狄斯瓦螨VdesNPC2b蛋白的基因克隆、原核表達及其與寄主幼蟲信息素結(jié)合機制研究

劉深云, 王佳麗, 袁星光, 王彩蝶, 涂婉鈞, 周雯潤, 李紅亮, 吳 帆

(中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 浙江省生物計量及檢疫檢驗重點實驗室, 杭州 310018)

狄斯瓦螨Varroadestructor是蜜蜂的一種外寄生螨,依靠吸食蜜蜂蛹和成蟲的脂肪體和血淋巴生存繁殖,這導(dǎo)致蜜蜂體質(zhì)衰弱和發(fā)育不良(Ramseyetal., 2019)。同時,狄斯瓦螨還攜帶有多種病毒,使蜜蜂出現(xiàn)殘翅和畸形等癥狀,致使蜂群變?nèi)踔敝帘罎⑾?Wilfertetal., 2016)。目前,狄斯瓦螨已成為全球養(yǎng)蜂業(yè)威脅最大的蜜蜂病蟲害之一(Traynoretal., 2020)。狄斯瓦螨整個生活周期都依賴于宿主蜜蜂,寄生過程包括繁殖期(reproductive phase)和攜播期(phoretic phase)兩個階段,繁殖期寄生于封蓋巢房內(nèi)的幼蟲和蛹,攜播期寄生于工蜂的胸部和腹部等(Zakaretal., 2014)。所以,宿主化學(xué)物質(zhì)和外界環(huán)境的變化對狄斯瓦螨生活史有重要影響。研究表明,狄斯瓦螨可以感知化學(xué)物質(zhì)、光和溫度等因素的細微變化,但并沒有證據(jù)表明狄斯瓦螨對光和溫度等的感知能力與宿主定位和寄生有關(guān)(Rosenkranzetal., 2010; Smolińskietal., 2021)。比如溫度,蜂箱內(nèi)正常溫度維持在34.5～35.0 ℃,但狄斯瓦螨偏好的溫度卻是32.5～33.4 ℃(秦瑤等, 2018)。所以,宿主自身的化學(xué)物質(zhì)對調(diào)節(jié)狄斯瓦螨寄生、繁殖和產(chǎn)卵等行為卻有重要的影響。法國研究者Le Conte等(1989)在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica雄蜂幼蟲提取物中鑒定出10種酯類物質(zhì),稱為幼蟲酯類信息素(brood ester pheromone, BEP),行為觀察實驗中這些酯類物質(zhì)對狄斯瓦螨有吸引作用,且昆蟲觸角電位儀(electroantennography, EAG)實驗也表明狄斯瓦螨對這些化學(xué)物質(zhì)有反應(yīng)(Light et al., 2020)。隨后,他們又發(fā)現(xiàn)這些酯類物質(zhì)的含量在不同日齡幼蟲以及同日齡的工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲之間有差異(Slessoretal., 2005),這可能是狄斯瓦螨對不同幼蟲選擇寄生的原因之一。由于這種長鏈脂肪酸的酯類物質(zhì)沸點高而揮發(fā)性低,很難遠距離發(fā)揮作用,且研究者在Y型嗅覺儀的引誘實驗中沒有觀察到狄斯瓦螨對這些酯類的偏好性選擇(Pernaletal., 2005)。Maisonnasse等(2009)和Pinnelli等(2016)利用固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-Mass spectrometer, GC-MS)在幼蟲中鑒定到一種揮發(fā)性成分——β-羅勒烯,發(fā)現(xiàn)它在狄斯瓦螨寄生的幼蟲和非寄生的幼蟲中含量不同,且電生理反應(yīng)表明狄斯瓦螨對其有反應(yīng)。目前,對于狄斯瓦螨如何識別幼蟲酯類信息素或β-羅勒烯的作用機理還不清楚。

