基于生物信息學(xué)分析EDIL3基因在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

王慧娟　郭炳軒　宋樹言　李楊楊　者湘漪　李洪濤　李冬妹　潘澤民

摘要：目的 探討表皮生長因子樣重復(fù)序列和盤狀蛋白I樣結(jié)構(gòu)域3（EDIL3基因）在宮頸癌中表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa遷移的作用。方法 運(yùn)用GEPIA、UALCAN、OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)水平、基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和預(yù)后的意義；采用免疫組織化學(xué)染色、Western blot、qRT-PCR分別檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞中EDIL3蛋白及EDIL3基因mRNA表達(dá)水平；構(gòu)建EDIL3-pcDNA3.1過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)EDIL3-pcDNA3.1質(zhì)粒）和對(duì)照組NC（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒），transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa的遷移。結(jié)果 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析顯示EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中低表達(dá)并且存在啟動(dòng)子高甲基化（P＜0.05），在宮頸癌不同分期中EDIL3基因的表達(dá)無差異（P＞0.05），EDIL3高表達(dá)與宮頸癌患者不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色、Western blot、qRT-PCR與數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，在宮頸癌組織和細(xì)胞中EDIL3 基因均低表達(dá)（P＜0.05），且其表達(dá)水平與 HPV感染無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；Transwell實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)EDIL3后增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa的遷移能力 （P＜0.05）。結(jié)論 EDIL3 基因在宮頸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)并不受HPV感染的影響，而EDIL3高表達(dá)影響患者預(yù)后且促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞 SiHa 、HeLa的遷移能力。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；EDIL3基因；HPV；遷移

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R737.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Expression and clinical significance of EDIL3 gene in cervical cancer based

on bioinformatics analysis

WANG Huijuan GUO? Bingxuan2，SONG? Shuyan2，LI Yangyang2，ZHE? Xiangyi2，3，LI? Hongtao3，LI? Dongmei2，PAN? Zemin2*

（1 Department of Laboratory Medicine， The First Affiliated Hospital of School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，

Xinjiang 832008， China; 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Medicine， Shihezi University/Key

Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases Shihezi， Xinjiang 832002， China; 3 Department of Anatomy and Histology

and Embryology， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract： ?Objective To investigate the expression of epidermal growth factor-like repeat and discoid protein i-like domain 3（EDIL3 gene） in cervical cancer and its effects on the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Methods GEPIA， UALCAN and OncoLnc databases were used to analyze the expression level， methylation status of gene promoter and prognostic significance of EDIL3 mRNA in cervical cancer. Immunohistochemical staining， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression levels of EDIL3 protein and EDIL3 mRNA in cervical cancer tissues and cells， respectively. Overexpression plasmid of EDIL3-pcDNA3.1 was designed and divided into experimental group （transfected with EDIL3 plasmid） and control group NC （transfected with empty plasmid）. transwell experiment was used to detect the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Results Bioinformatics database analysis showed that EDIL3 gene mRNA was low expressed and the promoter was hypermethylated in cervical cancer tissues （P<0.05）， and there was no difference in expression among different stages of cervical cancer （P > 0.05）. High EDI13 expression was associated with poor prognosis of cervical cancer patients （P<0.05）. The results of immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were consistent with those of database analysis. The expression level of EDIL3 gene in both tissues and cells of cervical cancer was low （P<0.05）， and there was no significant correlation between its expression level and HPV infection （P > 0.05）. Transwell experiment showed that the overexpression of EDIL3 gene enhanced the migration capacity of cervical cancer cells SiHa and HeLa （P<0.05）. Conclusion The low expression of EDI13 gene in cervical cancer tissues and cells is not affected by HPV infection， while the high expression of EDI13 affects the prognosis of patients and promotes the migration ability of cervical cancer cells SiHa and HeLa.

