大腸埃希菌對(duì)細(xì)粒棘球蚴活性影響的體外研究

苗章　程蕭　滿(mǎn)洋　林芷伊　吳向未　伍希雅　蔡克豐　崔杰　張宏偉

摘要：目的 研究細(xì)粒棘球蚴與大腸埃希菌體外共培養(yǎng)的條件下活性、形態(tài)的變化，以及部分參與通路。研究細(xì)粒棘球蚴與特定濃度大腸埃希菌體外共培養(yǎng)的條件下活性、形態(tài)隨時(shí)間的變化，以及部分參與通路。方法 將羊源性原頭蚴重懸計(jì)數(shù)，分為空白組、0.5麥?zhǔn)蠞舛却竽c埃希菌組（實(shí)驗(yàn)組），并以12、24、48、72、96 h為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使用0.1％伊紅染液按照體積1∶1的比例染色2 min后顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)算兩組原頭蚴的存活率；使用活性氧試劑盒在上述時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)兩組原頭蚴體內(nèi)ROS水平；在12、48、96 h分別檢測(cè)Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組原頭蚴存活率隨時(shí)間延長(zhǎng)降低，在96 h降至為0%；兩組原頭蚴體內(nèi)活性氧檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組ROS水平明顯提高，12 h最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=11.638， P<0.05），在72 h ROS水平與空白組相近；Western blot實(shí)驗(yàn)表明，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3蛋白（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9蛋白（T=3.435，P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組的蛋白水平大于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？沟蛲龅鞍譈cl-2，實(shí)驗(yàn)組的蛋白水平小于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=9.184，P＜0.05），兩組Nrf2蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=0.902，P=0.418）。結(jié)論 大腸埃希菌在體外可以快速致細(xì)粒棘球蚴死亡。0.5 mol·L-1大腸埃希菌在體外可以快速致細(xì)粒棘球蚴死亡，氧化應(yīng)激通路可能參與了此過(guò)程。

關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球蚴；大腸埃希菌；活性氧（ROS）；Bcl-2蛋白；Nrf2蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：中圖分類(lèi)號(hào)R532.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

In vitro study of the pathway associated with the death of Echinococcus granulosus by Escherichia coli

MIAO Zhang1，CHENG Xiao1，MAN Yang1，LIN? Zhiyi2，WU? Xiangwei2，WU? Xiya1，CAI? Kefeng1，CUI? Jie1，ZHANG? Hongwei2，3*

（1 School of Medicine， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008， China; 2 First Affiliated Hospital， School of

Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832008， China; 3 NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment

of Central Asia High Incidence Disease，Shihezi，Xinjiang 832008， China）

Abstract： ?Objective To study the changes in activity and morphology of Echinococcus granulosus under the conditions of co-culture with Escherichia coli in vitro， and some of the involved pathways.To study the changes in activity and morphology over time of Echinococcus granulosus co-cultured with specific concentrations of Escherichia coli in vitro， and some of the pathways involved. Methods The sheep-derived protozoa were resuspended and counted， divided into blank group and 0.5 maixa concentration Escherichia coli group （experimental group）， and stained with 0.1% eosin staining solution at a ratio of 1∶1 by volume for 2 min at 12， 24， 48， 72， 96 h as time points and then observed under microscope and calculated the survival rate of protozoa in both groups; the reactive oxygen species kit was used to detect the protozoa in both groups at the above time points The expression levels of Caspase-3 and 9， Bax， Bcl-2 and Nrf2 were measured at 12， 48， 96 h.Results The survival rate of protozoa in the experimental group decreased with time， and decreased to 0% at 96 h. The detection of reactive oxygen species in the two groups showed that the level of ROS in the experimental group increased significantly， with the highest level at 12 h. The difference was statistically significant （T=11.638， P<0.05）， and the level of ROS at 72 h was similar to that of the blank group. Western blot experiment showed that the protein levels of apoptotic protein Bax（T=4.997， P<0.05）， Caspase-3 protein （T=6.118， P<0.05）， Caspase-9 protein （T=3.435， P<0.05）， the protein levels in the experimental group were greater than those in the blank group， which was statistically significant. For anti-apoptotic protein Bcl-2， the protein level of the experimental group was smaller than that of the blank group， which was statistically significant （T=9.184， P<0.05）， and the difference in Nrf2 protein level between the two groups was not statistically significant （T=0.902， P=0.418）; Conclusion Escherichia coli can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro. Escherichia coli（0.5 mol·L-1） can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro， The oxidative stress pathway may be involved in this process.

