基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的中華按蚊細(xì)胞色素P450超家族基因不同發(fā)育階段、成蚊不同組織和吸血前后不同時(shí)期雌成蚊的表達(dá)模式分析

郭迎澳, 陳 斌

(重慶師范大學(xué)昆蟲(chóng)與分子生物學(xué)研究所, 媒介昆蟲(chóng)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

中華按蚊Anophelessinensis隸屬于雙翅目(Diptera)蚊科(Culicidae)按蚊屬Anopheles,是中國(guó)和及東南亞國(guó)家瘧疾、絲蟲(chóng)病和乙型腦炎的主要傳播媒介之一,造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題(Maetal., 2011)。

細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)是一類(lèi)含有血紅素結(jié)構(gòu)的超基因家族的末端氧化酶。一般來(lái)說(shuō),CYPs有5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,包括螺旋C(WxxxR)、螺旋I(GxE/DTT/S)、螺旋K(ExxR)、PERF區(qū)(PxxFxPE/DRE)和血紅素結(jié)合區(qū)(PFxxGxxxCxG)(Rupasingheetal., 2006; Aietal., 2011; Feyereisen, 2012)。CYPs幾乎存在于所有的生物體中,包括一些病毒(Griffithsetal., 2016; Omura and Gotoh, 2017),在單加氧酶系統(tǒng)中作為末端氧化酶,可以催化一分子氧原子轉(zhuǎn)移到底物上,同時(shí)將另一分子氧原子還原成水(Feyereisen, 2012),能夠催化至少60多種化學(xué)反應(yīng),參與多種內(nèi)源性化合物(如激素、信息素和脂類(lèi)等)的合成代謝和外源性化合物(藥物、農(nóng)藥、天然產(chǎn)物等)的代謝解毒(Scott and Wen, 2001; Feyereisen, 2012; Nelson, 2018; Blomquistetal., 2021; Luetal., 2021),包括在作物害蟲(chóng)和病媒害蟲(chóng)中解毒殺蟲(chóng)劑導(dǎo)致其產(chǎn)生抗性(Dermauwetal., 2020; Vontasetal., 2020)。先前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞色素P450基因在昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)具有特異性(Chungetal., 2009; Feyereisen, 2012),細(xì)胞色素P450基因經(jīng)常參與腸道和馬氏管對(duì)外源性物質(zhì)的響應(yīng)(Snyderetal., 1995; Chenetal., 2019; Li SYetal., 2021; Li Xetal., 2021),它們能夠降解內(nèi)源和外源化合物,保護(hù)細(xì)胞免受氧化和殺蟲(chóng)劑的損傷(Hakimetal., 2010)。但目前關(guān)于中華按蚊細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段、不同組織及吸血前后不同時(shí)期的表達(dá)情況還不清楚。

實(shí)驗(yàn)室前期研究鑒定出中華按蚊112個(gè)細(xì)胞色素P450基因,其中有110個(gè)基因是有完整開(kāi)放閱讀框的功能基因,這112個(gè)基因都包含有細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域,被分為4個(gè)主要家族(線(xiàn)粒體、CYP2、CYP3和CYP4家族),18個(gè)家族和50個(gè)亞家族(Yanetal., 2018)。67個(gè)基因組成9個(gè)基因簇,同一簇內(nèi)、同一基因家族內(nèi)的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)(Yanetal., 2018)。大多數(shù)細(xì)胞色素P450氨基酸序列包含5個(gè)完整且保守的基序:C螺旋、I螺旋、K螺旋、PERF和血紅素結(jié)合區(qū),但CYP329A1,CYP6P6和CYP9L2分別缺乏C螺旋、K螺旋和PERF基序(Yanetal., 2018)。

本研究以中華按蚊細(xì)胞色素P450超家族基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)量分析其在中華按蚊不同發(fā)育階段、成蚊不同組織以及吸血前后不同時(shí)期雌成蚊中的表達(dá)模式,初步篩選可能在中華按蚊生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化機(jī)制中發(fā)揮作用的細(xì)胞色素P450基因,這對(duì)于進(jìn)一步探討其表達(dá)調(diào)控和在殺蟲(chóng)劑代謝機(jī)制方面的研究奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲(chóng)