Key words： Cervical cancer;EDIL3 gene;HPV;Migration

宮頸癌是一種在臨床中非常常見的女性生殖道癌癥，也是不發(fā)達(dá)國家和地區(qū)因癌癥而死亡的最常見的原因之一［1］。剛剛發(fā)布的《2020年世界癌癥報(bào)告》分析了中國癌癥病例的變化和特點(diǎn)，新增宮頸癌患者60萬例，因?qū)m頸癌病死34萬例［2］。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生的重要原因包括高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持續(xù)性感染，如HPV16、HPV18和HPV52，雖然針對(duì)高危型HPV研發(fā)了疫苗，但接種疫苗的人員并沒有普及，特別是一些不發(fā)達(dá)地區(qū)的女性［3］?，F(xiàn)如今臨床治療宮頸癌主要采用免疫和手術(shù)等綜合治療方法，但很大一部分患者生存率依然很低，因此迫切需要探索診治宮頸癌的新策略、新方向和新靶點(diǎn)。

表皮生長因子樣重復(fù)序列和盤狀蛋白I樣結(jié)構(gòu)域3（epidermal growth factor-like repeats and discoidin I-like domains EDIL3）又稱為發(fā)育內(nèi)皮基因座-1（developmental endothelial locus-1，Del-1），位于人染色體5q14，3，分子量為52 kDa，全長約6 500 bp，EDIL3是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，早期在小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)，亦是一種由胚胎內(nèi)皮細(xì)胞分泌的糖蛋白。EDIL3編碼的蛋白質(zhì)是整合素配體，通過與整合素αvβ5相互作用促進(jìn)新血管的生長［4］。EDIL3在結(jié)直腸癌［5］和肺腺癌［6］中表達(dá)下調(diào)，相反，其在乳腺癌［7］、胰腺癌［8］中表達(dá)水平增加，并與疾病預(yù)后不良相關(guān)。

至今為止，尚未見EDIL3基因在宮頸癌中作用研究的相關(guān)報(bào)道，因此本研究探討EDIL3基因在宮頸癌中的表達(dá)情況及臨床意義，旨在為宮頸癌的預(yù)防和診治提供有價(jià)值的基礎(chǔ)研究和臨床指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

實(shí)驗(yàn)選取購自武漢普諾賽生命科技公司的宮頸癌細(xì)胞株SiHa、HeLa和人宮頸上皮永生化細(xì)胞株HaCaT作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)所用試劑有美國Gibco 公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）;北京中山金橋公司生產(chǎn)GAPDH鼠單克隆抗體;美國Promege公司生產(chǎn)的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑;兔單克隆抗體EDIL3購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;EDIL3-pcDNA3.1過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 數(shù)據(jù)來源

1.2.1 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數(shù)據(jù)庫

GEPIA在線應(yīng)用數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大學(xué)各級(jí)專家精心研制開發(fā)的一款軟件，目前已更新到2.0版本。

該數(shù)據(jù)庫含有TCGA和GTEx 2個(gè)數(shù)據(jù)庫中正常組織樣本8 587個(gè)和腫瘤樣本9 736個(gè)，在正常組織和腫瘤組織中用以分析某基因的表達(dá)差異性、預(yù)后及相關(guān)性等。該在線工具在本研究中主要挖掘EDIL3在宮頸癌及正常宮頸組織中的ｍRNA表達(dá)差異。篩選條件如下： Expression Analysis： Expression DIY； Box Plot， Gene：EDIL3， Cancer name： CESC； Plot， 其余條件不變；Stage Plot分析宮頸癌不同分期中的基因表達(dá)。

1.2.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）主要建立在腫瘤基因組圖譜 TCGA數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上用于對(duì)某基因的表達(dá)譜、啟動(dòng)子甲基化情況、biomarker鑒定、相關(guān)性、泛癌表達(dá)及預(yù)后等相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

本研究應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫對(duì)EDIL3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析。篩選條件如下： TCGA Gene analysis： ”EDIL3”，” Cervical squamous cell carcinoma”；Methylation： ”Sample types”。