Key words： Echinococcus granulosus; escherichia coli; ROS; Bcl-2 protein;? Nrf2 protein

細(xì)粒棘球蚴（CE）所致的囊性肝包蟲(chóng)病是一種世界范圍內(nèi)流行的人畜共患?。?-2］，通過(guò)大量的臨床觀(guān)察以及包蟲(chóng)影像學(xué)分型［3］依據(jù)肝兩型包蟲(chóng)病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)（2019版）［3］并通過(guò)大量的臨床觀(guān)察，我們認(rèn)為，包蟲(chóng)可以走向自然死亡，膽瘺和感染是兩大重要因素，很多合并細(xì)菌感染的包蟲(chóng)囊腫會(huì)發(fā)生膿腫樣改變，可發(fā)生快速死亡，引起肝包蟲(chóng)囊內(nèi)細(xì)菌感染的主要病原菌是大腸埃希菌［4］。本課題組實(shí)驗(yàn)證明大腸埃希菌在體外可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路導(dǎo)致原頭蚴死亡，那么此過(guò)程是否有氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體等死亡通路的參與，目前尚無(wú)確切證據(jù)，本研究延續(xù)前期實(shí)驗(yàn)［5］，使用最佳0.5麥?zhǔn)蠞舛却竽c埃希菌與細(xì)粒棘球蚴原頭蚴體外共培養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察原頭蚴形態(tài)學(xué)及活性的變化，并探討氧化應(yīng)激通路是否參與其中，以期為進(jìn)一步研究肝包蟲(chóng)的自然病程提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)粒棘球蚴含細(xì)粒棘球蚴囊泡的羊肝購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉屠宰場(chǎng)；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25922）來(lái)源于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院微生物室。

1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、1640培養(yǎng)基、胎牛血清，伊紅染液等購(gòu)于美國(guó)Life Gibco公司；Caspase-3、Caspase-9、Bax、bcl-2、Nrf2蛋白抗體購(gòu)于Boster公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的收集培養(yǎng)

將新鮮包蟲(chóng)羊肝放于提前滅菌后的自來(lái)水中沖洗3遍，去除羊肝表面殘留血漬及雜質(zhì)，使用75%的酒精擦洗羊肝表面3次后抽取養(yǎng)肝囊泡內(nèi)的囊液，并將囊液注入高壓滅菌的玻璃試劑瓶中，將囊液移入超凈操作臺(tái)中，沉淀靜置3 min后，去除上層囊液，再次加入PBS溶液后靜置2 min，使用注射器去除上層液體，重復(fù)10次。將收集到的細(xì)粒棘球蚴移入15mL離心管中，加入PBS溶液的將總體積定容至10mL，混勻后抽取20μL加入同體積0.1%伊紅染液，3 min后在顯微鏡下觀(guān)察計(jì)算染色率。當(dāng)染色率≤2%時(shí)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，如染色率大于2%，繼續(xù)重懸、靜置步驟。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48h更換一次培養(yǎng)基并使用無(wú)菌PBS溶液清洗原頭蚴，如培養(yǎng)基顏色變黃則根據(jù)實(shí)際情況更換培養(yǎng)基。原頭蚴存活率（%）=（未染色原頭蚴個(gè)數(shù)／原頭蚴總和）×100%。