中華按蚊WX-LS采自江蘇無(wú)錫(31°59′N(xiāo), 120°29′E),在室內(nèi)27 ℃、相對(duì)濕度75%±5%、晝夜交替12 h條件下飼養(yǎng),每天給幼蟲(chóng)換兩次清水和魚(yú)苗食物,待其化蛹后,將蛹放入紗網(wǎng)封口的大紙筒中待其羽化,用10%葡萄糖溶液飼養(yǎng)成蟲(chóng);羽化3 d后,雌蚊吸食小白鼠的血液促使卵巢發(fā)育產(chǎn)卵,繁育后代。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的蚊蟲(chóng)抗藥性檢測(cè)方法,實(shí)驗(yàn)室WX-LS為溴氰菊酯敏感品系(趙彤言等, 2012)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

收集WX-LS不同發(fā)育階段(卵、1-4齡幼蟲(chóng)、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊組織(觸角、唾液腺、中腸、馬氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪體)以及吸血前(對(duì)照)和吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時(shí)雌成蚊,每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù),儲(chǔ)存在RNAlater (Qiagen)中,由北京華大基因研究中心采用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(GenBank登錄號(hào): SRR851144),重慶師范大學(xué)昆蟲(chóng)與分子生物學(xué)研究所組裝和注釋(Chenetal., 2014; Zhangetal., 2021)。由于測(cè)序量和基因長(zhǎng)度會(huì)影響原始讀段數(shù)在樣本間差異基因的比較,為了保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性,通過(guò)校正測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度,歸一化后得到基因的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值進(jìn)行后續(xù)分析。測(cè)序獲得的讀段使用TopHat映射到中華按蚊基因組上,并使用Cufflink根據(jù)FPKM值來(lái)確定基因表達(dá)量。

1.3 中華按蚊細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)量分析

基于1.2節(jié)測(cè)序得到的中華按蚊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段、成蚊不同組織和吸血后雌成蚊中的表達(dá)量。首先,將基因表達(dá)量取每樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)FPKM值的平均值,將平均值換算成Log2(均值+1),換算后的log2(FPKM+1)作為衡量細(xì)胞色素P450基因表達(dá)量的數(shù)據(jù);采用層次聚類(lèi)算法分析中華按蚊在不同發(fā)育階段、成蚊不同組織和雌成蚊吸血后的基因表達(dá)量(Lietal., 2017),將結(jié)果在TBtools軟件中用heatmap進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化(Chenetal., 2020)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞色素P450家族基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

根據(jù)中華按蚊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),整個(gè)細(xì)胞色素P450家族基因聚類(lèi)成兩個(gè)分支,其中一個(gè)分支大部分基因在幼蟲(chóng)期高表達(dá),CYP4H18,CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9J4,CYP9J3,CYP9J7,CYP9M1,CYP12F3和CYP12F4在整個(gè)幼蟲(chóng)和成蚊期均表達(dá)量較高,其中CYP4G16和CYP6Y2在中華按蚊所有發(fā)育階段均高表達(dá);另一個(gè)分支的基因在大多數(shù)供試樣本中表達(dá)量較低(圖1)。在幼蟲(chóng)、蛹和成蚊期,分別有40, 26和35個(gè)基因表達(dá)量較高,其中CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Z3,CYP6Y2,CYP6P4,CYP9J3和CYP9J4在整個(gè)幼蟲(chóng)期高表達(dá),CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y2,CYP49A1,CYP301A1,CYP303A1,CYP304B1和CYP325E1在蛹期表達(dá)量很高,CYP4G16,CYP4J5,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9M1,CYP9J3,CYP9J4,CYP12F1,CYP12F3和CYP12F4在成蚊期表達(dá)量很高。1-4齡幼蟲(chóng)中細(xì)胞色素P450家族基因的表達(dá)模式相似,雌蛹和雄蛹中細(xì)胞色素P450家族基因的表達(dá)模式相似,雌雄成蚊中細(xì)胞色素P450家族基因的表達(dá)模式相似(圖1),各發(fā)育階段之間細(xì)胞色素P450家族基因的表達(dá)模式是有差別的,可以看出細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段是具有特異性的。

圖1 中華按蚊細(xì)胞色素P450基因在實(shí)驗(yàn)室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)不同發(fā)育階段的表達(dá)譜

