口服大黃酸超分子納米粒的制備與表征及其巨噬細(xì)胞靶向性能研究

聶文彪，林大勝,2，高飛

大黃酸（Rhein，RH），又稱大黃苷，是一種天然植物蒽醌，主要存在于蓼科植物中，為大黃、何首烏、蘆薈和番瀉葉等多種中藥的主要生物活性成分之一[1]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有羥基和羧基，極性較強(qiáng)，呈弱酸性，為咖啡色針狀結(jié)晶，升華后為黃色針狀結(jié)晶，幾乎不溶于水，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚、石油醚，能溶于吡啶、碳酸氫鈉水溶液等堿溶液中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，RH藥理用途十分廣泛，具有抗炎，抗腫瘤，抗菌，降糖調(diào)脂，調(diào)節(jié)免疫和抗動(dòng)脈硬化等作用，在臨床上用于淋病，炎癥性疾病和代謝性疾病的輔助治療，其可培植衍化多種藥物，是治療骨關(guān)節(jié)炎的良藥“雙醋瑞因”的主要原料，也是配制保健品的最佳原料，可起到降脂減肥、通便排毒、清潔內(nèi)環(huán)境的效果[2-5]。由此可見(jiàn)，RH在醫(yī)藥領(lǐng)域和功能保健食品領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景。然而，RH溶解性差、生物利用度低，靶向性能差及大劑量服用具有肝毒性風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，很大程度上限制了它的臨床用途。

近年來(lái)，超分子聚合物因其在生物技術(shù)、納米傳感、藥物傳遞和基因診斷和治療等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用而受到了廣泛的關(guān)注[6]。由聚合物自組裝形成的超分子納米通常具有規(guī)則的球形核殼結(jié)構(gòu)。它們的疏水核可以與治療藥物在物理或化學(xué)上相互作用，從而可作為封裝疏水性藥物的納米級(jí)容器，而親水殼層可以與溶劑相互作用，提高納米粒子的穩(wěn)定性。超分子聚合物通常是高度取向的，并通過(guò)非共價(jià)弱相互作用結(jié)合在一起，如氫鍵、主客體相互作用、π-π堆積、金屬配位鍵和靜電相互作用。其中，主客體相互作用具有選擇識(shí)別性，需要主體和客體分子之間大小和結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)[7,8]。目前，環(huán)糊精與金剛烷之間的主客體相互作用已得到廣泛認(rèn)可，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以此為契機(jī)，開(kāi)發(fā)出了多種智能口服納米遞藥系統(tǒng)[9-11]。基于以上背景，本研究以環(huán)糊精與金剛烷這對(duì)主客體分子為基礎(chǔ)，分別對(duì)二者加以修飾，通過(guò)主客體相互作用自組裝包載疏水性藥物RH，制備RH超分子納米粒子，并采用殼聚糖-果膠復(fù)合聚電解質(zhì)（CP）對(duì)其進(jìn)行包裹，以能夠?qū)崿F(xiàn)安全穩(wěn)定的口服遞送；最后，對(duì)制備出來(lái)的納米粒子進(jìn)行理化性質(zhì)表征，同時(shí)也對(duì)該納米粒子的巨噬細(xì)胞靶向性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Litesizer 500激光粒度分析儀，安東帕（上海）商貿(mào)有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；ESJ205-S電子分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；HMS-901D6聯(lián)多點(diǎn)加熱磁力攪拌器，深圳市博大精科生物科技有限公司；JEM 2100F透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；TSC SP8激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司；AVANCE NEO 700M核磁共振波譜儀，D8 X射線衍射儀，德國(guó)Bruker公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀, 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

單(6-氨基-6-去氧)-β-環(huán)糊精（C D，批號(hào)Z220820），山東濱州智源生物科技有限公司; 硫代羥基乙酸酐（TA，批號(hào)M220522），上海麥克林生化科技有限公司；維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，批號(hào)C220318），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；金剛烷胺（AD，批號(hào)R220416），上海羅恩科技發(fā)展有限公司；葉酸（FA，批號(hào)XC220312），深圳金富源生物科技有限公司；大黃酸（RH，批號(hào)wkq22052602，純度≥98%），四川維克奇生物科技有限公司；香豆素6（C6），上海譜振生物科技有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、4-二甲氨基吡啶（DMAP），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；二甲基亞砜（DMSO），北京匯?？苾x科技有限公司；甲醇，北京迪科馬科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 主體聚合物CD-TA-TPGS的合成與分析