化學(xué)感受是自然界中最原始和最早出現(xiàn)的感受方式之一,而基于嗅覺系統(tǒng)的化學(xué)識別又是節(jié)肢動物門普遍存在的化學(xué)感受方式(Leal, 2013)。研究者已經(jīng)確定有多種蛋白參與這個過程,其中氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 proteins, NPC2)等是化學(xué)感受系統(tǒng)的第1個參與者,負責(zé)結(jié)合和轉(zhuǎn)運氣味或信息素分子通過淋巴液到達受體蛋白(Leal, 2013; 吳帆等, 2021)。早期,Iovinella等(2018)通過蛋白質(zhì)組技術(shù)在狄斯瓦螨嗅覺相關(guān)的器官中(包括前足和口器等組織)鑒定到了幾個NPC2蛋白,而這些NPC2與幼蟲化學(xué)物質(zhì)結(jié)合作用的相關(guān)研究還未見報道。本研究通過克隆狄斯瓦螨VdesNPC2b,以pET-30a載體構(gòu)建原核表達體系,誘導(dǎo)VdesNPC2b重組蛋白表達;然后通過熒光競爭結(jié)合實驗檢測VdesNPC2b與主要蜜蜂幼蟲信息素油酸甲酯和β-羅勒烯的結(jié)合力,并利用變溫實驗分析VdesNPC2與油酸甲酯和β-羅勒烯結(jié)合機制;最后,利用同源建模和分子對接模擬分別初步分析VdesNPC2b與β-羅勒烯結(jié)合時的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵氨基酸。本研究對于了解狄斯瓦螨的寄生機制和生物防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

狄斯瓦螨由福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供,從意大利蜜蜂工蜂幼蟲的巢房中抓取,取樣時間為2020年8月份,加入200 μL RNAlater,投入液氮速凍后于-70 ℃冰箱保存。RNAlater試劑和SDS-PAGE凝膠試劑盒購買于碧云天,RNAqueous?-Micro Kit微量總RNA提取試劑盒購于Ambion公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Reverse Transcriptase System、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體、以及實驗中所用限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司,Ni2+瓊脂糖柱購買于北京全式金生物公司,大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞和pET-30a表達載體為本實驗室自備,氨芐青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)和甲醇等化學(xué)試劑均購自上海生工公司,1-NPN(純度>97%)購買于梯希愛(TCI)公司,蜜蜂幼蟲信息素化合物油酸甲酯(純度>99%)和β-羅勒烯(純度>90%)購買于Sigma-aldrich。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

利用RNAqueous?-Micro Kit試劑盒提取狄斯瓦螨總RNA,然后用PrimeScript Reverse Transcriptase System試劑盒合成cDNA第1鏈。

1.3 狄斯瓦螨VdesNPC2b基因克隆和序列分析

基于狄斯瓦螨基因組測序結(jié)果(NCBI參考序列號: XM_022793576.1)設(shè)計擴增VdesNPC2b開放讀碼框(open reading frame, ORF)的引物,并在正反向引物中分別引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶切位點(下劃線標識),正向引物NPC2b-F:5′-GGATCCATGCTTAGATTTGTCATGCTGGCT-3′;反向引物NPC2b-R:5′-AAGCTTCTATTCGTCATCCTCTTGATT GTCT-3′。以1.2節(jié)cDNA為模板擴增目的基因,PCR反應(yīng)體系: 2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃變性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的片段并與pMD18-T連接構(gòu)建克隆載體,菌液PCR鑒定陽性克隆后送去測序。測序結(jié)果經(jīng)Editseq軟件分析,獲得VdesNPC2bORF,并預(yù)測氨基酸序列。然后利用BLASTX軟件(http:∥blsat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列相似性比對,利用MegAlign比對以及MEGA5.0軟件的鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,使用在線信號肽軟件SignalP 6.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測信號肽序列。

1.4 狄斯瓦螨VdesNPC2b重組蛋白與純化

分析確定信號肽后設(shè)計引物用于表達不含信號肽重組蛋白。正向引物pNPC2b-F:5′-GGATCCGG AGAACTCTACAAGGTCCA-3′;反向引物pNPC2b-R:5′-AAGCTTCTATTCGTCATCCTCTTGATTG-3′。提取重組pMD18-T質(zhì)粒進行BamHⅠ和HindⅢ酶切,回收產(chǎn)物連接至pET-30a,連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,測序驗證后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。以1∶100(v/v)將含pET-30a/VdesNPC2b質(zhì)粒的BL21(DE3)細菌接種至200 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)至OD600達0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,在30 ℃ 200 r/min條件誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。收集菌液進行裂解,超聲破碎后離心分上清和沉淀,通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。確定表達后利用Ni2+瓊脂糖柱(全式金ProteinIso Ni-NTA Resin)純化,具體方法見操作說明,利用含有8 mol/L尿素的PBS進行復(fù)性和透析,然后用BCA試劑盒(全式金Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit)配制標準溶液,用酶標儀(瑞士TECAN Genios)測定蛋白濃度。

