血小板應(yīng)答蛋白1在雙側(cè)卵巢切除大鼠陰道壁中的表達(dá)

朱芳誼，洪莉，陳茂，肖雅，黃筱雨，陳麗穎

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430060

盆腔臟器脫垂（pelvic organ prolapse，POP）是指由于盆底支持結(jié)構(gòu)薄弱進(jìn)而導(dǎo)致盆腔器官移位及功能異常的盆腔功能障礙性疾病，陰道前壁是臨床上最常見的脫垂部位。POP患者可能伴有不同程度的盆腔疼痛、排尿異常、大便失禁或排便障礙等不適癥狀，造成生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1]；且其較高的手術(shù)率也給公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，女性終身接受POP手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)為12%～19%，陰道脫垂已成為絕經(jīng)后女性接受子宮切除術(shù)最常見的手術(shù)指征之一[2]。然而POP的發(fā)病機(jī)制仍未得到充分解釋，這給相關(guān)診療方案的制定帶來重大困難。研究顯示POP是一種多因素的結(jié)締組織疾病，絕經(jīng)是其主要危險(xiǎn)因素之一，絕經(jīng)后女性的雌激素水平急劇下降，造成陰道壁萎縮及炎癥，并通過影響膠原纖維的代謝導(dǎo)致盆腔結(jié)締組織支持功能障礙，進(jìn)而誘發(fā)POP[3]。血小板應(yīng)答蛋白1（thrombospondin-1，THBS1）是血小板凝血酶蛋白家族中一種可由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的鈣結(jié)合性糖蛋白，在子宮內(nèi)膜、陰道壁等多種人體組織中廣泛表達(dá)[4]。作為一種具有三聚體復(fù)合結(jié)構(gòu)的基質(zhì)細(xì)胞蛋白，THBS1可通過結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中的受體和特定蛋白質(zhì)，參與調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、止血和血管生成等多項(xiàng)生理活動(dòng)。研究顯示THBS1在生理狀態(tài)下表達(dá)較少，但在組織受損時(shí)表達(dá)上調(diào)，并在慢性纖維化疾病中持續(xù)存在，參與纖維化和炎癥相關(guān)的多個(gè)分子通路的激活[5-6]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)雌激素處理可使人體子宮來源的成纖維細(xì)胞中的THBS1表達(dá)下調(diào)[7]。本研究通過切除大鼠雙側(cè)卵巢模擬絕經(jīng)后低雌激素環(huán)境，構(gòu)建大鼠雌激素缺乏模型；觀察其陰道壁的形態(tài)結(jié)構(gòu)及THBS1的表達(dá)變化，初步探討雌激素缺乏是否通過上調(diào)THBS1表達(dá)影響陰道壁中膠原纖維代謝，參與POP的發(fā)病進(jìn)程，為未來POP發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究提供思路及研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康的3月齡未生產(chǎn)過的SD大鼠24只，體質(zhì)量332～367g，平均（350.0±17.2）g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：TY20220087；倫理審批號(hào)：WDRM動(dòng)（福）第20200805號(hào)]。24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組，每組各12只。

1.1.2 主要試劑和儀器 抗THBS1抗體（Santa Cruz Biotechnology生物公司）；17-β-雌二醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（Abcam，ab108667）；免疫組織化學(xué)試劑盒、組織固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蛋白上樣緩沖液（谷歌生物技術(shù)有限公司）；正置熒光顯微鏡（日本，Olympus）；ChemiDocTMTouch化學(xué)發(fā)光儀（美國，BIO-RAD）；EnSight酶標(biāo)儀（美國，Perkin Elme）；BSA124S-CW分析天平（德國，Sartorius）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 將大鼠放入麻醉誘導(dǎo)盒（4%異氟烷），待大鼠麻醉后將其取出固定在手術(shù)臺(tái)上，利用麻醉呼吸面罩維持麻醉（2%異氟烷），使其保持深度麻醉。除去腰背部毛發(fā)，消毒皮膚，無菌條件下經(jīng)腰背部正中縱行切口進(jìn)入腹腔背側(cè)，實(shí)驗(yàn)組大鼠切除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組大鼠切除雙側(cè)卵巢下方與卵巢相同重量的脂肪組織。術(shù)后給予青霉素預(yù)防感染1周，每周監(jiān)測大鼠體質(zhì)量。常規(guī)飼養(yǎng)至12周后處死大鼠，取子宮、陰道壁組織及靜脈血進(jìn)行分析。

