復(fù)合發(fā)酵劑對發(fā)酵魚肉香腸品質(zhì)、風(fēng)味及其多肽抗氧化活性的影響

馮美琴，李天翊，孫 健,

（1.金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 南京 210038；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，肉品質(zhì)量控制與新資源創(chuàng)制全國重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京 210095）

魚肉因具有肉質(zhì)緊實鮮美、營養(yǎng)均衡、高蛋白低脂肪的特點(diǎn)而深受全世界消費(fèi)者的歡迎，魚肉蛋白消化率高的同時還具有特殊的保健功效，其中含有的?；撬釋θ梭w肝臟有解毒作用，還能調(diào)節(jié)人體的血壓[1]。但是，自溶酶和微生物活動會導(dǎo)致魚肉迅速變質(zhì)，一般在捕獲后有限時間內(nèi)作為新鮮食材在市場上售賣[2]，尤其是淡水魚類，腥味重、凝膠性能差和易腐敗變質(zhì)，與海水魚相比具有更低的加工利用比例和產(chǎn)品附加值，這制約了淡水魚的加工利用和增值轉(zhuǎn)化，是當(dāng)前迫切需要解決的問題[3-4]。

發(fā)酵香腸是一種經(jīng)過微生物發(fā)酵后具有獨(dú)特風(fēng)味的傳統(tǒng)肉類發(fā)酵制品，具有營養(yǎng)價值高、風(fēng)味獨(dú)特、貯存時間長的特點(diǎn)。然而傳統(tǒng)自然發(fā)酵生產(chǎn)周期長、成品質(zhì)量不穩(wěn)定、具有潛在的安全隱患[5]。人工接種的微生物發(fā)酵劑可用于引導(dǎo)發(fā)酵過程、抑制病原微生物的生長和潛在有害化合物（如生物胺）的合成[2]，確保最終產(chǎn)品的安全性。同時，微生物發(fā)酵劑也可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)，Hu Yingying等[6]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）顯著增加了低鹽干發(fā)酵香腸的剪切力，而彎曲乳桿菌能夠顯著增加低鹽干發(fā)酵香腸的亮度值，二者接種之后都能改善香腸的顏色、質(zhì)地、香氣風(fēng)味。乳桿菌、乳球菌、葡萄球菌等作為發(fā)酵香腸的主要微生物，能夠促進(jìn)香腸中碳水化合物、蛋白質(zhì)的分解和脂肪的分解氧化從而促進(jìn)發(fā)酵香腸風(fēng)味的形成[7-8]。王德寶等[9]研究發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵劑顯著增加了羊肉發(fā)酵香腸風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，賦予香腸獨(dú)特的香味。Wang Ji等[10]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌MSZ2促進(jìn)發(fā)酵肉制品中2-十一醛、E-2-辛烯醛、辛醛、E,E-2,4-癸二烯醛的生成。Gao Pei等[11]在發(fā)酵米糟草魚時發(fā)現(xiàn)，戊糖片球菌（Pediococcus pentasaceus）主要促進(jìn)游離氨基酸的生成，進(jìn)而促進(jìn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。近年來，從肉制品中獲得的抗氧化肽因其安全性高、易吸收、活性強(qiáng)引起研究者們的廣泛關(guān)注。課題組從中式傳統(tǒng)香腸中分離出植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans）NJ201，將這兩種菌作為功能性發(fā)酵劑接種于發(fā)酵香腸，可以顯著提高發(fā)酵香腸多肽的體外抗氧化能力，并且在體內(nèi)環(huán)境中能有效減少小鼠血清和肝臟的氧化損傷，具有良好的抗衰抗氧化作用[12]。

因此，將接種發(fā)酵香腸技術(shù)和魚肉加工結(jié)合以期延長魚肉產(chǎn)品的保質(zhì)期、改善風(fēng)味。而且胡永金[13]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌-15、干酪乳桿菌-1.001、木糖葡萄球菌-12及混合菌可以使鰱魚魚糜品質(zhì)得到很好的改善，這也為利用發(fā)酵劑解決淡水魚類加工難題提供可能。此外，相比于單一發(fā)酵劑，混合發(fā)酵劑更能有效抑制香腸在發(fā)酵成熟中過度氧化，甚至抑制酪胺的產(chǎn)生[9,14]。所以本實驗將植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201作為混合發(fā)酵劑接種到草魚魚糜制作而成的魚肉香腸中進(jìn)行發(fā)酵，以自然發(fā)酵作為對照，探究復(fù)合發(fā)酵劑對魚肉香腸pH值、顏色、質(zhì)地、風(fēng)味、多肽抗氧化性的影響。以期為魚肉香腸發(fā)酵提供一定的理論依據(jù)，也為淡水魚附加值的增加提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌CD101（NCBI編號MG798695）；模仿葡萄球菌NJ201（NCBI編號MG798688）。