2.2 細(xì)胞色素P450家族基因在成蚊不同組織中的表達(dá)模式

結(jié)果表明,基因組織表達(dá)譜聚類(lèi)為兩個(gè)分支,其中一個(gè)分支25個(gè)基因表達(dá)水平較高,特別在表皮、脂肪體和精巢中表達(dá)較高(圖2),其中CYP4G16,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP9J3和CYP9J4在所有組織中均表達(dá)較高。另外一個(gè)分支基因表達(dá)量相對(duì)較低,其中CYP6M4在中腸和馬氏管中表達(dá)量最高,CYP6Z1在馬氏管和觸角中高表達(dá)。CYP6Z3,CYP6M3,CYP6Z1,CYP9K1,CYP9J6和CYP9J7均在馬氏管中高表達(dá);CYP4H24,CYP6AG1,CYP6AG2和CYP6Y2均在中腸中高表達(dá);CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6M4,CYP9J3,CYP9J4和CYP12F3在中腸和馬氏管中高表達(dá);CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y1和CYP6Y2在表皮、脂肪體以及精巢中高表達(dá);CYP6M2,CYP6P3V1,CYP6P3V2,CYP6P5,CYP9J5,CYP325F2,CYP325F3,CYP325G1,CYP325H1,CYP325J1和CYP325K1在觸角中表現(xiàn)出高表達(dá),而在其他組織中低表達(dá)。根據(jù)圖2顯示,細(xì)胞色素P450基因在表皮和脂肪體表達(dá)模式相似,其他組織之間表達(dá)模式有差別,表達(dá)模式具有組織特異性。

圖2 中華按蚊細(xì)胞色素P450基因在實(shí)驗(yàn)室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)成蚊不同組織中的表達(dá)譜

2.3 細(xì)胞色素P450家族基因在雌成蚊吸血后的表達(dá)模式

結(jié)果顯示,細(xì)胞色素P450基因表達(dá)譜聚類(lèi)為兩個(gè)分支,其中一個(gè)分支的基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時(shí)表達(dá)量較高,大多數(shù)基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時(shí)表達(dá)量與吸血前的對(duì)照近似,CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP9K1,CYP12F3和CYP304B1在中華按蚊吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時(shí)均高表達(dá);CYP304B1和CYP329A1在吸血后表達(dá)量與對(duì)照比有所提高。另一個(gè)分支的基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時(shí)表達(dá)量較低,CYP4C26在中華按蚊吸血后12和24 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照比有所提高,但在吸血后其他時(shí)點(diǎn)的表達(dá)量與對(duì)照比均較低(圖3);CYP6AH2和CYP9M2在吸血后6, 12, 24 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照比有所提高,CYP6S1在吸血后12, 24, 48 h時(shí)表達(dá)量較高;CYP307A1在吸血后6, 12 h時(shí)表達(dá)量較高,CYP6M2,CYP6P5,CYP306A1在吸血后48 h時(shí)表達(dá)量較高,整體來(lái)看,吸血前后不同時(shí)間的表達(dá)模式相似。

圖3 中華按蚊細(xì)胞色素P450基因在實(shí)驗(yàn)室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)吸血雌成蚊中的表達(dá)譜

3 討論

中華按蚊細(xì)胞色素P450家族基因的表達(dá)模式分析表明其具有發(fā)育階段特異性和組織特異性。先前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞色素P450基因在昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)具有特異性,這可能與不同基因行使的功能不同有關(guān)(Chungetal., 2009; Feyereisen, 2012)。中華按蚊CYP4G16,CYP6Y2,CYP301A1和CYP304B1在卵期表達(dá)量較高(圖1),表明這些基因可能在其胚胎發(fā)育過(guò)程中起作用。在幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)期,分別有40, 26和35個(gè)基因具有較高表達(dá)量。中華按蚊CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Z3,CYP6Y2,CYP6P4,CYP9J3和CYP9J4在整個(gè)幼蟲(chóng)期高表達(dá),這表明這些基因可能與中華按蚊的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera的CYP6B2在幼蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于在其他發(fā)育階段的(Ranasingheetal., 1997);小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的諸多細(xì)胞色素P450基因,如CYP340W1v2等在幼蟲(chóng)期的表達(dá)量較高(Yuetal., 2015)。幼蟲(chóng)期是主要的進(jìn)食時(shí)期,由于食源性有毒化合物可能會(huì)被吸收,因此幼蟲(chóng)中各種細(xì)胞色素P450基因的大量表達(dá)可能參與了對(duì)這些化學(xué)物質(zhì)的解毒(Yuetal., 2015)。中華按蚊CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y2,CYP49A1,CYP301A1,CYP303A1,CYP304B1和CYP325E1在蛹期表達(dá)量很高,表明這些細(xì)胞色素P450基因可能參與了復(fù)雜的羽化過(guò)程。有研究表明,小菜蛾的CYP338C1等在卵和蛹期的表達(dá)量顯著高于在其他發(fā)育階段的(Yuetal., 2015)。中華按蚊CYP4G16,CYP4J5,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9M1,CYP9J3,CYP9J4,CYP12F1,CYP12F3和CYP12F4在成蟲(chóng)期表達(dá)量很高,岡比亞按蚊A.gambiaeCYP6D1在成蟲(chóng)期的表達(dá)量也顯著高于其他發(fā)育階段的(Nikouetal., 2003);華山松大小蠹DendroctonusarmandiCYP4G56僅在成蟲(chóng)期高表達(dá),在其他發(fā)育階段表達(dá)量則很低(Daietal., 2014)。這些基因在不同發(fā)育階段表達(dá)情況不同,暗示這些細(xì)胞色素CYP450基因可能在發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用,特別是在特定的生命階段(Laoetal., 2015)。