1.5 熒光競爭結(jié)合實驗

以1-NPN作為VdesNPC2b與配基結(jié)合特性研究的競爭性熒光報告子,用1-NPN進行連續(xù)滴定,記錄蛋白熒光發(fā)射光譜,直至蛋白最大熒光值猝滅終止。然后依據(jù)競爭結(jié)合實驗研究VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯結(jié)合力。首先把能使蛋白峰值完全猝滅的1-NPN量加入到濃度為1 μmol/L VdesNPC2b蛋白中,然后將甲醇配制的濃度為10 mmol/L的油酸甲酯和β-羅勒烯滴定蛋白,記錄熒光發(fā)射光譜和最大熒光值。根據(jù)下列方程計算配基解離常數(shù)(KD值):KD=[IC50]/(1+[1-NPN] K1-NPN)。公式中[IC50]為替換50%的1-NPN時的候選配基濃度,[1-NPN]是反應(yīng)平衡時混合物中游離的1-NPN濃度,K1-NPN為VdesNPC2b與1-NPN結(jié)合時的解離常數(shù)。

1.6 VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯的結(jié)合機制分析

為分析VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯相互作用機制,本研究通過熒光光譜變溫試驗測試22和32 ℃下油酸甲酯和β-羅勒烯對1 μmol/L VdesNPC2b熒光猝滅變化,分析油酸甲酯和β-羅勒烯的猝滅機制。熒光猝滅方式包括動態(tài)和靜態(tài)猝滅,分析方程為:F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q],公式中F0和F分別為配基加入前后體系的熒光強度;Kq為熒光猝滅速率常數(shù);τ0為無配基時熒光分子的平均壽命;[Q]為配基的濃度;KSV為雙分子猝滅過程常數(shù)。若結(jié)合過程為動態(tài)猝滅,則KSV隨溫度升高而增大;若結(jié)合過程為靜態(tài)猝滅,則KSV隨溫度升高將減小(Atrahimovichetal., 2012)。雙對數(shù)方程:lgF0-F/F=lgKA+nlg[Q],公式中F0, F和[Q]的含義與猝滅方程相同,KA是表觀結(jié)合常數(shù)。配基與蛋白之間的相互作用力可以通過變溫實驗計算得來的吉布斯自由能(ΔG)、焓變(ΔH)、熵變(ΔS)的能量變化反應(yīng)。維持穩(wěn)態(tài)的作用力主要是氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力等,熱力學(xué)關(guān)系為:ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS,ΔH=RT1T2ln(K0,2/K0,1)T2-T1,ΔS=-(ΔH-ΔG)/T。其中R為氣體常數(shù),T為熱力學(xué)溫度(T1為相對低溫,T2為相對高溫), K為結(jié)合常數(shù)。ΔG, ΔH和ΔS可以反映蛋白與小分子之間的主要作用力。當(dāng)ΔH<0,ΔS>0時,維持二者主要作用力為疏水作用和靜電作用;當(dāng)ΔH<0,ΔS<0時,維持二者的主要作用力表為氫鍵和范德華力;當(dāng)ΔH>0,ΔS>0,維持二者穩(wěn)態(tài)的作用力為疏水作用(Zhangetal., 2023)。

1.7 同源建模和分子對接模擬

利用在線軟件SWISS-MODLE(http:∥swissmodel.expasy.org/)分析比對,預(yù)測VdesNPC2b蛋白結(jié)構(gòu)。在NCBI的Pubchem Compound數(shù)據(jù)庫中找到β-羅勒烯(CID_5281553)三維結(jié)構(gòu),把預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)和β-羅勒烯輸入到MVD軟件中,進行分子對接模擬。通過復(fù)合物能量、是否形成氫鍵及其強弱和不同氨基酸供能等方面分析,找到VdesNPC2b與β-羅勒烯結(jié)合模型及可能關(guān)鍵氨基酸。

2 結(jié)果

2.1 狄斯瓦螨VdesNPC2b序列

克隆獲得狄斯瓦螨VdesNPC2b(GenBank登錄號: OR463903)的531 bp ORF全長序列,編碼176個氨基酸,蛋白分子量約為19.54 kD,等電點約為4.56, 其中強酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸) 26個,強堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)16個。VdesNPC2b蛋白有信號肽,信號肽切割位置位于N端第16和17位氨基酸(YA-GE)之間。VdesNPC2b二級結(jié)構(gòu)主要為β折疊,在此基礎(chǔ)上形成具有結(jié)合腔的高級結(jié)構(gòu)。