根據(jù)?；磻?yīng)的基本原理，采用TA作為酰化試劑合成主體聚合物CD-TA-TPGS[12]。具體如下：將CD、TA（按2：3的比例）和少許催化劑DMAP一起溶解在20 ml DMSO中，并向其中滴加少許三乙醇胺共同攪拌24 h；然后利用透析技術(shù)除去反應(yīng)溶液中的DMSO和少許雜質(zhì)，再通過(guò)真空冷凍干燥得到中間體CD-TA。之后，將得到的CD-TA粉末復(fù)溶于20 ml DMSO中，并向其中加入與CD等量的TPGS和少量催化劑EDC與DMAP，在溶解完全后在50 ℃下反應(yīng)24小時(shí)，然后同樣經(jīng)透析技術(shù)去除DMSO和雜質(zhì)，再通過(guò)真空冷凍干燥最終獲得主體聚合物CD-TA-TPGS。通過(guò)核磁共振波譜儀和傅里葉變換紅外光譜儀驗(yàn)證CD-TA-TPGS的成功合成，結(jié)果見(jiàn)圖1～2所示。圖1顯示了CD、CD-TA、TPGS和CDTA-TPGS四種物質(zhì)的核磁共振氫譜圖。在CD-TA譜圖中，CD的質(zhì)子峰幾乎全部被包括在內(nèi)，并在8.61 ppm（a）處出現(xiàn)了一個(gè)新的質(zhì)子峰，代表新生成的酰胺基團(tuán)上氫的信號(hào)峰，表明CD和TA成功接枝在一起。此外，從CD-TA-TPGS譜圖中可以看出，0.83 ppm（c）是TPGS維生素E長(zhǎng)鏈甲基端氫的信號(hào)峰；1.00～1.71 ppm為維生素E長(zhǎng)鏈上不同環(huán)境亞甲基氫的信號(hào)峰; 2.52 ppm（d）是維生素E苯并二氫吡喃環(huán)4位亞甲基上氫的信號(hào)峰，2.66 ppm（e）和2.84 ppm（f）是TPGS琥珀酸鏈上兩個(gè)亞甲基上的氫信號(hào)。與CD-TA和TPGS譜圖相比，CD-TA-TPGS譜圖在5.54～5.78 ppm（b）處同樣出現(xiàn)了CD中的羥基質(zhì)子峰，并且仲酰胺基團(tuán)的氫信號(hào)峰(a)仍然存在，這些充分證實(shí)了TPGS接枝在CD-TA上，成功合成了主體CD-TA-TPGS 聚合物。傅里葉變換紅外光譜圖也進(jìn)一步證實(shí)了我們的分析。如圖2所示，與CD光譜相比，CD-TA譜圖在1651 cm-1處出現(xiàn)新的峰（C=O），表明TA成功反應(yīng)并接枝在CD上。在TPGS的譜圖中，1736 cm-1被強(qiáng)吸收，這是酯羰基的峰值（O-C=O），1115 cm-1是醚鍵（C-O-C）的拉伸振動(dòng)。與CD-TA譜圖相比，CD-TA-TPGS 譜圖具有1737 cm-1酯羰基（O-C=O）峰和1112 cm-1醚鍵（C-O-C）峰，這也表明TPGS通過(guò)酯化反應(yīng)成功與CD-TA接枝形成CD-TA-TPGS主體聚合物。