1.2.2 取材方法 處死前從大鼠尾靜脈取血，抗凝靜置10min后，4°C下1500×g離心10min，收集血清并轉(zhuǎn)移至–80℃冰箱備用。采用斷椎法處死大鼠，打開盆腔，暴露盆底，分離筋膜與脂肪組織，取子宮及陰道壁組織，并將陰道壁沿中線分成兩塊，約0.5cm×0.5cm×0.5cm，生理鹽水反復(fù)沖洗，一塊放入–80℃冰箱中低溫保存；另一塊采用組織固定液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定 按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作，將25μl血清樣品、對(duì)照組及標(biāo)準(zhǔn)組溶液分別加入酶標(biāo)板，37℃孵育2h。用洗滌液漂洗3遍，加入100μl TMB底物，室溫避光孵育30min，加入終止液并輕搖，30min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取各孔在450nm處的吸光度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清樣品內(nèi)雌二醇含量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）法，按試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作。切片在60℃抗原修復(fù)液中加熱30min，用分級(jí)醇系脫蠟再水化，一抗按1∶100稀釋。光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中有棕色顆粒為陽性表達(dá)。免疫活性用積分光密度（integral optical density，IOD）值量化，使用Image J 6.0軟件通過高分辨攝取圖像信號(hào)測定灰度值，用平均灰度值表示THBS1蛋白的表達(dá)，平均密度=IOD/面積。

1.2.5 Masson染色 切片脫蠟，鐵蘇木素染色7min，水洗，酸性乙醇分化液分化，水洗，麗春紅酸性品紅液染色8min，水洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5min，苯胺藍(lán)復(fù)染5min，0.2%冰醋酸處理1min，脫水后中性樹膠封固。顯微鏡下觀察膠原纖維呈藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，胞核黑色。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測 取大鼠陰道壁組織液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混勻后4℃、12 000轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液后煮沸8min使蛋白變性，使用8% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1h，加入一抗THBS1抗體（1∶3000）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，二抗室溫孵育1h，再次用磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，使用ChemiDocTMTouch化學(xué)發(fā)光儀掃膜并分析條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0和Image J 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠的造模情況

造模12周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠子宮萎縮明顯，體質(zhì)量增加顯著高于假手術(shù)組，雌二醇水平顯著低于假手術(shù)組（P<0.01），見圖1、表1。

表1 造模12周后兩組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)比較（±s）

表1 造模12周后兩組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)比較（±s）

組別 子宮重量（g）體質(zhì)量增加（g）雌二醇（pg/ml）假手術(shù)組（n=12） 0.87±0.02 15.82±0.89 82.75±1.33實(shí)驗(yàn)組（n=12） 0.10±0.02 45.32±0.74 40.60±0.67 t 30.22 25.58 28.32 P <0.01 <0.01 <0.01

圖1 兩組大鼠的子宮對(duì)比

2.2 Masson染色結(jié)果

與假手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的陰道壁上皮層明顯萎縮，平滑肌束變薄，肌束間隙變寬，固有層和肌層中膠原纖維沉積增加，且排列分布雜亂、碎片化，見圖2。

圖2 兩組大鼠的陰道壁膠原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)（Masson染色，×200）

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

兩組大鼠的陰道壁全層THBS1均有表達(dá)，以陰道壁固有層為主。與假手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)組的棕黃色顆粒更粗大，含量更多，且分布更密集，彼此形成細(xì)密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖3。實(shí)驗(yàn)組大鼠陰道壁中THBS1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），見圖4。

圖3 兩組大鼠陰道壁中的THBS1表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×200）

圖4 兩組大鼠陰道壁中的THBS1蛋白表達(dá)

