鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌多樣性分析

王曉春 高婷

(寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750000)

紫花苜蓿(Medicago sativaL)屬多年生豆科牧草，因其優(yōu)良的飼用價值和較高的產(chǎn)草量，素有“牧草之王”的美譽。同時因其較強的耐鹽堿和固氮能力[1，2]，也是鹽堿地改良和修復常選擇的草種。根際土壤是植物根系與微生物相互作用的媒介，在根系分泌物與微生物的共同作用下形成的特有的微生物群落結構[3]。真菌是微生物區(qū)系的主要成員，參與土壤有機質的轉化、養(yǎng)分循環(huán)和能量轉移，對調(diào)節(jié)土壤可持續(xù)生產(chǎn)力具有重要作用[4]。研究顯示，種植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生長和繁殖，從而提高真菌豐富度和多樣性[5]。張雪等[6]認為，pH與真菌多樣性呈顯著負相關，pH、電導率和有機質對鹽堿地真菌的優(yōu)勢菌屬的影響顯著。本研究采集寧夏銀北種植多年的紫花苜蓿根際土壤，開展ITS真菌高通量測序，分析鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落的多樣性，為探索土壤可持續(xù)利用及鹽堿地改良土壤提高理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣地概況與樣品采集

試驗采樣地位于寧夏銀川市西夏區(qū)園林場多年生苜蓿種植田，多年多點春季測量pH為8.60，全鹽含量為0.56%。于2022年4月10日采土樣，選擇鹽斑顏色最重的苜蓿根際(處理組，LS)及附近裸地(對照組，LCK)采樣。每處理3個重復，每個重復采集5株苜蓿根際及對應的非根際土壤。挖取苜蓿主根0～20cm根際土壤，混勻并裝入無菌樣品采集袋，立即低溫條件下帶回實驗室存入-80℃冰箱保存，用于土壤微生物總DNA提取。

1.2 土壤總DNA提取及ITS基因擴增測序

樣品干冰寄送武漢邁維代謝進行土壤樣品DNA提取及上機測序。采用Qiagen公司生產(chǎn)的土壤DNA提取試劑盒(天根磁珠法)進行樣本DNA抽提。待文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。真菌ITS測序區(qū)域為ITS1-5F；引物為ITS5-1737F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS2-2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。

1.3 生物信息學分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)進行拼接、質控、過濾后得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。以97%的一致性對有效數(shù)據(jù)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并采用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast(http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)[7]與Unit(v8.2)數(shù)據(jù)庫(https：//unite.ut.ee/)[8]進行物種注釋。分別在各個分類水平——kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；使用R軟件(Version 2.15.3)繪制熱圖、群落相對豐度柱狀圖等。

2 結果與分析

2.1 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌OTUs分析

對鹽堿地苜蓿非根際與根際土壤真菌ITS區(qū)進行測序，得到原始讀數(shù)(Raw PE)分別為90231、83039，經(jīng)拼接、過濾后，最終用于后續(xù)分析的高質量序列比例分別為88.77%與91.77%，表明測序質量很好，見表1。在相似度大于97%分類水平下將其聚類為用于物種分類的OTUs。由表1可知，對照組與處理組的OTUs數(shù)目接近，分別為642、638，且差異不顯著(P>0.05)。

表1 鹽堿地苜蓿根際與非根際土壤真菌讀數(shù)及OTUs數(shù)

2.2 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落Alpha多樣性

由表2可知，處理組的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)相較于對照組分別提高了15.80%、8.33%。但Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)在處理組中低于對照組，但Alpha多樣性指數(shù)在二者間都差異不顯著(P>0.05)。

表2 鹽堿地苜蓿根際與非根際土壤真菌Alpha多樣性比較

2.3 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落Beta多樣性

對鹽堿地苜蓿根際與非根際土壤真菌Beta多樣性群落構成進行比較，利用Unifrac距離衡量2個樣本間的相異系數(shù)，其值越小，表示這2個樣本在物種構成多樣性方面的差異越小。由圖1可知，對照組與處理組的距離均大于1.472(Weighted Unifrac距離)、0.543(Unweighted Unifrac距離)，可見對照組與處理組土壤真菌群落構成差異明顯。

