4 種因子均為肝臟合成的糖蛋白。由于4 種因子的等電點(diǎn)(4.1～4.6)和相對(duì)分子質(zhì)量(54 000～70 000Da)等理化性質(zhì)極為相似,使用常規(guī)純化方法難以將之分離,一般將其作為一個(gè)整體制備[1]。PCC 主要用于治療先天性和獲得性FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ缺乏證包括:1)FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ缺乏癥包括乙型血友病,2)抗凝劑過(guò)量、維生素K 缺乏癥,3)因肝病導(dǎo)致的凝血機(jī)制紊亂,4)各種原因所致的凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)而擬做外科手術(shù)患者,5)治療已產(chǎn)生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血癥狀,6)逆轉(zhuǎn)香豆素類抗凝劑誘導(dǎo)的出血。因?yàn)镻CC 的適應(yīng)證主要與FⅨ的含量有關(guān),所以通常以FⅨ的效價(jià)來(lái)計(jì)算PCC 的收率,FⅨ的比活性來(lái)衡量PCC 的純度。

目前大多數(shù)生產(chǎn)廠家使用二乙基氨基乙基-葡聚糖A50(DEAE Sephadex A50)凝膠兩步法進(jìn)行PCC 制備,且許多廠家在第一步吸附時(shí)使用批式凝膠吸附罐[2],其典型工藝為:在凝膠吸附罐中對(duì)DEAE Sephadex A50 凝膠進(jìn)行平衡,從除去冷沉淀的人血漿上清液中提取PCC 粗品,用低離子強(qiáng)度的緩沖液除去吸附能力較弱的雜質(zhì)蛋白和黏附的其他成分,然后增加緩沖液的離子強(qiáng)度洗脫目標(biāo)蛋白,通過(guò)超濾透析除去小分子雜質(zhì),獲得PCC,然后再通過(guò)S/D 病毒滅活以及第二步純化得到最終產(chǎn)品。但由于不同廠家采用的工藝參數(shù)不同,如:凝膠用量、平衡液、洗滌液、洗脫液配方或者超濾等步驟,所得產(chǎn)品的因子收率不同,甚至有些工藝只能得到三因子PCC(3F-PCC),這種PCC 制品因FⅦ含量低,在治療上文所述適應(yīng)證:1)各種原因所致的凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)而擬做外科手術(shù)患者,2)治療已產(chǎn)生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血癥狀,3)逆轉(zhuǎn)香豆素類抗凝劑誘導(dǎo)的出血時(shí)效果不如四因子人凝血酶原復(fù)合物(4F-PCC)。因此,PCC 中具備一定含量的FⅦ將會(huì)提高產(chǎn)品對(duì)上述適應(yīng)證的療效。

本文通過(guò)對(duì)PCC 制備的各步驟的研究,如:在吸附步驟提高了4 種凝血因子的收率,洗滌步驟減少了FⅦ的損失并有效去除了雜質(zhì)蛋白,洗脫步驟提高了產(chǎn)品的比活性,超濾步驟保護(hù)了凝血因子效價(jià)活性,最終得到成品收率約為62～63 萬(wàn)IU/噸血漿,比活性符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn),4 種凝血因子比例較為均衡的4F-PCC 產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 健康人血漿[華蘭生物工程股份有限公司下屬的漿站(批號(hào)T202301018)]質(zhì)量符合藥典規(guī)定。DEAE Sephadex A50 凝膠購(gòu)自GE Healthcare 公司(貨號(hào)02-0047-01)。分析儀器,全自動(dòng)凝血儀由法國(guó)STAGO 公司提供,儀器型號(hào)為STA-Compact Max,紫外分光光度計(jì)由日本島津公司提供,儀器型號(hào)為UV-1900,血凝儀由北京普利生儀器有限公司提供,儀器型號(hào)為C2000-4。

1.2 檢測(cè)方法 1)蛋白濃度檢測(cè)方法依據(jù)?中國(guó)藥典?2020 版三部通則0731 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法,第三法“雙縮脲法”進(jìn)行測(cè)定。2)效價(jià)檢測(cè)方法依據(jù)?中國(guó)藥典?2020 版三部通則3517～3520,使用FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ乏漿為基質(zhì)血漿,采用一期法測(cè)定供試樣品中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ的效價(jià)。3)活化的凝血因子活性檢查依據(jù)?中國(guó)藥典?2020 版三部通則3423,加適量稀釋劑溶解至FⅨ20IU/mL 進(jìn)行檢定,應(yīng)符合規(guī)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)是研究正確的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的理論和方法,通過(guò)改變過(guò)程的輸入因素,觀察其相應(yīng)的輸出響應(yīng)的變化,從而獲取這個(gè)過(guò)程的知識(shí),確定各個(gè)輸入因素的重要性以及各個(gè)輸入因素如何影響輸出響應(yīng),并如何達(dá)到最優(yōu)化過(guò)程的目的[3]。