1.1.2 原料與試劑

草魚魚糜、豬腸衣 江蘇省蘇食肉品有限公司南京分公司；鹽、蔗糖、姜粉、五香粉、白胡椒粉等 江蘇南京蘇果超市。

葡萄糖 甘汁園糖業(yè)；亞硝酸鈉 杭州龍山化工有限公司；異抗壞血酸鈉 鄭州拓洋實業(yè)有限公司；甲醇溶液（色譜級）安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆黄渌噭┚鶠榉治黾儭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

OptiMairTM垂直流超凈工作臺 新加坡藝思高科技有限公司；HVE-50自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；WH-2微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀廠有限公司；螺旋接種儀、自動影像分析菌落計數(shù)儀 法國Interscience公司；ICP260生化培養(yǎng)箱 德國Memmert公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；T25勻漿機(jī)德國IKA公司；TC 12E絞肉機(jī) 意大利Sirman公司；VF608灌腸機(jī) 德國Handtmann公司；KBF 720恒溫恒濕箱 德國Binder公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；ES2030冷凍干燥機(jī)、L-8900A氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；PTF-A300型萬分之一電子天平 美國HZ公司；SIM-F124制冰機(jī)日本三洋電子有限公司；CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minolta公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國Stab Micro System公司；TSQ9000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的活化

將植物乳桿菌CD101在MRS液體培養(yǎng)基上以恒溫37 ℃的條件培養(yǎng)20 h，模仿葡萄球菌NJ201在甘露醇鹽瓊脂液體培養(yǎng)基上以恒溫30 ℃的條件培養(yǎng)20 h；活化2 次，吸取所需體積的菌液12 000×g、4 ℃離心5 min，舍棄上清液，然后用無菌生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀數(shù)次，重懸備用。

1.3.2 香腸發(fā)酵

參考曹辰辰等[15]的方法并稍作修改。新鮮草魚魚糜稱質(zhì)量，其他成分以肉質(zhì)量為基礎(chǔ)添加：食鹽2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%。接菌組香腸的發(fā)酵劑菌量配比為植物乳桿菌CD101∶模仿葡萄球菌NJ201＝1∶1，接種量為2×107CFU/g。工藝流程：原料肉→漂洗→絞肉→攪拌與發(fā)酵劑混勻→灌腸→恒溫發(fā)酵→干燥成熟。以不添加任何發(fā)酵劑的自然發(fā)酵香腸為對照組，以接種發(fā)酵劑的香腸為接種組。在恒溫恒濕箱中，第1天以30 ℃、相對濕度80%的條件發(fā)酵，第2～4天以15 ℃、相對濕度75%的條件發(fā)酵3 d，最后第5～21天以12 ℃、相對濕度72%的條件成熟17 d得到發(fā)酵魚肉香腸樣品。

1.3.3 發(fā)酵過程pH值的測定

在發(fā)酵過程中，分別在第0、1、4、9、21天取樣，用手持pH計插入香腸內(nèi)部測定各發(fā)酵時間的香腸pH值，每根香腸重復(fù)測定3 次。使用前用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校正，記錄發(fā)酵過程中pH值的變化。

1.3.4 色差

在發(fā)酵過程中，分別在第0、1、4、9、21天取樣，使用便攜式色差儀測定發(fā)酵香腸的色度值，色差儀使用前用標(biāo)準(zhǔn)白板進(jìn)行校正。將發(fā)酵香腸切成1 cm厚的圓柱體，測試中選擇L*、a*和b*模式表示結(jié)果，記錄發(fā)酵過程中顏色值的變化。

1.3.5 質(zhì)構(gòu)特性測定

參考任國艷等[16]的方法并稍作改動。將香腸去掉腸衣之后切成若干個1.0 cm3的正方體，測定時將每個肉塊放在質(zhì)構(gòu)儀測試平臺中央，每組樣品均進(jìn)行8 次平行實驗。選用P/1000型探頭，測定參數(shù)：測定前探頭速率120 mm/min，測試速率60 mm/min，測定后探頭速率300 mm/min。2 次測定時間間隔2 s，測定應(yīng)變量為75%，起始力為1 N。測定硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性。