注：上下2個值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離。圖1 鹽堿地苜蓿根際與非根際土壤真菌Beta多樣性指數(shù)熱圖

圖2 門分類水平上的真菌群落組成

2.4 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落組成

OTUs的分類結果表明，處理組與對照組土壤真菌群落隸屬于13門50綱120目246科462屬。在門水平土壤真菌相對豐度>1%的有子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)，其中子囊菌門在處理組的相對豐度高于對照組，相對豐度提高了60.44%(P<0.05)。壺菌門在處理組的相對豐度為16.49%，在對照組中僅為0.49%，差異極顯著(P<0.01)。擔子菌門的相對豐度在處理組(4.52%)中遠低于對照組(18.91%)，且差異極顯著(P<0.01)。

在屬水平下，處理組與對照組的Others相對豐度分別為33.41%、54.97%。除了Others外相對豐度前10的物種群落結構，結果見圖3。優(yōu)勢屬均為unidentified、根囊壺菌屬(Rhizophlyctis)、木霉菌屬(Trichoderma)、瓶毛殼屬(Lophotrichus)、赤霉菌屬(Gibberella)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、unidentified_Ascomycota_sp、鏈格孢屬(Alternaria)、癬囊腔菌屬(Plectosphaerella)，其中，unidentified在處理組與對照組的相對豐度分別為3.72%、17.92%，差異極顯著(P<0.01)。根囊壺菌屬、木霉菌屬、瓶毛殼屬、鐮孢屬、unidentified_Ascomycota_sp在處理組的相對豐度分別為14.20%、13.41%、10.36%、10.89%、2.75%，都顯著或極顯著高于對照組的0.07%、0.48%、4.85%、4.13%、0.04%。而赤霉菌屬、腐質霉屬、鏈格孢屬、癬囊腔菌屬在對照組的相對豐度為9.03%、3.78%、2.67%、2.06%，高于處理組的7.46%、0.86%、2.10%、0.83%，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 屬分類水平上的真菌群落組成

2.5 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌LDA差異分析

采用為LEfSe對處理組與對照組真菌進行差異統(tǒng)計分析，找到組間具有統(tǒng)計學差異的生物標記物(Biomarker)。由圖4可知，在根際土壤中有9個生物標志物，其中假絲酵母科(Hypocreaceae)、木霉屬(g_Trichoderma)、壺菌門(p_Chytridiomycota)、綠木霉(s_Trichoderma_virens)以及4種未命名的子囊菌門下的菌種(f_unidentified_Ascomycota_sp等)和1種子囊菌(s_Ascomycota_sp)是處理組中影響較大的生物標志物。

圖4 LDA值分布柱狀圖

2.6 功能預測

通過FUNGuild功能預測，見圖5，腐生營養(yǎng)型(Undefined_Saprotroph)及病理-土壤腐生營養(yǎng)-木質腐生真菌型(Plant_Pathogen-Soil_Saprotroph-Wood_Saprotroph)在處理組的相對豐度分別為42.36%、10.89%，極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)高于對照組的9.34%、4.14%。未歸類真菌(Unassigned)與病理營養(yǎng)型真菌(Plant_Pathotroph)在對照組相對豐度分別為24.79%、10.69%，低于處理組的61.44%、13.93%，其中未歸類真菌在處理組與對照組間差異極顯著(P<0.01)。

圖5 FunGuild功能注釋相對豐度柱形圖

3 討論

3.1 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落多樣性分析

土壤微生物群落多樣性通常用多樣性指數(shù)的大小來分析，多樣性指數(shù)越高則微生物群落多樣性越高[9]。本研究顯示，鹽堿地紫花苜蓿根際與非根際土壤真菌群落Alpha多樣性差異不顯著，即豐富度和多樣性差別不大。但錢雅麗等[5]研究得出，種植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生長和繁殖，提高了土壤真菌豐富度。這可能是因為本研究中取樣地為多年生紫花苜蓿種植地，苜蓿凋落物等對根際與非根際(附近裸地)的影響較小，從而在豐富度與多樣性上差異不顯著。