DOE 包括正交實(shí)驗(yàn)和析因?qū)嶒?yàn),正交實(shí)驗(yàn)是處理復(fù)雜系統(tǒng)多因素、多水平的一種科學(xué)方法。析因?qū)嶒?yàn)是研究?jī)蓚€(gè)或多個(gè)變動(dòng)著的因素的有效方法,一般設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)都為2 水平實(shí)驗(yàn)(2k實(shí)驗(yàn))加中心點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方案。DOE 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),無(wú)論是正交實(shí)驗(yàn)還是析因?qū)嶒?yàn),實(shí)現(xiàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一種巧妙的方法為選取“中心點(diǎn)”進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。選取“中心點(diǎn)”并在此安排重復(fù)實(shí)驗(yàn)的好處,主要是為了進(jìn)行完全相同條件下的重復(fù),因而可以實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出隨機(jī)誤差。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 吸附試驗(yàn) 吸附體系包括凝膠與血漿兩部分。經(jīng)評(píng)估,我們剔除了可能對(duì)血漿產(chǎn)生影響的兩項(xiàng)因素:血漿pH 值和血漿電導(dǎo)率,因?yàn)閷?duì)這兩項(xiàng)因素的調(diào)整可能對(duì)提取PCC后的血漿造成影響,進(jìn)而影響下游產(chǎn)品。另外,我們認(rèn)為凝膠電導(dǎo)率和pH 值的改變對(duì)整個(gè)體系的pH 值和電導(dǎo)率的影響很小,因?yàn)槟z僅占整個(gè)體系的1.2‰～2.5‰。因此,我們選取凝膠pH 值、吸附時(shí)間和凝膠加量作為考察因素,因凝膠加量與pH 可考察的梯度水平較多,為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本,制定三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1,以FⅨ收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用Minitab 17 軟件進(jìn)行析因分析,進(jìn)行初步篩選,確定主要影響因素后,再對(duì)多個(gè)梯度進(jìn)行考察,同時(shí)驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

依據(jù)上述正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定凝膠加量主要吸附收率主要影響參數(shù)。凝膠加量分別按照1.2、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5 g/L,于pH＝7.6 條件下吸附40min,以FⅦ和FⅨ收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的同時(shí),對(duì)凝膠加量的限度范圍進(jìn)行進(jìn)一步考察。

試驗(yàn)序號(hào)吸附時(shí)間(min)pH 值 凝膠加量(g/L 血漿)1 607.81.4 507.62 3 607.22 4 507.81.7 5 407.82 6 607.61.7 7 407.61.4 8 407.21.7 9 507.21.4 2

1.4.2 洗滌試驗(yàn) 影響洗滌的主要因素有洗滌液的電導(dǎo)率(主要與NaCl 濃度有關(guān)),洗滌的次數(shù)以及洗滌的倍數(shù)有關(guān),使用minitab 17 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選取NaCl 濃度0.175 mol/L、洗滌次數(shù)5 次、洗滌倍數(shù)2 倍作為中心點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),考察洗滌液NaCl 濃度、洗滌次數(shù)、洗滌倍數(shù)對(duì)收率、蛋白濃度的影響,評(píng)價(jià)洗滌效果(表2)。

試驗(yàn)序號(hào)NaCl 濃度(mol/L) 洗滌次數(shù)n洗滌倍數(shù)n 1 0.2031 0.17552 3 0.1533 4 0.2073 5 0.17552 6 0.1571 7 0.17552 2

