HPLC同時(shí)測(cè)定明目益睛丸中5種有效成分含量

楊春紅，李 睿，趙 琪，石倩，劉雅琴，賴先榮，李姝

明目益睛丸是由眉山市中醫(yī)醫(yī)院自制的院內(nèi)制劑，由鹽菟絲子、五味子、青皮、鹽車(chē)前子、三七等10味中藥材組成，具有滋陰補(bǔ)肝腎、益氣生津的藥用功效。該方臨床用于治療肝腎虧虛，目失濡養(yǎng)所致的近視、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離、視神經(jīng)萎縮等各類眼病[1-2]。作為經(jīng)驗(yàn)方劑，目前對(duì)其質(zhì)量控制系統(tǒng)研究較少。根據(jù)現(xiàn)有藥理研究，菟絲子補(bǔ)益肝腎，明目，主要成分金絲桃苷可抗肝損傷、保護(hù)腎臟，還能改善糖尿病高血糖引起的視網(wǎng)膜病理?yè)p傷[3]；五味子補(bǔ)虛益目，五味子醇甲具有保肝護(hù)肝、抗炎作用[4]；青皮理氣，橙皮苷參與抗炎、保肝作用[5]；車(chē)前子利水清熱明目，毛蕊花糖苷具有明顯的抗炎及肝保護(hù)作用，還可改善腎功能[6]；三七行血?dú)?，其中人參皂苷Rg1作為主要藥效成分可保護(hù)視網(wǎng)膜、顯著護(hù)肝及抗炎[7]。為對(duì)明目益睛丸進(jìn)行質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)以上述5種物質(zhì)作為明目益睛丸的有效成分，建立高效液相色譜法含量測(cè)定方法，為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)及參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），HTP-312型電子天平（上海花潮電器有限公司），BSA124S型電子分析天平、CPA225D型電子分析天平均購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，KQ-50B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），RATK060L0樂(lè)楓超純水系統(tǒng)（上海樂(lè)楓生物科技有限公司）

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖A. 空白溶液；B. 混合對(duì)照品溶液；C. 供試品溶液；D. 缺鹽菟絲子陰性對(duì)照溶液；E. 缺鹽車(chē)前子陰性對(duì)照溶液；F. 缺青皮陰性對(duì)照溶液；G. 缺三七陰性對(duì)照溶液；H. 缺五味子陰性對(duì)照溶液1.金絲桃苷；2.毛蕊花糖苷；3. 橙皮苷；4.人參皂苷Rg1；5.五味子醇甲

1.2 試劑與對(duì)照品

明目益睛丸（自制，批號(hào)M Z 2 2 111 8-1、MZ221118-2、MZ221118-3），乙腈及甲醇為色譜純，均購(gòu)于Sigma（中國(guó)）有限公司；磷酸（色譜純）、甲醇（分析純）均購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

對(duì)照品由成都德思特生物技術(shù)有限公司提供，純度均大于98.0%：金絲桃苷（批號(hào)：DST210912-023）、橙皮苷（批號(hào)：DST220704-038）、五味子醇甲（批號(hào)：DSTDW001001）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：DSTDL006101）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：DSTDR000902）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate?ODS-3（4.6×250 mm，5 μm），柱溫30℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，洗脫序列見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間表

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液制備：精密稱取金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1適量，甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.530 mg/mL、0.517 mg/mL、0. 871 mg/mL、0.556 mg/mL、0.744 mg/mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取上述各儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度為0.0530 mg/mL、0.0510 mg/mL、0.0871 mg/mL、0.0556 mg/mL、0.0744 mg/mL混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備：取自制明目益睛丸粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入85%甲醇40 mL，稱重，超聲50 min，放冷，用85%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

陰性對(duì)照品溶液制備：按處方比例，分別取缺鹽菟絲子、五味子、青皮、鹽車(chē)前子、三七采用同供試品制備工藝，制備陰性樣品后，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶液與2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。由圖1可知，各成分峰形完整，與其他相鄰峰分離度均大于1.5，且空白溶液及陰性對(duì)照品相應(yīng)位置處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性試驗(yàn) 精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇適量稀釋成系列梯度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），結(jié)果見(jiàn)表2，各成分r均大于0.9995，表明線性關(guān)系良好。

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn) 照2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1峰面積的RSD均小于3%，分別為0.71%、0.74%、2.24%、0.20%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，放置0、2、4、6、8、12、18、24 h后，照2.1項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果，5個(gè)化學(xué)成分峰面積的RSD均小于3%，依次為0.46%、0.74%、0.20%、0.52%、1.89%，說(shuō)明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次明目益睛丸樣品共6份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積。根據(jù)線性曲線方程計(jì)算各成分含量。結(jié)果見(jiàn)表，5種成分的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的明目益睛丸6份，每份約1.0 g，精密稱定，按已知含量的100%加入混合對(duì)照品，照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同2.1項(xiàng)下進(jìn)樣條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 含量測(cè)定

取3批自制明目益睛丸，按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液后，照2.1項(xiàng)下進(jìn)樣條件進(jìn)行含量測(cè)定，各批次平行測(cè)定3次，5種有效成分平均含量結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種有效成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定明目益睛丸中金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1成分含量。該檢測(cè)方法下各成分線性曲線相關(guān)系數(shù)≥0.9995，精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD值均小于3%，加樣回收率在90%～110%之間，表明該方法穩(wěn)定可行。

在測(cè)定各成分含量時(shí)，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，選擇乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合峰形分離度及響應(yīng)值等因素，最終確定以乙腈-0.1%磷酸水作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相條件。同時(shí)分別對(duì)柱溫25℃、30℃、35℃及流速0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min進(jìn)行考察，確定以柱溫30℃、流速1 mL/min作為此實(shí)驗(yàn)的進(jìn)樣條件。

本實(shí)驗(yàn)所建立的方法重現(xiàn)性好、穩(wěn)定可靠，為明目益睛丸的有效成分含量測(cè)定提供了簡(jiǎn)便方法，同時(shí)為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。