3.2 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落組成分析

本研究中鹽堿地苜蓿根際土壤優(yōu)勢菌門為子囊菌門、擔子菌門等，這與昆侖山沙區(qū)紫花苜蓿根際土壤真菌的優(yōu)勢菌相同[10]。其中根際土壤中的優(yōu)勢菌門子囊菌門、壺菌門相對豐度高于非根際土壤，而擔子菌門相對豐度低于非根際土壤。譚海霞等[11]研究表明，施用土壤修復菌劑顯著提高了子囊菌門，降低了擔子菌門的豐度?？梢姡N植紫花苜蓿具有與施用修復菌劑相同的作用。這可能是因為子囊菌門能夠降解木質素、纖維素等難分解物質，對植物殘渣敏感[12]，而苜蓿根際土壤因根系分泌物和殘根等，利于子囊菌門在根際土壤的富集。劉震等[13]研究也顯示，鹽堿地區(qū)種植苜?？梢蕴岣咦幽揖T真菌群落相對豐度，降低擔子菌門等致病菌的相對豐度，改善土壤養(yǎng)分環(huán)境。本研究中壺菌門在根際土壤中的相對豐度約為非根際土壤中的4倍，由此可見，種植苜蓿利于壺菌門真菌富集。本研究中根際土壤中優(yōu)勢菌屬根囊壺菌屬、木霉菌屬、瓶毛殼屬等相對豐度顯著高于非根際。研究表明，囊根壺菌屬真菌多數(shù)能分解纖維素和幾丁質[14]，是一種在有機質豐富的土壤中生長的腐生菌[15]。可見此類菌在鹽堿地苜蓿根際易于生長，這可能得益于根系營養(yǎng)環(huán)境優(yōu)于非根際，也有可能是植物根際病原復雜造成。

3.3 鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌特異菌及生物功能預測

真菌數(shù)量雖然在土壤中占比小，但其對于有機質分解和能量循環(huán)有著重要的作用，影響著土壤環(huán)境質量和植物的生長發(fā)育[16]。本研究中，鹽堿地紫花苜蓿根際土壤有9個生物標志物，是根際特有的微生物(相較于非根際土壤)，其中有2種屬于木霉素。木霉屬真菌是一類具有生物防控功能的真菌，可誘導植物提升其對微生物病害的抵御能力，可促進植物生長[17]。廣泛用于抑制植物的土傳病害。還有5種子囊菌種，屬子囊菌門。子囊菌門大多為腐生菌，具有促進土壤養(yǎng)分循環(huán)，提高土壤質量的作用[18]。同時FUNGuild真菌功能預測也表明，鹽堿地紫花苜蓿根際土壤腐生營養(yǎng)型真菌遠高于非根際土壤，而非根際土壤中未歸類真菌和病理型真菌高于根際土壤。由此可見，種植紫花苜蓿增加了腐生營養(yǎng)型真菌豐度，增加了鹽堿地土壤的有機質，抑制了土傳病。

4 結論

本研究采用高通量測序技術研究了寧夏鹽堿地紫花苜蓿根際土壤真菌群落特征，結果顯示，苜蓿根際土壤真菌優(yōu)勢菌為子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、根囊壺菌屬、木霉菌屬、瓶毛殼屬。根際土壤中有絲酵母科、木霉屬、壺菌門等9個真菌特異菌。FUNGuild真菌功能預測鹽堿地苜蓿根際土壤腐生營養(yǎng)型真菌相對豐度高于非根際?？梢?，種植紫花苜蓿增加了鹽堿地土壤的有機質，有抑制了土傳病的效果。