序列比對表明VdesNPC2b序列與梅氏熱厲螨Tropilaelapsmercedesae附睪分泌蛋白E1(GenBank登錄號: OQR78448.1)、巴氏新小綏螨NeoseiulusbarkeriNPC2-3(GenBank登錄號: QWT69288.1)、西方盲走螨GalendromusoccidentalisNPC2(GenBank登錄號: XP003748537.1)等蛋白的氨基酸序列一致性超過50%(分別為74.17%, 52.30%和52.00%)而聚在一起,與阿根廷螞蟻LinepithemahumileNPC2(XP012215342.1)和大腹圓蛛AraneusventricosusNPC2(GenBank登錄號: GBM63140.1)等多種蛛形綱(Arachnida)或昆蟲綱(Insecta)物種相關(guān)蛋白氨基酸序列一致性在30%左右(圖1)。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的狄斯瓦螨VdesNPC2b和其他物種同源蛋白系統(tǒng)進化樹

2.2 VdesNPC2b蛋白表達及配基結(jié)合

成功表達VdesNPC2b重組蛋白,其以上清形式表達,經(jīng)鎳柱純化后用含梯度尿素的PBS透析,獲得目的蛋白(圖2)。1-NPN滴定結(jié)果表明,其與VdesNPC2b蛋白較好,K1-NPN值為2.06 μmol/L(圖3: A),可以作為配基結(jié)合力分析的熒光報告子。熒光競爭結(jié)合分析結(jié)果顯示,VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯的KD值分別為2.89和3.49 μmol/L(圖3: B)。

圖2 VdesNPC2b重組蛋白誘導(dǎo)表達及純化

圖3 VdesNPC2b重組蛋白與1-NPN(A)和油酸甲酯和β-羅勒烯(B)競爭結(jié)合曲線

2.3 VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯的結(jié)合機制

在22和32 ℃兩個不同溫度下, 油酸甲酯和β-羅勒烯滴定VdesNPC2b的熒光值均發(fā)生規(guī)律性變化。Stern-Volmer方程顯示,當(dāng)溫度上升時,油酸甲酯和β-羅勒烯猝滅VdesNPC2b的斜率Ksv升高(圖4),表明兩者結(jié)合過程為動態(tài)猝滅,其他參數(shù)見表1。

表1 22和32 ℃溫度下VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯的結(jié)合常數(shù)(KA)和熱力學(xué)參數(shù)

圖4 22和32 ℃溫度下油酸甲酯和β-羅勒烯對VdesNPC2b熒光猝滅的Stern-volmer圖

進一步分析表明,油酸甲酯和β-羅勒烯在與VdesNPC2b結(jié)合時吉布斯自由能△G<0,說明它們的結(jié)合是自發(fā)進行的,不需要額外的外部作用力;焓變△H>0和熵變△S>0,說明維持VdesNPC2b蛋白和油酸甲酯和β-羅勒烯的相互作用力為疏水作用力(Zhangetal., 2023)。

2.4 同源建模和分子對接模擬結(jié)果

蛋白氨基酸序列比對顯示,VdesNPC2b與粉塵螨DermatophagoidesfarinaeDerf2蛋白(2f08.1)相似度達到30.73%,基于其結(jié)構(gòu)模擬確定VdesNPC2b的二級結(jié)構(gòu)主要為6個β-折疊,在此基礎(chǔ)上形成的高級結(jié)構(gòu)內(nèi)部具有1個潛在的配基結(jié)合腔(圖5: A)。

圖5 重組蛋白VdesNPC2b同源建模(A)及其與β-羅勒烯分子對接模擬(B)

MVD軟件對接模擬結(jié)果表明,β-羅勒烯可以在VdesNPC2b的結(jié)合腔中結(jié)合(圖5: B),多個氨基酸對維持二者的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用,關(guān)鍵氨基酸位點可能是Leu68,Ile103和Phe107等。

3 討論

本研究以狄斯瓦螨嗅覺蛋白VdesNPC2b為研究對象,初步探索了VdesNPC2b蛋白識別蜜蜂幼蟲信息素油酸甲酯和β-羅勒烯的功能及其結(jié)合機制,這對于探索高效的狄斯瓦螨生物防治具有重要意義。