1.3.6 粗肽粉的提取

參考Xing Lujuan等[17]的方法，并略作修改。從發(fā)酵第21天的香腸中取樣進(jìn)行多肽提取。將對照組和接種組去掉腸衣后絞碎各稱取25 g提取多肽。樣品加入100 mL（pH 7.2）磷酸鹽緩沖溶液，冰浴勻漿3 次（18 000×g，10 s），4 ℃靜置2 h后12 000×g、4 ℃離心20 min。取上清液，經(jīng)紗布過濾后加入3 倍體積40%乙醇溶液，靜置過夜（12 h）。之后繼續(xù)12 000×g、4 ℃離心20 min，上清液經(jīng)抽濾后濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（50 ℃、50 r/min）濃縮去除乙醇，剩余肽液放入冷凍干燥機(jī)凍干60 h，得到粗肽粉，于-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定

參照Shimada等[18]的方法，并略作修改。用凍干的粗肽粉和超純水配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的肽液，并以谷胱甘肽（glutathione，GSH）為陽性對照組。0.5 mL肽液中加入0.5 mL以95%乙醇溶液溶解的0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，混勻，于室溫放置30 min后，測定混合物在517 nm波長處的吸光度，95%乙醇溶液替換DPPH自由基溶液為空白組，95%乙醇溶液替換肽液為對照組。肽液對DPPH自由基的清除能力計算如式（1）所示：

1.3.8 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力的測定

參考Zaky等[19]的方法并略作修改。等體積ABTS溶液和氧化劑配制ABTS陽離子自由基工作液，黑暗中反應(yīng)14 h。用磷酸緩沖溶液稀釋工作液25 倍后，取200 μL溶液與10 μL樣品混合，室溫反應(yīng)4 min，在734 nm波長處測定吸光度。以超純水代替肽液作為空白組，以GSH為陽性對照。肽液對ABTS陽離子自由基的清除能力計算如式（2）所示：

1.3.9 羥自由基清除能力的測定

參考馮美琴等[12]的方法。向0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液中加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L pH 7.4）混勻，加入0.6 mL 5.0 mg/mL肽液及0.6 mL乙二胺四乙酸（15 mmol/L），混勻后加入0.6 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），混勻后加入0.8 mL 0.1% H2O2溶液，渦旋混勻后于37 ℃靜置1 h，測定樣品在536 nm波長處的吸光度記為A樣品；超純水替換樣品測得的吸光度記為A損傷；超純水代替H2O2測得吸光度記為A未損傷。羥自由基清除能力計算如式（3）所示：

1.3.10 揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的測定

參考曹辰辰等[15]的方法并稍作修改。以C7～C30烷烴作為混標(biāo)，采用固相微萃取法進(jìn)行樣品處理。將發(fā)酵香腸去掉腸衣絞碎后取5 g置于20 mL頂空瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)2,4,6-三甲基吡啶溶液（30 μL用甲醇溶液定容至100 mL）壓蓋，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

色譜條件：使用TR-5 MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），以氦氣為載氣，流速1 mL/min。升溫程序：在40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的升溫速率升至90 ℃，不保持，再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，電離方式為電子電離，電子能量70 eV，發(fā)射電流120 μA，掃描質(zhì)量范圍m/z30～550。根據(jù)峰面積歸一法計算每種風(fēng)味化合物的相對含量。

1.3.11 游離氨基酸的測定

參考Qi Jun等[20]的方法并略作修改。去除腸衣后的香腸絞碎，稱取4 g加入20 mL 0.03 g/mL的磺基水楊酸溶液，10 000 r/min冰浴勻漿3 次，每次20 s。4 ℃、12 000×g離心15 min。取4 mL上清液加入2 mL正己烷靜置直到出現(xiàn)明顯分層，棄去上層取下層溶液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后用全自動氨基酸分析儀測定。

1.4 統(tǒng)計分析

本實驗每個指標(biāo)中每個處理組設(shè)置3 個重復(fù)，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)使用SAS V8軟件中的Duncan’s Multiple-Range Test和單因素方差分析，結(jié)果以表示，均用GraphPad Prism 9.0或Origin 2020作圖。以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值的變化