1.3.2 觀(guān)察大腸埃希菌對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭蚴活性的影響

在12、24、48、72、96h觀(guān)察兩組原頭蚴形態(tài)及存活情況，具體如下：使用移液槍將兩組觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)細(xì)粒棘球蚴移至15mL離心管，吹打混勻培養(yǎng)基，抽取100μL（約100個(gè)原頭蚴）含原頭蚴的培養(yǎng)液懸液至載玻片上，同體積伊紅染液染色3 min，使用顯微鏡觀(guān)察兩組原頭蚴活力變化、形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。原頭蚴在活力較好的時(shí)候，不會(huì)被伊紅染液染色，當(dāng)期活力差或已發(fā)生死亡的時(shí)候會(huì)被染成紅色。在倒置顯微鏡下計(jì)算原頭蚴染色個(gè)數(shù)和總個(gè)數(shù)。

1.3.3 活性氧測(cè)定

分別按照觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)從兩組六孔板中移取適量原頭蚴，放入離心管中使用PBS清洗重懸3次；將DCFH-DA與1640培養(yǎng)基按1∶1 000比例稀釋?zhuān)瑑山M原頭蚴分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照管和DCFH-DA管，DCFH-DA管內(nèi)加入稀釋后的DCFH-DA；陽(yáng)性空白組內(nèi)加入Rosup；分別將兩組的陽(yáng)性對(duì)照管、DCFH-DA管孵育30 min；調(diào)整離心機(jī)轉(zhuǎn)速到1 000g，離心時(shí)間10 min，去除上層液體，使用PBS清洗重懸原頭蚴3次；避光環(huán)境下使用熒光顯微鏡觀(guān)察原頭蚴ROS水平，拍攝熒光圖片。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)Caspase-3、9、Bcl-2、Bax、Nrf2蛋白的表達(dá)水平

將兩組六孔板中的原頭蚴放入離心管，洗滌離心后加入蛋白裂解液RIPA∶PMSF=100∶1，冰上裂解20 min后使用超聲粉碎儀提取蛋白；用金屬浴將加入loading buffer的蛋白變性。按WB實(shí)驗(yàn)法依次完成電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±S）表示；兩組之間比較時(shí)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 23.0軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，ROS熒光圖片、WB條帶灰度采用Image J進(jìn)行量化分析，Graphpad Prism 5作圖。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭蚴形態(tài)的影響

不同時(shí)間點(diǎn)下，空白組原頭蚴變化不明顯，形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組原頭蚴呈外翻型，表面相對(duì)粗糙、皺縮、變形，邊界不清晰，隨時(shí)間延長(zhǎng)被伊紅染色的原頭蚴個(gè)體數(shù)量逐漸增多，在96 h鏡下原頭蚴被全部染色（圖1）。

2.2 大腸埃希菌對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭蚴活力的影響

在大腸埃希菌作用12、24、48、72、96h，分別用0.1%伊紅染色，計(jì)算原頭蚴的存活率?？瞻捉M的存活率分別為99.80%±0.35%、98.59%±0.05%、98.22%±0.30%、97.72%±0.14%、96.96%±0.30%，實(shí)驗(yàn)組存活率分別為70.03%±1.39%、56.11%±2.94%、20.61%±3.44%、8.85%±1.95%、0，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)粒棘球蚴原頭蚴活性降低，大腸埃希菌對(duì)細(xì)粒棘球蚴致死作用顯著增強(qiáng)（圖2）。

2.3 大腸埃希菌對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭蚴活性氧（ROS）的影響

采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)不同時(shí)間兩組原頭蚴體內(nèi)活性氧（ROS）濃度，并使用熒光顯微鏡觀(guān)察并拍攝熒光圖片。

結(jié)果顯示空白組的原頭蚴ROS濃度幾乎無(wú)變化，與大腸埃希菌共培養(yǎng)的原頭蚴體內(nèi)ROS濃度在72 h前均高于空白組，在72 h兩組ROS濃度近乎持平。在72 h后由于實(shí)驗(yàn)組原頭蚴死亡ROS含量低于空白組。實(shí)驗(yàn)組ROS于12 h表達(dá)峰值，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=11.638， P<0.05）（圖3，圖4）。

2.4 大腸埃希菌對(duì)體外細(xì)粒棘球蚴原頭蚴Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白水平的影響

由圖5可知，在12、48、96h檢測(cè)蛋白水平，與空白組相比，不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9（T=3.435，P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組的抗凋亡蛋白Bcl-2（T=9.184，P＜0.05）表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組Nrf2蛋白（T=0.902，P=0.418）的表達(dá)水平在12 h高于對(duì)照組，但兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