NPC2蛋白是節(jié)肢動物中一類具有化學(xué)結(jié)合和轉(zhuǎn)運功能的新型結(jié)合蛋白,近年來受到越來越多的關(guān)注。通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析,研究者在狄斯瓦螨中發(fā)現(xiàn)了 6 個潛在的NPC2家族蛋白, 而且它們在化學(xué)感受器官中有表達(Eliashetal., 2017; Iovinellaetal., 2018)。進一步對VdesNPC2進行基因干擾,發(fā)現(xiàn)它能有效地影響狄斯瓦螨對宿主的選擇和取食,也會導(dǎo)致其繁殖力和存活率降低(Ngansoetal., 2021),說明VdesNPC2在狄斯瓦螨寄主識別中發(fā)揮作用。本研究擴增了VdesNPC2b,結(jié)構(gòu)分析確定它具有NPC2家族特征的MD-2-related lipid-recognition (ML)結(jié)構(gòu)域,蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),其與已報道的相關(guān)蛋白相似度超過50%的只有梅氏熱厲螨、巴氏新小綏螨和西方盲走螨的相關(guān)蛋白,表明該鄰域相關(guān)蛋白的研究還較少。其中,巴氏新小綏螨NPC2-3蛋白已有報道其與嗅覺識別相關(guān),可能參與取食等行為(Lietal., 2020)。VdesNPC2b的二級結(jié)構(gòu)主要為6個β-折疊(圖5),在此基礎(chǔ)上形成具有結(jié)合腔的高級結(jié)構(gòu),有研究表明這種易變的β-折疊結(jié)構(gòu)使其有利于結(jié)合長鏈脂肪酸、醇和醋酸鹽等化學(xué)物質(zhì)(Zhengetal., 2018),而狄斯瓦螨的寄主蜜蜂幼蟲的信息素正好就是長鏈脂肪酸的酯類物質(zhì),這就暗示VdesNPC2b蛋白可能與識別蜜蜂幼蟲酯類信息素有關(guān)。

幼蟲酯類信息素是最早研究的蜜蜂信息素之一,包括油酸甲酯等10種長鏈酯類物質(zhì),在蜂群中的行為引誘實驗表明這些物質(zhì)可以吸引狄斯瓦螨,說明它們對狄斯瓦螨具有刺激作用(Le Conteetal., 1989)。然而,研究人員利用Y型嗅覺儀研究不同濃度幼蟲酯類信息素對狄斯瓦螨的引誘作用時,并沒有顯著的引誘效果 (Pernaletal., 2005)。這可能是因為10種酯類物質(zhì)的沸點高(約為200 ℃),揮發(fā)性很低,所以很難在較遠距離的情況下對狄斯瓦螨發(fā)揮作用。隨后,研究者在蜜蜂幼蟲中鑒定了另一種揮發(fā)性的信息素——β-羅勒烯 (Maisonnasseetal., 2010),發(fā)現(xiàn)它可以協(xié)同幼蟲酯類信息素在遠距離刺激工蜂的哺育行為(Wuetal., 2019)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)VdesNPC2b對油酸甲酯和β-羅勒烯都有較強的結(jié)合力(圖3),表明狄斯瓦螨有可能利用β-羅勒烯進行遠距離定位寄主,同時利用油酸甲酯等幼蟲酯類信息素來識別寄主和確定寄生行為。最近,研究者在有狄斯瓦螨寄生的蜜蜂幼蟲中鑒定到另一種酯類物質(zhì)——十四酸乙酯,電生理和Y型嗅覺儀結(jié)果表明狄斯瓦螨對其具有顯著的吸引作用(Liuetal., 2022)。所以,通過分析蜜蜂幼蟲的化學(xué)物質(zhì)來進行狄斯瓦螨的防治具有可行性。如果研究清楚酯類信息素、β-羅勒烯和十四酸乙酯的協(xié)同作用,將能更好地對狄斯瓦螨進行生物防治。本研究中,我們還發(fā)現(xiàn)VdesNPC2b與油酸甲酯和β-羅勒烯的結(jié)合機制為動態(tài)猝滅(圖4),即在高溫時(32 ℃)它們的結(jié)合力比低溫(22 ℃)下更強,而蜜蜂蜂群的溫度一般能維持(34±0.5) ℃ (Tautzetal., 2003),所以VdesNPC2在高溫時與幼蟲信息素結(jié)合力強更有利于狄斯瓦螨通過嗅覺系統(tǒng)識別寄主。此外,信息素成分的比例差異也會影響化學(xué)感受的功能 (吳帆等, 2023),目前我們尚未分析不同比例的幼蟲酯類信息素和β-羅勒烯對狄斯瓦螨的影響,后續(xù)將深入研究。