如圖1所示，對照組和接種組的pH值都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在發(fā)酵開始前，即第0天時，兩組pH值均在6.4～6.5之間，但因接種乳桿菌，接種組已經(jīng)顯著略低于對照組。發(fā)酵開始后的第1天，pH值都開始顯著下降（P＜0.05），對照組和接種組分別降低至5.02和4.89。發(fā)酵后的2～4 d，對照組pH值基本保持不變，略有上升，而接種組pH值繼續(xù)顯著降低到最低水平4.69。4 d之后，對照組和接種組pH值都開始出現(xiàn)顯著回升，直至21 d發(fā)酵成熟時分別達(dá)到6.47和5.72。

圖1 發(fā)酵魚肉香腸發(fā)酵期間pH值的變化Fig.1 Changes in pH of fermented fish sausages during fermentation

在整個發(fā)酵成熟過程中，接種組pH值始終顯著低于對照組，這與課題組之前[21-22]的研究結(jié)果一致。香腸在發(fā)酵初期的pH值顯著下降，主要是因為乳酸菌通過分解糖類進(jìn)行代謝產(chǎn)生大量的乳酸及其他有機(jī)酸[23]。而接種組具有明顯更低的pH值，是因為接種的植物乳桿菌CD101在發(fā)酵階段適宜溫濕度下具有快速產(chǎn)酸的能力[24]。研究表明，發(fā)酵初期迅速下降的pH值有利于抑制其他有害微生物的生長，降低蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力，加快干燥進(jìn)程[25-26]。較低的pH值也能讓香腸具有獨(dú)特風(fēng)味，促使蛋白質(zhì)凝固，提高香腸的穩(wěn)定性和安全性[27-28]。所以乳酸菌數(shù)量較多、產(chǎn)酸能力更強(qiáng)的接種組或許具有更好的品質(zhì)。發(fā)酵后期的pH值回升可能是因為微生物產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白質(zhì)生成肽、胺等堿性物質(zhì)[29]。

2.2 發(fā)酵過程中色差測定結(jié)果

對照組和接種組在發(fā)酵成熟過程中顏色的變化主要由L*、a*、b*三個指標(biāo)表示。L*值為亮度值，代表肉色的明暗度，與含水量有關(guān)；a*值為紅度值，能夠表現(xiàn)香腸的偏紅程度和肌紅蛋白的變化；b*為黃度值，反映香腸的偏黃程度，與脂肪氧化和蛋白變性有關(guān)[30]。由表1可以看出，L*值受發(fā)酵時間和不同處理作用影響顯著（P＜0.05），兩組均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因為發(fā)酵后水分流失而平均散布在肉品表面上[13]，使得在發(fā)酵初期L*值迅速上升。之后隨著干燥進(jìn)程的推進(jìn)，香腸中的水分逐漸減少導(dǎo)致亮度值又顯著下降，最終成品接種組肉色顯著亮于對照組肉色。

表1 發(fā)酵魚肉香腸發(fā)酵期間色差變化情況Table 1 Changes in color difference of fermented fish sausages during fermentation

接種組的a*值和b*值都未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），a*值和b*值都隨著發(fā)酵時間的延長而顯著上升，而且在21 d，接種組的a*/b*值顯著大于對照組，說明肉色更紅更鮮艷，這可能是因為添加的模仿葡萄球菌NJ201促進(jìn)亞硝酸鹽分解，有助于亞硝基肌紅蛋白生成，從而有利于香腸具有更好的色澤[31-32]。所以，復(fù)合發(fā)酵劑能夠顯著提升發(fā)酵魚肉香腸的亮度，并對色澤產(chǎn)生有利影響。

2.3 發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

從表2可以看出，復(fù)配發(fā)酵劑的接種對魚肉香腸的質(zhì)構(gòu)特性有顯著影響，尤其是在硬度和咀嚼性方面，都顯著高于對照組，這與慕婷婷等[33]的研究結(jié)果相同，這可能是因為復(fù)合發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中水解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，使香腸的蛋白質(zhì)變性，在魚肉內(nèi)部形成緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[34]。而在彈性方面，接種組顯著低于對照組，這與王帆[4]和王秀麗[22]等的結(jié)果相反。兩組內(nèi)聚性并無顯著差異，這與曹辰辰[35]的發(fā)現(xiàn)一致。質(zhì)構(gòu)的結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵劑能夠顯著提升魚肉香腸的硬度和咀嚼性，使其更加干燥，有利于穩(wěn)定性和安全性的提升。