中腸是抵御食物中存在的有毒異生物的第一道防線(xiàn)(Scott, 2008),因此在腸道中高度表達(dá)的細(xì)胞色素P450基因可能參與了毒素代謝。有研究表明,細(xì)胞色素P450基因經(jīng)常參與腸道對(duì)外源性物質(zhì)的反應(yīng)(Li SYetal., 2021; Li Xetal., 2021),它們的過(guò)量表達(dá)可以增強(qiáng)害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的解毒作用(Jingetal., 2020)。中華按蚊細(xì)胞色素P450家族基因在成蚊不同組織的表達(dá)譜分析顯示(圖2),CYP4H24,CYP6AG1,CYP6AG2和CYP6Y2均在中腸中高表達(dá)。除中腸外,細(xì)胞色素P450基因也在主要的排泄器官馬氏管中表達(dá)(Snyderetal., 1995; Chenetal., 2019)。本研究中,中華按蚊CYP6Z3,CYP6M3,CYP6Z1,CYP9K1,CYP9J6和CYP9J7均在馬氏管中表達(dá)量較高(圖2)。除了以上的細(xì)胞色素P450基因以外,中華按蚊CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6M4,CYP9J3,CYP9J4和CYP12F3在中腸和馬氏管中均高表達(dá)。昆蟲(chóng)的中腸是主要的消化道和最大的代謝組織,馬氏管是主要的排泄器官,它們都具有降解內(nèi)源和外源化合物的作用,可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化和殺蟲(chóng)劑的損傷(Hakimetal., 2010),表明中華按蚊的這些細(xì)胞色素P450基因在解毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。昆蟲(chóng)的唾液腺產(chǎn)生富含酶的液體,在消化過(guò)程中發(fā)揮作用(Cantón and Bonning, 2020)。本研究中,中華按蚊CYP6AH1,CYP6Y1,CYP9J4和CYP12F3在唾液腺中表達(dá)量較高。在長(zhǎng)紅錐蝽Rhodniusprolixus中,RproCYP4M1在唾液腺中高度表達(dá)(Paimetal., 2022);黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor中TmCYP345C4,TmCYP307A1,TmCYP4BN60和其他幾個(gè)基因在唾液腺中高度或特異性表達(dá)(Wangetal., 2022)。表明這些基因可能在消化和解毒方面發(fā)揮作用。由于細(xì)胞色素P450基因在生殖組織中的大量存在,它們被認(rèn)為與昆蟲(chóng)的繁殖有關(guān)(Wen and Scot, 2001)。在中華按蚊的卵巢中CYP9J3,CYP9J4和CYP307A1等表達(dá)量較高,精巢中CYP4G16,CYP6Y1和CYP6Y2等高表達(dá),暗示這些基因可能與其繁殖方面有關(guān)。

吸血后不同時(shí)期的表達(dá)譜顯示中華按蚊CYP304B1和CYP329A1在吸血后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量較吸血前增加(圖3),表明這些基因可能與血液的消化和吸收有關(guān)。CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP9K1,CYP12F3和CYP304B1在中華按蚊吸血后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高表達(dá),可能是因?yàn)檎x(chóng)取樣測(cè)序,不能清楚地了解到細(xì)胞色素P450基因在吸血后不同組織的具體表達(dá)情況。