大腸埃希菌是無(wú)芽孢革蘭陰性短桿菌，周身鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，胃腸道內(nèi)多見(jiàn)。其在正常棲居環(huán)境中不會(huì)致病，但當(dāng)進(jìn)入膽囊、膀胱會(huì)引起炎癥。大腸埃希菌毒力因子包括內(nèi)毒素、莢膜、黏附素和腸毒素等，是引起囊性肝包蟲(chóng)常見(jiàn)并發(fā)癥囊內(nèi)細(xì)菌感染的主要致病菌［6］。目前認(rèn)為囊型肝包蟲(chóng)發(fā)生細(xì)菌感染與膽瘺緊密相關(guān)，且前期本中心術(shù)中證實(shí)部分囊型包蟲(chóng)內(nèi)囊黃染，合并膽瘺［7］，有文獻(xiàn)分析為包蟲(chóng)囊周?chē)蝺?nèi)膽管長(zhǎng)時(shí)間受到壓迫［8-9］，發(fā)生狹窄、扭曲，膽汁淤積外滲，蟲(chóng)囊與膽道相通，細(xì)菌隨膽汁進(jìn)入蟲(chóng)囊形成感染［10］。

課題組前期使用小鼠接種膽汁處理后的原頭蚴模擬膽瘺的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)包蟲(chóng)囊腫生長(zhǎng)受到抑制［11］，后延續(xù)實(shí)驗(yàn)將膽汁與原頭蚴體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)膽汁并不能直接滅活原頭蚴 ［12］，那么隨膽汁進(jìn)入囊內(nèi)的大腸埃希菌能否直接殺死原頭蚴？這一現(xiàn)象在體內(nèi)很難進(jìn)行單一因素觀(guān)察，所以通過(guò)建立體外感染模型進(jìn)行研究。結(jié)果表明大腸埃希菌可以降低體外細(xì)粒棘球蚴活性，同時(shí)活性氧（ROS）、部分凋亡蛋白參與了此過(guò)程。

ROS在細(xì)胞增殖和凋亡中起著至關(guān)重要的作用，適當(dāng)較低的ROS水平可以作為第二信使促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS水平過(guò)高時(shí)，抗氧化功能系統(tǒng)發(fā)生破壞［13-14］，迫使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的環(huán)境中［15］，引起細(xì)胞損傷。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)過(guò)多ROS的產(chǎn)生，可以導(dǎo)致線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)受損［16］，促使細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)中，在大腸埃希菌的作用下，細(xì)粒棘球蚴體內(nèi)ROS快速積聚，12h時(shí)達(dá)到頂峰，致使細(xì)粒棘球蚴存活率降低。提示大腸埃希菌可能通過(guò)提高ROS的水平，影響細(xì)粒棘球蚴的活性。

Nrf2可以調(diào)控抗氧化應(yīng)激因子表達(dá)，從而對(duì)抗氧化損傷，但有文獻(xiàn)報(bào)道，一些毒性藥物可以增強(qiáng)氧化應(yīng)激的發(fā)生，但Nrf2的表達(dá)卻是降低的［17］。本次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Nrf2的表達(dá)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在第12 h，實(shí)驗(yàn)組Nrf2表達(dá)水平是略高于對(duì)照組的，針對(duì)這一現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)尚不能明確原因，其中涉及因素仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

Caspase家族蛋白啟動(dòng)和執(zhí)行的細(xì)胞凋亡是一種不可逆轉(zhuǎn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［18］，在Caspase家族中，Caspase-9可以通過(guò)內(nèi)源性的途徑激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［19］。在機(jī)體內(nèi)，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax相互結(jié)合，Bcl-2/Bax的相對(duì)比值是調(diào)控凋亡的決定因素［20-21］。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-9、Caspase-3、Bax表達(dá)均顯著升高，Bcl-2出現(xiàn)下調(diào)，表明大腸埃希菌感染細(xì)粒棘球蚴后，使Caspase-9發(fā)生同源活化，直接激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)粒棘球蚴死亡，同時(shí)Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值減小，促進(jìn)細(xì)粒棘球蚴發(fā)生死亡。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可知大腸埃希菌在體外可以降低細(xì)粒棘球蚴的活性，原因可能是改變了其生存環(huán)境，同時(shí)氧化應(yīng)激及線(xiàn)粒體通路部分相關(guān)蛋白參與了此過(guò)程。但具體哪些通路參與或者主要調(diào)節(jié)了此過(guò)程，這些都仍需更深一步研究。