圖1 CD,CD-TA,TPGS和CD-TA-TPGS的核磁共振氫譜圖

圖2 CD，CD-TA，TPGS和CD-TA-TPGS的傅里葉紅外光譜圖

2.2 客體聚合物FA-AD的合成與分析

根據(jù)酰胺反應(yīng)的基本原理，在EDC/NHS這對(duì)常用的氨基和羧基接枝催化試劑的加入下，合成了客體共聚物FA-AD[13]。簡(jiǎn)言之，先將FA和EDC/NHS溶解在含有20 ml CDDMSO的帶塞錐形瓶中，并置于磁力攪拌器上攪拌1 h以活化羧基，然后再加入AD并在50 °C的溫度下共同攪拌24 h,之后將獲得的溶液倒入透析袋（Mr500 Da）中，并放置再去離子水中透析；最后，通過(guò)真空冷凍干燥獲得客體聚合物FA-AD。同樣采取核磁共振波譜儀和傅里葉變換紅外光譜驗(yàn)證FA-AD的合成，結(jié)果見(jiàn)圖3～4。圖3所示，2.04（a）和1.57（b）處的特征質(zhì)子峰分別歸因于AD單元的（-CH2）3CH和（-CH2）（-NH2）CCH2-。8.70（c）、4.54（d）、6.99（e）、6.70（f）、7.70（g）、8.19（h）、4.38（i）、1.94（j）、2.36（k）和11.51（m）ppm處的峰分別歸因于FA單元的-N=CH-、-CH2NH-、 -NHPh-、-Ph鄰位氫、-Ph間氫、-PhCONH-、-CONHCHCOOH-、-CH2CH2COOH、-CH2COOH和-COOH。比較FA、AD和FA-AD的核磁共振氫譜可以看出，F(xiàn)A-AD幾乎包含了FA和AD的所有特征峰。在FA-AD光譜中，屬于FA的羧基質(zhì)子峰（11.51 ppm）的消失，并且在8.07 ppm代表的酰胺基質(zhì)子峰低于FA中的原始酰胺質(zhì)子峰（8.19 ppm），這可能與引入AD引發(fā)的屏蔽效應(yīng)有關(guān)。以上這些證明了FA-AD聚合物的成功合成。傅里葉變換紅外光譜進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論。如圖4所示，F(xiàn)A在3120 cm-1處屬于O-H的特征吸收峰未反映在FA-AD光譜中。此外，F(xiàn)A-AD光譜顯示1696 cm-1（C=O），1608 cm-1（N-H）和1183 cm-1（C-N），表明存在酰胺鍵。相較之在FA光譜中，這些峰略有變化，這可能是由FA和AD反應(yīng)形成新的酰胺鍵引起的。此外，在FA-AD光譜中，AD在2904 cm-1、2848 cm-1和1337 cm-1處的峰值略微偏移至2912 cm-1、2851 cm-1和1305 cm-1，表明FA與AD之間存在相互作用。因此，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FA-AD的成功合成。

圖3 AD，F(xiàn)A和FA-AD的核磁共振氫譜圖

圖4 AD，F(xiàn)A和FA-AD的傅里葉紅外光譜圖

2.3 CP-FA-RH NPs的制備

CP-FA-RH NPs的步驟主要分為以下三個(gè)步驟：第一步，稱取RH 1 mg，CD-TA-TPGS 10 mg,分別溶解于1 ml DMSO溶液中,超聲渦旋直至溶解，然后同時(shí)緩慢滴入裝有20 ml純水的燒杯中，反應(yīng)1 h后，通過(guò)透析技術(shù)除去DMSO得到RH NPs溶液；第二步，稱取2 mg FA-AD，同樣溶于1 ml DMSO溶液中，超聲渦旋并用0.8 μm微孔濾膜過(guò)濾，以得到清晰明亮的FA-AD溶液，然后，在超聲處理?xiàng)l件下，將該溶液滴加到RH NPs溶液中，30 min后再將這溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中以除去DMSO得到FA-RH NPs溶液；最后一步，將殼聚糖溶液與果膠溶液以2：1的比例攪拌均勻后，滴入上一步制備的溶液中，然后再放置于磁力攪拌器上，勻速攪拌1 h后得到最終的CP-FARH NPs溶液。制備出的CP-FA-RH NPs溶液呈現(xiàn)澄清黃色狀，無(wú)渾濁或沉淀析出，表明CP-FA-RH NPs溶液體系分布均一且穩(wěn)定。對(duì)于每一步形成的NPs溶液，測(cè)定其平均粒徑、PDI和Zeta電位，結(jié)果如表1所示（n=3）。相較于RH NPs，F(xiàn)A-RH NPs的粒徑從110.93±2.39 nm增加到117.59±2.00 nm，Zeta電位從-11.2±0.3 mV降低到-13.1±0.3 mV，這些變化歸因于主客體聚合物相互結(jié)合成功；另外，最終CP-FARH NPs粒徑達(dá)到220.53±2.13 nm, Zeta電位逆轉(zhuǎn)為20.6±1.8 mV，表明聚電解質(zhì)CP在靜電相互作用力下成功吸附在納米粒子表面，證實(shí)了CP-FA-RH NPs的成功制備。此外，值得一提的是，在整個(gè)制備過(guò)程中，PDI值都很小，表明了制備的CP-FA-RH NPs粒徑分布均一，穩(wěn)定性好，從圖5 CP-FA-RH NPs的粒徑分布柱狀圖中也印證了這一點(diǎn)。