3 討論

隨著預(yù)期壽命的延長及人口老齡化的進(jìn)程，預(yù)計(jì)到2050年有臨床癥狀的POP患病率將增加約50%[8]。由于對(duì)POP的具體發(fā)病機(jī)制了解有限，目前以手術(shù)為主的治療方案側(cè)重于恢復(fù)盆腔器官的正常解剖結(jié)構(gòu)，忽視對(duì)盆底支持組織功能方面的治療，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)排尿障礙等術(shù)后并發(fā)癥，且術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然很高，二次手術(shù)發(fā)生率高達(dá)19%[9-10]。為恢復(fù)患者盆底支持結(jié)構(gòu)的生理功能，從根本上治愈患者及提供更精準(zhǔn)的預(yù)防手段，對(duì)POP相關(guān)潛在靶點(diǎn)的深入研究具有重要臨床意義。

陰道壁包括上皮層、富含膠原纖維的固有層、平滑肌束組成的肌層和外膜層，其中固有層和肌層在維持陰道壁的生物力學(xué)特性中發(fā)揮重大作用[11]。研究證實(shí)，絕經(jīng)與POP患病風(fēng)險(xiǎn)增加存在直接關(guān)聯(lián)。絕經(jīng)后，血清雌激素水平及盆腔結(jié)締組織中雌激素受體濃度顯著降低，這種低水平雌激素的環(huán)境改變促使盆腔結(jié)締組織中膠原纖維雜亂無序的沉積，進(jìn)而導(dǎo)致支持功能下降[12-13]。

研究證實(shí)，在人體來源的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、垂體內(nèi)皮細(xì)胞中雌激素治療可抑制THBS1的表達(dá)[7,14]。在多囊卵巢綜合征大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)血清THBS1表達(dá)下降，這可能與雌激素水平升高有關(guān)[15]。此外，雌激素還可通過下調(diào)THBS1受體CD36，進(jìn)而抑制THBS1與CD36結(jié)合后所激活的下游通路[16]。相反，在雙側(cè)卵巢切除術(shù)后大鼠的比目魚肌中THBS1表達(dá)增加[17]。上述研究結(jié)果提示雌激素水平與THBS1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，本研究也發(fā)現(xiàn)雙側(cè)卵巢切除術(shù)后大鼠的血清雌激素水平明顯下降，且陰道壁中THBS1表達(dá)上調(diào)，與預(yù)期結(jié)果一致。THBS1可激活轉(zhuǎn)化生長因子β1，而轉(zhuǎn)化生長因子β1的激活不僅加速成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，且誘導(dǎo)促纖維化基因轉(zhuǎn)錄增加，還會(huì)加劇炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織廣泛纖維化[18]。THBS1還可通過直接結(jié)合或間接作用來調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，進(jìn)而加劇細(xì)胞外基質(zhì)的膠原沉積[19]。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)THBS1是治療糖尿病腎臟并發(fā)癥的有效治療靶點(diǎn)，在糖尿病小鼠模型中給予THBS1阻滯劑可選擇性抑制腎臟中過量激活的轉(zhuǎn)化生長因子β活性，進(jìn)而緩解腎臟纖維化改變。Bao等[21]也證實(shí)THBS1介導(dǎo)的間歇性缺氧可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞活化和心肌纖維化。因此，作為膠原纖維代謝的重要調(diào)節(jié)劑，THBS1有助于膠原纖維在細(xì)胞外基質(zhì)中沉積。

本研究通過切除大鼠的雙側(cè)卵巢構(gòu)建大鼠雌激素缺乏模型，12周后實(shí)驗(yàn)組大鼠的陰道壁中發(fā)生膠原纖維代謝異常的病理改變，陰道壁上皮層萎縮，排列紊亂且碎片化的膠原纖維沉積在黏膜層和肌層，導(dǎo)致陰道僵硬度增加，與POP患者陰道壁的病理學(xué)觀察相一致[22]。推測實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)低雌激素環(huán)境使得陰道壁中THBS1表達(dá)增加，后者通過擾亂結(jié)締組織中正常的膠原纖維代謝引起陰道壁過度纖維化，進(jìn)而損害陰道壁的生物力學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致其對(duì)POP的易感性增加。

綜上，THBS1可能參與雌激素缺乏所誘導(dǎo)的陰道壁過度纖維化，從而導(dǎo)致盆底支持組織的強(qiáng)度及韌性受損，參與POP的發(fā)生發(fā)展。