此外在臨床觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，自然狀態(tài)下，病程較長(zhǎng)的囊型肝包蟲(chóng)內(nèi)多有鈣化發(fā)生，提示包蟲(chóng)活性降低，彭心宇教授認(rèn)為這是機(jī)體產(chǎn)生的一種營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化［22］。馬志剛等［11］研究表明囊型肝包蟲(chóng)病囊腫分型從CL型向V型演變，膽瘺發(fā)生率增高，膽瘺可以引起囊內(nèi)包蟲(chóng)活性轉(zhuǎn)變。而囊內(nèi)細(xì)菌感染與膽瘺緊密相關(guān)，因此包蟲(chóng)活性的降低與膽瘺、囊內(nèi)感染、囊壁鈣化都有著一定的聯(lián)系，但是囊內(nèi)細(xì)菌感染、膽瘺與囊壁鈣化之間有無(wú)因果關(guān)系需要繼續(xù)研究，人體內(nèi)包蟲(chóng)囊腫自然演變受多種因素影響，是一個(gè)復(fù)雜漸進(jìn)的過(guò)程，囊內(nèi)細(xì)菌感染只是包蟲(chóng)囊腫活性降低的一種因素，肝包蟲(chóng)的自然病程還需要我們更全面更深層次的研究。

參考文獻(xiàn)（References）

［1］BUDKE C M，DEPLAZES P，TORGERSON P R.Global socioeconomic impact of cystic echinococcosis［J］.Emerging Infectious Diseases，2006，12（2）：296-303.

［2］CRAIG P S，MCMANUS D P，LIGHTOWLERS M W，et al.Prevention and control of cystic echinococcosis［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（6）：385-394.

［3］中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)外科醫(yī)師分會(huì)包蟲(chóng)病外科專(zhuān)業(yè)委員會(huì).肝兩型包蟲(chóng)病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)（2019版）［J］.中華消化外科雜志，2019，18（8）：711-721.

Chinese Doctor Association，Chinese College of Surgeons （CCS），Chinese Committee for Hadytidology （CCH）.Expert consensus on diagnosis and treatment of hepatic cystic and alveolar echinococcosis （2019 edition）［J］.Chin J Dig Surg，2019，18（8）：711-721.

［3］溫浩，吐?tīng)柛砂Αぐ⒓?，邵英?肝兩型包蟲(chóng)病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)（2019版）［J］.中華消化外科雜志，2019，18（8）：711-721.

WEN H，TUERGANAILI AJI.Expert consensus on diagnosis and treatment of hepatic cystic and alveolar echinococcosis （2019 edition）［J］.Chinese Journal of Digestive Surgery，2019，18（8）：711-721.

［4］CASTILLO S，MANTEROLA C，GRANDE L，et al.Infected hepatic echinococcosis Clinical therapeutic and prognostic aspects，A systematic review［J］.Ann Hepatol，2021，22：100237.

［5］郭煒.囊型肝包蟲(chóng)病自然病程的體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2019.

［6］張峰，楊青，劉會(huì)苗.肝包蟲(chóng)囊腫細(xì)菌感染病原菌分布、影像學(xué)表現(xiàn)及超聲引導(dǎo)下穿刺不同處理措施對(duì)治療療效的影響［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（23）：5361-5363.

ZHANG F，YANG Q，LIU H M.Distribution，imaging performance and efficacy of different treatment measures of ultrasound guided puncture on the treatment of hepatic hydatid cyst patients with bacterial infections［J］.Chinese Journal of Nosocomiology，2016，26（23）：5361-5363.