1.4.3 洗脫試驗(yàn) 影響洗脫的因素主要有電導(dǎo)率、洗脫次數(shù)、洗脫的倍數(shù)有關(guān),考慮到常用洗脫液NaCl 濃度范圍為0.5～2.0 mol/L,NaCl 濃度水平較高,濃度范圍跨度較大,為初步考察洗脫條件,選取了0.5、1.0、1.5、2.0 4 個(gè)NaCl 濃度水平,設(shè)置了洗脫的倍數(shù)均為1,洗脫次數(shù)為3 次和5 次進(jìn)行考察,通過(guò)二因素正交實(shí)驗(yàn)(表3)考察洗脫液中NaCl 濃度以及洗脫次數(shù)對(duì)收率的影響,評(píng)價(jià)洗脫效果。

試驗(yàn)序號(hào)NaCl 濃度(mol/L)洗脫次數(shù)n 1 0.53 1.03 3 1.53 4 2.03 5 0.55 6 1.05 7 1.55 8 2.05 2

1.4.4 超濾試驗(yàn) 選取了常用的兩種保護(hù)劑肝素和NaCl,以肝素添加量35IU/L 血漿、NaCl 添加量0.1mol/L 為中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)析因?qū)嶒?yàn)對(duì)超濾步驟進(jìn)行研究,以FⅨ收率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估保護(hù)劑的作用,試驗(yàn)方案見(jiàn)表4。

試驗(yàn)序號(hào)肝素(IU/L 血漿)NaCl(mol/L)1 0 0.07 350.1 3 350.1 4 700.13 5 350.1 6 0 0.13 2 7 700.07

2 結(jié)果

2.1 吸附試驗(yàn)結(jié)果 使用minitab 17 軟件進(jìn)行分析,分析結(jié)果見(jiàn)表5,依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制等值線圖如圖1、圖2 所示。

圖1 pH 值、凝膠量對(duì)吸附收率的影響

圖2 時(shí)間、凝膠量對(duì)吸附收率的影響

項(xiàng)效應(yīng)系數(shù)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差T 值P 值 方差膨脹因子常量/0.552 81 0.009 74 56.74 0.000 pH 值0.078 2 0.039 10 0.015 30 2.560.125 1.75凝膠量0.213 8 0.106 90 0.014 50 7.380.018 1.52時(shí)間－0.019 7－0.009 90 0.014 50－0.68 0.566 1.52 pH 值?凝膠量0.028 5 0.014 30 0.020 50 0.700.558 2.13 pH 值?時(shí)間 0.030 7 0.015 40 0.020 50 0.750.531 2.13凝膠量?時(shí)間 0.092 1 0.046 00 0.023 30 1.970.187 2.63

由表5、圖1、圖2 得知,只有當(dāng)凝膠用量較為充足的時(shí)候才能得到較高的收率?？梢?jiàn)凝膠用量較pH 值和吸附時(shí)間是影響吸附收率的重要因素。

在確定了凝膠用量為主要影響因素之后,針對(duì)凝膠用量的使用范圍進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察,從圖3 的試驗(yàn)結(jié)果可以看出,當(dāng)凝膠加量>2.3g/L 時(shí),FⅨ收率仍有較大的上升幅度。另外具有一定應(yīng)用意義的是,隨著凝膠用量的不斷上升,FⅦ效價(jià)也不斷上升,其上升幅度甚至超過(guò)FⅨ效價(jià),如圖4 所示。

圖3 FⅨ收率折線圖

圖4 凝膠用量與FⅦ:FⅨ比例的關(guān)系

2.2 洗滌試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),洗滌液中FⅦ效價(jià)較高,而FⅡ、FⅨ、FⅩ幾乎不存在于洗滌液中,證明FⅦ最容易在洗滌的過(guò)程中損失。而洗滌步驟為關(guān)鍵的去除雜質(zhì)步驟,洗滌液中蛋白濃度越高,最終產(chǎn)品的比活性也會(huì)越高。依據(jù)表6 試驗(yàn)數(shù)據(jù),針對(duì)洗滌液中FⅦ和蛋白濃度使用minitab 17 進(jìn)行分析如圖5、6 所示。

圖5 FⅦ收率與NaCl 的濃度,洗滌總量的曲面圖

圖6 蛋白濃度與NaCl 的濃度,洗滌總量的曲面圖

從分析結(jié)果來(lái)看,FⅦ效價(jià)收率與蛋白濃度似乎是相互矛盾的兩個(gè)響應(yīng),很難使兩者同時(shí)達(dá)到較優(yōu)的情況。