表2 不同處理對發(fā)酵魚肉香腸質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Textural characteristics of fermented fish sausages produced by inoculated and natural fermentation

2.4 發(fā)酵魚肉香腸多肽的抗氧化能力

本實驗以DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和羥自由基清除率表征發(fā)酵魚肉香腸中提取粗肽的抗氧化能力。由圖2可以看出，陽性對照GSH的DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率分別為94.33%和93.06%，均達(dá)到90%以上的較高水平，羥自由基清除率也達(dá)到39.03%，三者均顯著高于對照組和接種組。而粗肽液的質(zhì)量濃度在5 mg/mL時，復(fù)合發(fā)酵劑的接種顯著提升多肽的抗氧化能力（P＜0.05）。在DPPH自由基清除率方面，接種組的50.7%顯著高于對照組的27.6%，達(dá)到GSH的一半以上。在ABTS陽離子自由基清除率方面，接種組的35.59%也顯著高于對照組的26.97%，達(dá)到GSH的1/3以上水平。在羥自由基清除率方面，接種組的15.6%同樣顯著高于對照組的4.25%，達(dá)到GSH的1/3以上水平并且是對照組的3 倍以上。這說明復(fù)合發(fā)酵劑能夠顯著增強(qiáng)魚肉香腸多肽的抗氧化能力，提高清除自由基的能力，這與Yu Di等[36]的研究結(jié)果類似。Luan Xiaoxu等[37]發(fā)現(xiàn)接種植物乳桿菌CD101的發(fā)酵香腸DPPH自由基清除率顯著高于未接種組。Geeta等[38]也發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵劑有效提高雞肉香腸的DPPH自由基清除能力。Karwowska等[39]發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌的羊肉會產(chǎn)生更強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除活性。一些研究發(fā)現(xiàn)[40-41]，多肽的抗氧化能力與多肽的氨基酸組成和氨基酸序列的疏水性有關(guān)，接種組香腸多肽更強(qiáng)的抗氧化能力可能與其具有更多的疏水性氨基酸有關(guān)，這在游離氨基酸的測定結(jié)果中也得到印證。Yu Di等[36]的研究結(jié)果也顯示香腸多肽含有更高比例的疏水性氨基酸或許有更高的抗氧化活性。Liu Dongmei等[42]也發(fā)現(xiàn)多肽序列N端的疏水性氨基酸有利于其抗氧化活性。

圖2 不同處理對發(fā)酵魚肉香腸多肽抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of inoculated and natural fermentation on the antioxidant capacity of polypeptides from fermented fish sausages

2.5 發(fā)酵魚肉香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果

本實驗篩選了與Meanlib、NISTDemo和Wiley Library定性匹配度大于700的數(shù)據(jù)。從表3可以看出，對照組和接種組的發(fā)酵魚肉香腸共檢測出55 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酮類物質(zhì)2 種、醇類物質(zhì)3 種、酸類物質(zhì)6 種、酯類物質(zhì)12 種、碳?xì)浠衔?3 種和其他類物質(zhì)9 種。發(fā)酵魚肉香腸中主要的風(fēng)味物質(zhì)是酯類物質(zhì)和碳?xì)浠衔?。其中，對照組檢測出32 種風(fēng)味物質(zhì)，碳?xì)浠衔锖枯^多。接種組檢測出48 種風(fēng)味物質(zhì)，酮類、酸類和酯類含量較多。

表3 不同處理對發(fā)酵魚肉香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的影響Table 3 Effect of inoculated and natural fermentation on the content of volatile flavor substances in fermented fish sausages μg/kg

2 種酮類物質(zhì)都只在接種組中檢測到，2-丁酮具有一定的甜味氣息，而3-羥基丁酮有黃油味，2 種物質(zhì)的相對含量都較高，對香腸的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[43]。香腸產(chǎn)生的大部分醇類物質(zhì)來源于微生物對碳水化合物或脂肪的代謝，接種組更多的醇類物質(zhì)含量也說明復(fù)合發(fā)酵劑具有一定的脂肪分解活性[44]。酸類物質(zhì)在發(fā)酵香腸中屬于比較重要的風(fēng)味物質(zhì)，能與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成[45]。接種組產(chǎn)生更多的酸類物質(zhì)，而且多為長鏈脂肪酸，這可能與接種的植物乳桿菌有關(guān)，柴秋兒等[46]的研究結(jié)果表明植物乳桿菌能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化為共軛亞油酸。