［7］楊宏強(qiáng)，彭心宇，張示杰，等.囊性肝包蟲(chóng)病合并膽瘺的手術(shù)治療［J］.中國(guó)綜合臨床，2006（4）：360-362.

YANG H Q，PENG X Y，ZHANG S J，et al.Surgical treatment of cystic hepatic echinococcosis complicated with biliary fistula［J］.China Comprehensive Clinic，2006（4）：360-362.

［8］ECKERT J，DEPLAZES P.Biological，epidemiological，and clinical aspects of echinococcosis，a zoonosis of increasing concern［J］.Clin Microbiol Rev，2004，17（1）：107-135.

［9］溫浩，徐明謙.實(shí)用包蟲(chóng)病學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2007.

WEN H，XU M Q.Practical hydatid disease［M］.Beijing：science Press，2007.

［10］BUDKE C M，DEPLAZES P，TORGERSON P R.Global socioeconomic impact of cystic echinococcosis［J］.Emerg Infect Dis，2006，12（2）：296-303.

［11］馬志剛.囊型肝包蟲(chóng)病合并膽瘺對(duì)其生命周期影響的研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2010.

［12］郭煒，王朝陽(yáng)，于云寶，等.膽汁對(duì)體外培養(yǎng)人細(xì)粒棘球蚴原頭蚴生長(zhǎng)發(fā)育的影響［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，36（2）：259-264.

GUO W，WANG C Y，YU Y B，et al.Effect of bile on the growth and development of human Echinococcus granulosus protoscoles in vitro［J］.Journal of Shihezi University （Natural Science Edition），2018，36 （2）：259-264.

［13］SHI H，LEI Y，WANG B，et al.Protoscolicidal effects of chenodeoxycholic acid on protoscoleces of Echinococcus granulosus［J］.Experimental Parasitology，2016，167：76-82.

［14］WANG B，JIANG Y F，WANG Z，et al.Arsenic trioxide negatively affects echinococcus granulosus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2015，59（11）：6946-6951.

［15］SHEN S，YAN Z，WU J，et al.Characterization of ROS metabolic equilibrium reclassifies pan-cancer samples and guides pathway targeting therapy［J］.Front Oncol，2020，20（10）：581197.

［16］HE H，WANG L，QIAO Y，et al.Doxorubicin induces endotheliotoxicity and mitochondrial dysfunction via ROS/eNOS/NO Pathway［J］.Front Pharmacol，2020，10（10）：1531.

［17］YUN Q，WU Y，MENG M，et al.GYY4137 protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via activation of the PHLPP-1/Akt/Nrf2 signaling pathway in diabetic mice［J］.Journal of Surgical Research，2018，225：29-39.

［18］AMPTOULACH S，LAZARIS A C，GLANNOPOULOU I，et al．Expression of Caspase-3predicts prognosis in advanced noncardia gastric cancer［J］．Med Oncol，2015，32 （1）：416.

［19］THORNBERRY N A，LAZEBNIK Y.Caspases：Enemies within（1998）［J］.Science，2018（5381），1312-1316.

［20］OLA M S，NAWAZ M，AHSAN H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，2011，351（1-2）：41-58.

［21］ZHUANG Y，XU H，Richard S A，et al.Inhibition of EPAC2 attenuates intracerebral hemorrhage-induced secondary brain injury via the p38/BIM/Caspase-3 pathway［J］.Mol Neurosci，2019，67（3）：353-363.

［22］彭心宇，李建輝，趙瑾.肝細(xì)粒棘球蚴周?chē)w維囊壁鈣化分布及意義［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（9）：825-827，832.

PENG X Y，LI J H，ZHAO J.Distribution of calcium deposits in the pericystic layers of hepatic hydatid cyst and its significances［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2006，22（9）：825-827，832.

（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81860363）;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（2020-PT330-003）

作者簡(jiǎn)介：苗章（1992—），男，碩士研究生，住院醫(yī)師，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槠胀ㄍ饪啤?/p>

*通信作者：張宏偉（1983—），男，副教授，從事肝膽胰外科研究，e-mail：zhw0108@163.com。