1.2.3 OncoLnc數(shù)據(jù)庫

OncoLnc數(shù)據(jù)庫（www.oncolnc.org）包括了TCGA數(shù)據(jù)庫中8647個(gè)病人的21種腫瘤的臨床信息、生存信息及對(duì)應(yīng)的mRNA和miRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和來源于MiTranscriptome項(xiàng)目中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，因此該數(shù)據(jù)庫囊括了mRNA、miRNA和lncRNA 3種轉(zhuǎn)錄本的生存分析，使用戶探索研究腫瘤中和生存分析相關(guān)的基因更加便利。篩選條件如下： Gene：EDIL3，Submit;選擇宮頸癌（CESC），點(diǎn)擊Yes Please提交；在新彈出的頁面中定義Cutoff值（一般用中位數(shù)定義分組，即50%），Submit后就能看到KM生存圖和P值了;點(diǎn)擊Click Here下載Excel格式的原始數(shù)據(jù)，使用X-tile軟件計(jì)算Ｐ<0.05時(shí)的Cutoff值，重新分析結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇液氮中凍存的細(xì)胞后將SiHa、HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的FBS和1%的雙抗（青、鏈霉素）的DMEM中，HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含15% 的FBS和1%的雙抗的DMEM中，細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37℃。用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期的細(xì)胞3 min并1∶3傳代，連續(xù)傳三代后進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取180uL SiHa細(xì)胞鋪板， 培養(yǎng)24h棄去6孔板中培養(yǎng)基后用1×PBS洗滌兩遍，加入800 μL DMEM備用。配置A 液：100 μL DMEM+2 μg EDIL3過表達(dá)質(zhì)粒；B液：100 μL DMEM+2 μg空質(zhì)粒NC；C液2份：100 μL DMEM +5 μL Lipofectamine2000，靜置5 min后，將Ａ液與一份Ｃ液混勻，Ｂ液與另一份Ｃ液混勻后共同靜置20 min不要移動(dòng)，然后將混合液A+C和B+C分別散在均勻滴入上面?zhèn)溆?孔板細(xì)胞中，4～6 h后換完全培養(yǎng)基，24h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同上。

1.3.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中EDIL3基因 mRNA的表達(dá)水平

將處于對(duì)數(shù)期狀態(tài)的細(xì)胞使用TRIzol提取總RNA，然后把提取到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA放入低溫冰箱備用。以2 μL cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增（預(yù)變性90℃ 30s，95℃ 3s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)）。使用實(shí)驗(yàn)室22331 Hamburg型 PCR儀自帶軟件分析及獲取循環(huán)閾值ＣＴ，最后使用公式2-△△CT計(jì)算細(xì)胞mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中EDIL3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

在處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞皿中加入RIPA+1%PMSF裂解液放入冰箱裂解20 min，待細(xì)胞呈流沙狀態(tài)完全裂解后用刮刀將全部細(xì)胞刮入EP管中備用，12 000 r·min-1，4 ℃離心15min。吸取部分蛋白按4∶1比例加入5×Loading Buffer后煮沸（100 ℃，10 min）放入冰箱冰凍儲(chǔ)存，剩余20 μL使用BCA試劑測(cè)定其濃度。用SDS-PAGE （80 V 30min后110 V 1h）分離20 mg蛋白后濕轉(zhuǎn)（110 V，60min）至PVDF膜上，加入雀巢脫脂奶粉封閉（5%，常溫，2h）后孵育一抗（1∶1 000，4℃）過夜雜交，TBST洗滌3次后孵育二抗（1∶5 000，室溫，2h）。TBST洗滌3次后由Protein-Simple公司的Fluorchen HD2化學(xué)發(fā)光儀曝光條帶及使用ImageJ軟件測(cè)定各條帶灰度值。目的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白質(zhì)條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.3.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織中EDIL3蛋白質(zhì)表達(dá)水平

