硫酸鹽對粘紅酵母X-20富硒能力的調(diào)控研究

郭錦堂　薄少波　張根林

摘要：為了探究硫酸鹽對粘紅酵母X-20（Rhodotorula glutinis X-20）富硒的影響，在恒定濃度亞硒酸鈉和梯度濃度硫酸鈉條件下培養(yǎng)R.glutinis X-20，研究硫酸鹽對R.glutinis X-20生物量、總硒及硒納米顆粒的影響，并使用RT-qPCR初步探索了硫酸鹽調(diào)節(jié)R.glutinis X-20富硒的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸鈉的添加使菌株的生物量提高了48.5%，總硒及硒納米顆粒含量分別降低了36.7%和48.8%。RT-qPCR分析顯示硫酸鹽會抑制硒代謝關(guān)鍵基因CTH、metE、metB的表達(dá)，造成硫酸鹽存在條件下總硒及硒納米顆粒含量下降。硫酸鹽的添加提高了R.glutinis X-20在亞硒酸鈉環(huán)境中的生物量，這對富硒酵母產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。同時，RT-qPCR的結(jié)果也為R.glutinis X-20在分子生物學(xué)上的優(yōu)化指明了方向。

關(guān)鍵詞：粘紅酵母；硫酸鹽；硒代謝；硒納米顆粒

中圖分類號：中圖分類號Q815文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Sulfate regulation of selenium enrichment in Rhodotorula glutinis X-20

GUO? Jintang，BO? Shaobo，ZHANG? Genlin*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832003，China）

Abstract： ?To investigate the effect of sulfate on the selenium enrichment of Rhodotorula glutinis X-20， the yeast was cultured under constant sodium selenite concentration and gradient sodium sulfate concentration to investigate the effect of sulfate on the biomass of the yeast， total selenium and selenium nanoparticles， and RT-qPCR was used to explore the preliminary mechanism of sulfate regulation of yeast selenium enrichment using RT-qPCR to explore the molecular mechanism of sulfate regulation. The addition of sodium sulfate was found to increase the biomass of the yeast strain by 48.5% and decrease the total content of selenium and selenium nanoparticle by 36.7% and 48.8%， respectively. RT-qPCR analysis revealed that sulfate suppressed the expression of CTH， metE， and metB， key genes for selenium metabolism， resulting in a decrease in the total content of selenium and selenium nanoparticles in the presence of sulfate. The addition of sulfate improved the biomass of R.glutinis X-20 in the sodium selenite environment， which is important for the large-scale production of selenium-enriched yeast products. Meanwhile， the results of RT-qPCR also indicated the direction for the optimization of R.glutinis X-20 in molecular biology.

Key words： Rhodotorula glutinis;sulfate;selenium metabolism;selenium nanoparticles

硒（Se）最早由瑞典科學(xué)家J.J.Berzelius于1817年發(fā)現(xiàn)，早期被認(rèn)為是一種有毒物質(zhì)［1］。但在20世紀(jì)中葉，對大鼠疾病研究顯示硒對動物存在積極的作用［2］。1973年硒代半胱氨酸被發(fā)現(xiàn)是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心成分。同年，世界衛(wèi)生組織確認(rèn)硒是人體重要的微量元素之一［3］。至此，結(jié)束了持續(xù)100多年的硒是有毒物質(zhì)還是有益元素的爭論，并開啟了硒元素化學(xué)形態(tài)及生物學(xué)效應(yīng)的研究熱潮。截至目前，已經(jīng)有包括富硒酵母、富硒大米等大量富硒產(chǎn)品投入使用。

自然界中，硒主要以無機硒和有機硒的形式存在。硒酸鹽、亞硒酸鹽等無機硒主要存在于土壤巖石中，有機硒則多以硒代氨基酸的形式存在于生物體中，無機硒和有機硒都能為人體起到補充硒的作用，但是相較于無機硒，有機硒毒性更小且生物活性更高［4］。