表1 每一步形成NPs的粒徑，PDI和Zeta電位

圖5 CP-FA-RH NPs的粒徑分布圖

2.4 大黃酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Comatex-C18柱(250 mm*4.6 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水(85:15)；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl[14]。

2.4.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取RH對(duì)照品2.08 mg，置于100 ml容量瓶中，加入適量甲醇超聲振蕩溶解，再稀釋定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為20.8 μg·mL-1的RH對(duì)照品溶液。分別精密吸取RH對(duì)照品溶液1 ml，750 μl，375 μl，250 μl，187.5 μl，125 μl，93.75 μl，62.5 μl置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲振蕩，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后加入棕色樣品瓶中，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μl測(cè)定峰面積，以RH對(duì)照品質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖6），得到線性回歸方程為y=27325x-821.14，R2=0.9995，表明大黃酸線性關(guān)系良好。

圖6 RH含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3 CP-FA-RH NPs樣品中大黃酸含量測(cè)定 精密量取1 ml CP-FA-RH NPs溶液置于25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲破乳5 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后得樣品溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算出該樣品中RH的質(zhì)量濃度為1.21 μg·mL-1，并用以下公式計(jì)算出CP-FARH NPs樣品中大黃酸的包封率（EE%）和載藥量（LE%）[15]。

按以上公式計(jì)算出EE%為75.84%，LE%為5.06%，表明RH在CP-FA-RH NPs納米體系中裝載性能好，有效提高了RH的生物利用度，為該納米制劑開(kāi)發(fā)口服治療疾病奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.5 CP-FA-RH NPs的微觀形貌及X射線衍射圖譜

2.5.1 CP-FA-RH NPs的微觀形貌 量取1ml CP-FA-RH NPs溶液，用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，緩慢滴在具有碳支持膜的銅網(wǎng)上，停留5 min左右，用濾紙吸去多余液體，然后再用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染2 min，自然晾干后，在200 nm尺寸下用透射電子顯微鏡觀察CP-FA-RH NPs的微觀形貌。結(jié)果見(jiàn)圖7，CP-FA-RH NPs呈圓球形，大小均勻，粒子之間無(wú)粘連，成型性好。

圖7 CP-FA-RH NPs的微觀形貌圖

2.5.2 X射線衍射圖譜 按照CP-FA-RH NPs的制備流程，在不加RH的條件下，制備空白納米溶液（blank NPs），通過(guò)真空冷凍干燥獲取blank NPs粉末和CPFA-RH NPs粉末。利用X射線衍射儀在40 kV、40 mA條件下，用5°/min的速度從5°掃描到90°，對(duì)RH粉末、所有材料混合物粉末，blank NPs粉末和CP-FARH NPs粉末進(jìn)行晶型分析。結(jié)果如圖8所示，RH圖譜在15°至90°的范圍內(nèi)顯示出許多尖銳的峰，表明了RH典型的晶體特性。相比之下，這些尖銳的峰沒(méi)有出現(xiàn)在blank NPs和CP-FA-RH NPs中，這表明RH與所有載體基質(zhì)之間沒(méi)有形成任何結(jié)晶配合物，并以無(wú)定形狀態(tài)成功包載在載體基質(zhì)中。

圖8 X射線衍射圖譜

2.6 巨噬細(xì)胞靶向性能研究

2.6.1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw 264.7）購(gòu)自上海蓋恩生物科技有限公司，在含有10%熱滅活胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有細(xì)胞均置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