酯類物質(zhì)是構(gòu)成發(fā)酵香腸風(fēng)味的重要物質(zhì)，例如乙酯類可以為香腸提供果香味和奶油香味[45]。在酯類物質(zhì)含量上，接種組具有絕對優(yōu)勢，其中具有甜的水果和蜂蜜似花香香氣的苯丙酸乙酯含量顯著高于對照組。4-甲基戊酸乙酯能為接種組香腸提供類似蘋果的果香。甲酯物質(zhì)能夠提供芳香氣味，內(nèi)酯類化合物能夠賦予產(chǎn)品各種果香氣息[45]。碳?xì)浠衔锏拈撝递^高，對香腸氣味的貢獻(xiàn)度較低。另外，醛、酮類物質(zhì)是脂肪氧化的結(jié)果，可能是因為魚肉脂肪含量過低的緣故，這兩類物質(zhì)檢出極少。

總體來看，復(fù)合發(fā)酵劑促進(jìn)了閾值較低、對香腸風(fēng)味貢獻(xiàn)度較高的酮類、酸類和酯類的生成，為魚肉香腸提供一定的甜味和果香，使香腸風(fēng)味更加豐富。

2.6 發(fā)酵魚肉香腸游離氨基酸種類及含量測定結(jié)果

從表4可以看出，在檢測到的13 種游離氨基酸中，除Glu、Cys、Lys以外，接種組的氨基酸含量都顯著高于對照組（P＜0.05），接種組的游離氨基酸總體含量也有顯著優(yōu)勢，是對照組的1.81 倍，表明復(fù)合發(fā)酵劑具有良好的氨肽酶活性。Ala、Tyr、Arg可能是因為在對照組中含量太少而未能被檢出。接種組含有333.2 mg/100 g的必需氨基酸，顯著高于對照組的225.17 mg/100 g，這說明接種組可能具有更好的營養(yǎng)價值。

表4 不同處理對發(fā)酵魚肉香腸游離氨基酸種類及含量的影響Table 4 Effect of inoculated and natural fermentation on the types and contents of free amino acids in fermented fish sausages

Val、Leu等游離氨基酸是一些風(fēng)味化合物重要前體，乳酸菌通過轉(zhuǎn)氨酶可將它們轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α-酮酸。這些酸經(jīng)過一系列代謝反應(yīng)最終成為對發(fā)酵香腸典型風(fēng)味有貢獻(xiàn)度的香氣化合物[47]。Phe和Ile可以通過Strecker降解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為香腸中重要的風(fēng)味物質(zhì)[48]。Ala、Thr也會對香腸的甜味有所貢獻(xiàn)。這些氨基酸在接種組中的含量都顯著高于對照組，可能使得接種組具有更豐富的風(fēng)味，這與揮發(fā)性風(fēng)味結(jié)果相呼應(yīng)。此外，接種組中Met、Tyr、His、Lys、Cys等具有抗氧化活性的氨基酸含量大多顯著高于對照組，這有利于增強(qiáng)接種組香腸肽段的抗氧化能力[49]，此結(jié)果也與接種組多肽抗氧化能力顯著高于對照組的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本實驗接種植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201組成的混合菌種發(fā)酵劑制作發(fā)酵魚肉香腸，將自然發(fā)酵香腸作為對照，通過測定pH值、質(zhì)構(gòu)、色差、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、抗氧化能力等指標(biāo)，探究功能性發(fā)酵劑對發(fā)酵魚肉香腸品質(zhì)、風(fēng)味及多肽抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：接種功能性發(fā)酵劑能夠使香腸在發(fā)酵期間具有更低的pH值，提高香腸的穩(wěn)定性和安全性，同時能提高香腸產(chǎn)品的硬度和咀嚼性、提升亮度和色澤，使之擁有更好的品質(zhì)。功能性發(fā)酵劑還可以顯著提升香腸多肽的抗氧化能力，接種后香腸多肽的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除率分別提升了23.1%、8.62%、11.35%。功能性發(fā)酵劑通過促進(jìn)更多風(fēng)味物質(zhì)的生成，改善和豐富香腸的風(fēng)味，賦予更強(qiáng)烈的甜味和果香。同時接種發(fā)酵劑促進(jìn)發(fā)酵魚肉香腸游離氨基酸的釋放，這些氨基酸有利于增強(qiáng)香腸的抗氧化能力、營養(yǎng)性和改善風(fēng)味。