試驗(yàn)序號(hào)NaCl 濃度(mol/L)洗滌次數(shù)(n)洗滌用量(n)洗滌總量(次數(shù)×用量)FⅦ收率(%)蛋白濃度(g/L)10.2031362.360.8 20.175521067.480.7 30.1533978.960.7 40.20732150.830.9 50.175521066.920.7 60.1571774.350.6 70.175521067.420.7

2.3 洗脫試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),使用含有NaCl 濃度為0.5～2.0 mol/L 進(jìn)行洗脫時(shí),洗脫3 次以上均可以保證四種凝血因子均被充分回收,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

試驗(yàn)序號(hào)NaCl 濃度(mol/L)洗滌次數(shù)(n)FⅡ收率(%)FⅦ收率(%)FⅨ收率(%)FⅩ收率(%)10.5383.2477.5688.5891.28 21.0384.5974.2487.7690.56 31.5383.7776.4987.2391.76 42.0384.3275.7786.6491.96 50.5583.8375.2388.9291.67 61.0583.8774.8987.2692.09 71.5584.4276.3386.5390.88 82.0584.2477.1785.6891.36平均值84.0475.9687.3391.45標(biāo)準(zhǔn)差0.411.071.010.50

2.4 超濾試驗(yàn)結(jié)果 使用minitab 17 分析試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,從圖7 可以看出適量的保護(hù)劑可以對(duì)凝血因子的效價(jià)形成保護(hù)作用,活化的凝血因子活性檢查符合藥典規(guī)定。

圖7 收率與肝素,NaCl 的曲面圖

3 討論

吸附:從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,吸附步驟的凝膠使用量是影響人凝血酶原復(fù)合物收率的顯著因素,而且我們的研究與Heystek 等[4]的研究基本一致,只是在凝膠用量>2.3 g/L 時(shí),我們研究發(fā)現(xiàn)收率仍會(huì)顯著上升,而Heystek 等的研究表示凝膠的吸附能力已經(jīng)趨于飽和。另外,當(dāng)凝膠用量越大時(shí)洗脫的蛋白濃度越高,所以其結(jié)論趨向于使用1.5 g/L 的凝膠。但隨著研究發(fā)現(xiàn),后續(xù)工藝可以達(dá)到洗滌或者分離雜質(zhì)蛋白的目的。因此,在保證最終產(chǎn)品質(zhì)量符合藥典規(guī)定的前提下,適當(dāng)提高凝膠的使用量是適用的。

另外,我們還研究了FⅦ效價(jià)與凝膠使用量之間的關(guān)系,從試驗(yàn)結(jié)果(圖4)我們可以看出,FⅦ效價(jià)也是隨凝膠用量的增加而增加的,其增加的幅度甚至快于FⅨ效價(jià),尤其是在凝膠用量>1.5g/L 血漿時(shí)。據(jù)分析,可能是因?yàn)楫?dāng)凝膠用量<1.5g/L 時(shí),血漿中FⅨ濃度較高,隨著凝膠用量的增加,FⅨ被大量吸附而導(dǎo)致血漿中的濃度降低,相對(duì)吸附能力較弱的FⅦ因濃度相對(duì)較高的優(yōu)勢(shì)在競(jìng)爭(zhēng)性吸附的過(guò)程中占據(jù)了上風(fēng),所以隨著凝膠用量的繼續(xù)增加至1.5g/L 血漿以上時(shí),被吸附的FⅦ的量高于FⅨ,后續(xù)解析下來(lái)的FⅦ效價(jià)也隨之提高。我們的研究為制造因子比例均衡的人凝血酶原復(fù)合物提供了研究基礎(chǔ)。