2.6.2 靶向性能評(píng)估 為了探究FA功能化的CP-FARH NPs的靶向能力，采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)巨噬細(xì)胞攝取進(jìn)行可視化圖像分析。由于RH無(wú)熒光特性，因此利用疏水熒光探針香豆素6（C6）代替RH進(jìn)行示蹤。此外，基于口服納米遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建，評(píng)估CP-FA-C6 NPs的靶向性能需要腸道菌群對(duì)CP層進(jìn)行降解，然后再觀察巨噬細(xì)胞對(duì)FA-C6 NPs的攝取[16]。因此，在沒(méi)有腸道菌群相互作用的情況下，僅在FA-C6 NPs、C6 NPs和Free C6組進(jìn)行靶向攝取分析，而在CP-FA-C6 NPs組中不進(jìn)行分析。首先，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw 264.7細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿中，每皿接種約 1×105個(gè)細(xì)胞，然后放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h；待細(xì)胞貼壁后，棄掉原培養(yǎng)基，分別加入含F(xiàn)A-C6 NPs、C6 NPs和Free C6的新鮮培養(yǎng)基（以C6計(jì)，濃度為 100 ng·mL-1）并繼續(xù)放置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育；4 h后，再次棄掉皿中培養(yǎng)基，用冷PBS清洗3次，然后加入4%多聚甲醛固定10 min，再用冷PBS清洗3次后，加入1 ml DAPI溶液,10 min后再次吸取冷PBS進(jìn)行清洗；最后，加入抗熒光猝滅劑，將小皿放置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，綠色熒光代表C6標(biāo)記的NPs。結(jié)果如圖9所示，在Free C6組中觀察到較差的綠色熒光，弱于C6 NPs組和FA-C6 NPs組；其中，F(xiàn)A-C6 NPs組觀察到的熒光最亮，表明FA功能化的NPs更容易被Raw 264.7細(xì)胞攝取。為了確認(rèn)由巨噬細(xì)胞表面FA受體介導(dǎo)的FA功能化NPs的靶向攝取，采用游離FA溶液預(yù)處理細(xì)胞1h，然后再分別與C6 NPs和FA-C6 NPs一起孵育4 h。結(jié)果表明，與未使用游離FA溶液預(yù)處理的FA-C6 NPs組相比，游離FA溶液預(yù)處理后FA-C6 NPs組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著降低。然而，在C6 NPs組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的變化，進(jìn)一步闡明了FA-C6 NPs通過(guò)FA介導(dǎo)的內(nèi)吞作用特異性被Raw 264.7細(xì)胞靶向攝取。結(jié)合以上結(jié)果，本文研究設(shè)計(jì)制備的CP-FA-RH NPs具備靶向巨噬細(xì)胞的能力，為以后開(kāi)發(fā)或借鑒用于靶向治療提供了良好的基礎(chǔ)。

圖9 巨噬細(xì)胞對(duì)不同納米制劑靶向攝取圖

3 討論

早些年前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就在超分子診療理念中指出了基于超分子聚合物構(gòu)建納米遞藥系統(tǒng)的可行性和有效性[17]。超分子納米遞藥系統(tǒng)可以在水溶液和鹽溶液中保持完整的結(jié)構(gòu)。在過(guò)去幾年的研究中，很多超分子納米載藥平臺(tái)在癌癥治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，其中一些已獲準(zhǔn)用于臨床癌癥治療，如Doxil（聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素）、Onivyde（伊立替康脂質(zhì)體）和Abraxane（白蛋白結(jié)合紫杉醇）等[18-20]。本研究開(kāi)發(fā)合成聚合物CD-TA-TPGS，結(jié)合主客體相互作用力和靜電相互作用力，逐步將FA-AD和CP吸附在其表面，最終成功制備出了具備口服靶向巨噬細(xì)胞的大黃酸超分子納米粒CP-FA-RH NPs，它不僅有效解決了RH溶解度低，生物利用度差的問(wèn)題，還有效實(shí)現(xiàn)了RH的靶向遞送，大大減少了其在疾病治療上對(duì)健康組織帶來(lái)的損傷，有望滿足日益增長(zhǎng)的醫(yī)療需求。然而，盡管如此，在應(yīng)對(duì)復(fù)雜的病理環(huán)境，超分子納米靶向遞藥系統(tǒng)的性能優(yōu)化依然成為臨床治療發(fā)展的重中之重，對(duì)于載藥體系的生物穩(wěn)定性、安全性、體內(nèi)分布和代謝途徑等等的系統(tǒng)研究迫在眉睫，而考察和評(píng)價(jià)其在不同層面的作用和治療效果并逐步走向臨床也尚需時(shí)日。