選取本校第一附屬醫(yī)院收治的宮頸癌患者石蠟包埋的組織樣本72例及炎癥患者石蠟包埋的組織樣本36例，實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者的知情同意。使用第二代雜交俘獲 （hybrid capture system-2，HC-2） 技術(shù)檢測(cè)所收集診斷為宮頸癌疾病的樣本的 HPV感染的情況，所有組織樣本嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行染色。EDIL3抗體濃度為1∶3 200。使用半定量計(jì)分法判斷EDIL3陽性表達(dá)：陽性細(xì)胞數(shù)大于75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，小于5%為0分﹔在高倍鏡視野下根據(jù)顯色強(qiáng)度判斷陽性強(qiáng)度：棕褐色為3分，棕黃色為2分，黃色為1分，無陽性細(xì)胞為0分。求取上述兩項(xiàng)得分乘積：0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（++），5～7分為強(qiáng)陽性（+++）。本實(shí)驗(yàn)取陰性和弱陽性歸一為陰性，中陽性和強(qiáng)陽性歸一為陽性，結(jié)果由醫(yī)院病理科兩名副主任醫(yī)師以上以雙盲法獨(dú)立確定。

1.3.6 Transwell體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiHa、HeLa 細(xì)胞遷移能力

取兩組SiHa細(xì)胞（過表達(dá)EDIL3組和對(duì)照組NC），用胰蛋白酶消化后離心棄上清液使用PBS清洗1遍，加入無血清DMEM制成細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)以調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105 mL-1，24孔板中每孔加入含15% FBS總量為600 μl的 DMEM，用鑷子輕輕將Transwell小室放入培養(yǎng)基中（避免產(chǎn)生氣泡），吸取200 μL配置好的懸液梅花式點(diǎn)入 Transwell小室的上室，不要搖動(dòng)放入條件為 37 ℃、5% CO2的 培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。36h后用1mL PBS分別清洗小室的上、下室兩次后使用40 g·L-1多聚甲醛固定 半小時(shí)及0.1%的結(jié)晶紫室溫孵育半小時(shí)，最后用清水輕柔洗滌3遍后使用干凈棉簽輕輕擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)拍9個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。HeLa 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)同上。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究所有數(shù)據(jù)均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X-±S表示。采用t檢驗(yàn)比較兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，卡方檢驗(yàn)用于石蠟切片免疫組織化學(xué)結(jié)果分析，Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)分析兩者的相關(guān)性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)宮頸癌組織中EDIL3基因 mRNA表達(dá)水平

根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與正常宮頸組織相比較，EDIL3基因 mRNA在宮頸癌組織中低表達(dá)（P<0.05），在宮頸癌不同分期中的基因表達(dá)無差異（P>0.05）（圖1）。

2.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌組織中EDIL3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)EDIL3基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌組織中的水平，結(jié)果顯示EDIL3基因啟動(dòng)子在宮頸癌組織中高甲基化，P=1.62E-12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析EDIL3基因表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

OncoLnc數(shù)據(jù)庫選取患宮頸癌疾病263例病人分析其預(yù)后，其中126例患者EDIL3高表達(dá)和 137例患者EDIL3低表達(dá)。結(jié)果顯示EDIL3高表達(dá)的宮頸癌患者生存率較低表達(dá)的宮頸癌患者低，預(yù)后不良，（P<0.05）（圖3）。

2.4 免疫組織化學(xué)分析EDIL3在宮頸癌組織中的表達(dá)水平

采用免疫組織化學(xué)分析宮頸組織樣本中EDIL3蛋白質(zhì)表達(dá)水平，檢測(cè)到EDIL3定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖4）。染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示與正常宮頸組織相比，EDIL3在宮頸癌組織中低表達(dá)（P<0.05）（表1）。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析EDIL3在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

采用Western blot和qRT-PCR分別對(duì)宮頸細(xì)胞中EDIL3蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示EDIL3蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平在SiHa、HeLa中相對(duì)HaCaT較低（P<0.05）（圖5）。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-10-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82060518，U1503125）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)國際科技合作計(jì)劃基金項(xiàng)目（2019BC007）;石河子大學(xué)科研基金項(xiàng)目（ZZZC2021107）

作者簡介：王慧娟（1986—），女，碩士研究生，主管技師，專業(yè)方向?yàn)槿梭w重要功能蛋白的克隆與基因工程。

*通信作者： 潘澤民（1966—），男，教授，博士生導(dǎo)師， 從事人體重要功能蛋白的克隆與基因工程的研究，e-mail：panteacher89@sina.com。