洗滌:洗滌效果與最終產(chǎn)品的雜質(zhì)含量有關(guān),洗滌液NaCl 濃度越高,洗掉的雜質(zhì)蛋白越多。但NaCl 濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致FⅦ損失較大,甚至只能得到3F-PCC。目前依據(jù)PCC中FⅦ的含量,將PCC 劃分為三因子PCC(3F-PCC)和四因子PCC(4F-PCC),近年來(lái),許多文獻(xiàn)研究表明4F-PCC 優(yōu)于3F-PCC,由于在某些適應(yīng)證上的療效更加優(yōu)秀,如:Luca等[5]的研究表明,4F-PCC 使用最小的劑量既可以完成香豆素類抗凝劑(如華法林)過(guò)量導(dǎo)致的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)升高的逆轉(zhuǎn),而3F-PCC 所需的劑量較大。Megan 等[6]的研究比較了4F-PCC 在治療服用Ⅹa 抑制劑的顱內(nèi)出血病人的INR 逆轉(zhuǎn)情況。Muhammad 等[7]的研究表明在外傷性凝血病(COT)的應(yīng)用中4F-PCC 逆轉(zhuǎn)更快,INR 修正率更高。李澤坤等[8]兒童血友病A 免疫耐受誘導(dǎo)過(guò)程中旁路止血的治療中,對(duì)于中輕度治療以及預(yù)防治療均顯示有效性和安全性。所以市場(chǎng)對(duì)于4F-PCC 的需求逐步擴(kuò)大,我國(guó)最近批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究并上市的PCC 產(chǎn)品均為4F-PCC[9-10]。雖然國(guó)內(nèi)不少?gòu)S家4F-PCC 產(chǎn)品陸續(xù)上市,但PCC 仍處于供應(yīng)短缺狀態(tài)。

Steinbuch 等[11]的研究表明,洗滌液對(duì)多種蛋白具有富集作用,且對(duì)FⅦ也有數(shù)倍的富集作用。這點(diǎn)與我們的研究結(jié)果一致,在我們所研究的洗滌液NaCl 濃度范圍之內(nèi),合理應(yīng)用了批式洗滌的特點(diǎn),精心進(jìn)行DOE 試驗(yàn)設(shè)計(jì),發(fā)現(xiàn)了某些“異?！钡那闆r,這可能是“少量多次”這種原則反向應(yīng)用。雖然并未打破“洗滌液NaCl 濃度越高,FⅦ的收率越低”的趨勢(shì)。但是也為開(kāi)發(fā)者提供了一些思路。

另外考慮到洗滌液對(duì)FⅦ的富集作用和絕大多數(shù)PCC中都會(huì)含有一定量的FⅦa(活化的凝血因子Ⅶ)[12-13],那么過(guò)度的降低洗滌液NaCl 濃度,是否會(huì)導(dǎo)致FⅦa 富集? 而這些FⅦa 究竟是來(lái)源于血漿采集過(guò)程中,還是源于制備過(guò)程中[14-15]? 這些問(wèn)題雖然不是本文要討論的,但也是對(duì)于PCC安全性來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要的問(wèn)題。

洗脫:依據(jù)本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,洗脫液的NaCl 濃度在0.5～2.0 mol/L 時(shí),洗脫3 次以上,4 種凝血因子均可以被充分洗脫。那么,在此范圍之內(nèi),適當(dāng)選擇NaCl 濃度較低的洗脫液,應(yīng)當(dāng)可以避免收集一些較難以洗脫的雜質(zhì)蛋白,提高產(chǎn)品的比活性。

超濾:從本文的研究結(jié)果來(lái)看,超濾過(guò)程的控制對(duì)于凝血因子的影響是顯而易見(jiàn)的。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入肝素鈉作為保護(hù)劑對(duì)凝血因子效價(jià)有益[16],但是我們尚不能判斷是保護(hù)劑抑制了凝血因子活化,還是保護(hù)劑防止了凝血因子失活。有研究者的觀點(diǎn)認(rèn)為FⅦa 在肝素存在的情況下被抗凝血酶抑制,但抑制過(guò)程是如此的緩慢,以至于可能存在很小的生理意義[17]。本文也認(rèn)為保護(hù)劑可能并非抑制了凝血因子活化,而是防止了失活。因?yàn)槟承㏄CC 產(chǎn)品不含肝素也并未表現(xiàn)出成品檢測(cè)時(shí)“活化的凝血因子活性檢查”指標(biāo)明顯異常。

綜上所述,選用DEAE-Sephadex A50 凝膠,先用平衡液將凝膠平衡至pH7.6,然后按血漿重量1.7～2.5 g/L 加入去除冷沉淀的血漿中吸附40 min。用3 倍凝膠體積的NaCl 濃度為0.150～0.175 mol/L 的洗滌液洗滌吸附后的凝膠3 次,然后用NaCl 濃度為0.5～2.0 mol/L 的洗脫液洗脫3～5 次。超濾透析時(shí)使用肝素保護(hù)劑35IU,NaCl 0.1 mol/L 對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行保護(hù),最終產(chǎn)品收率可達(dá)到62～63 萬(wàn)IU/噸血漿,收率較高,適合PCC 的工業(yè)化生產(chǎn)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。