硒在生物學(xué)中起著重要的作用。它是人類和動物體內(nèi)必需的微量元素，是多種硒蛋白的重要組成元素，同時硒代氨基酸也充當(dāng)著多種抗氧化酶的活性中心，如谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）等，它們能夠保護細(xì)胞免受氧化過程中產(chǎn)生的自由基的有害影響［5］。同時硒也被證明能夠減少活性氧引起的人類疾?。?-8］。此外，有研究［9］表明適量的硒能夠有效降低某些癌癥的發(fā)病率和死亡率。相反的，硒的缺乏也會引起一些疾病。中國廣泛存在的地方性疾病克山病主要病因就是硒元素的缺乏。硒攝入不足也會導(dǎo)致牛羊等家畜出現(xiàn)肌肉萎縮、肝壞死、牙周病、不育癥和發(fā)育不全等疾?。?，10-11］。然而天然產(chǎn)品中的硒含量普遍較低，無法滿足人體對硒的需求［12］。通過給動物飼喂富硒日糧，能夠?qū)⑽杂袡C形態(tài)的形式富集在肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品中，再經(jīng)過生物鏈的傳遞進入人體，是一種經(jīng)濟安全的補硒方式［13］。目前雖然大多數(shù)飼料依舊使用亞硒酸鈉作為硒添加劑，但是對于生物體來說，亞硒酸鈉存在毒性大，生物利用性低的弊端［14-15］。因此，相比于硒酸鹽、亞硒酸鹽等無機硒源，富硒酵母作為一種更加安全、廉價且快速的富硒手段被廣泛接受。

由于硒元素與硫元素的相似性，酵母對硒的富集主要是借助硫的代謝途徑進行的，具體步驟如圖1所示。硒酸鹽首先借助ATP磺化酶等酶的作用轉(zhuǎn)化為亞硒酸鹽，并在硫酸鹽還原酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為硒化氫。硒化氫與O-乙酰高絲氨酸在胱硫醚γ合酶的作用下生成硒代高半胱氨酸，這是無機硒向有機硒轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。接下來，在胱硫醚γ-裂解酶和5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成硒代半胱氨酸及硒代甲硫氨酸［16］。

相較于硒酸鹽，亞硒酸鹽細(xì)胞毒性較低［15］，因此本實驗使用亞硒酸鹽作為硒源，并使用梯度濃度的硫酸鹽對富硒酵母Rhodotorula glutinis X-20進行培養(yǎng)，通過對富硒酵母生長速率、總硒含量、硒納米顆粒含量的變化進行分析，探究硫酸鹽對富硒酵母富硒能力的影響，同時使用RT-qPCR探究在以上條件下CTH、metE、metB基因表達(dá)量的變化，為富硒酵母產(chǎn)品的開發(fā)和優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

本實驗所用的粘紅酵母R.glutinis X-20篩選自新疆天山北部富硒地區(qū)［17］。菌株被保藏到中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2017225。使用YPD培養(yǎng)基（20 g·L-1胰蛋白胨、10 g·L-1酵母浸出粉、20 g·L-1葡萄糖）對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

MLS33750型高壓滅菌鍋，三洋（日本）公司；Megafuge 8R臺式離心機，Thermo Fisher（美國）公司；Light Cycler-96實時熒光定量PCR儀，Roche（瑞士）公司；UV-2600紫外分光光度計，島津（日本）公司；ICAP6300光譜儀，Thermo Fisher（美國）公司。

1.2.2 主要試劑

酵母總RNA提取試劑盒購買自生工生物工程（上海）股份有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒購買自南京諾唯贊生物科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus）試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 菌株培養(yǎng)

菌株從-80℃超低溫冰箱取出后使用YPD固體培養(yǎng)基活化，挑取單菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基，220 r·min-1，30℃培養(yǎng)至OD值為1時作種子液。按1%的接種量將種子液接種至添加了恒定濃度亞硒酸鈉（30mg·L-1）及梯度濃度硫酸鈉（0、5、10、20、40、60、120 mg·L-1）的YPD液體培養(yǎng)基中，每隔12h測菌液OD值，繪制生長曲線。

1.4 總硒測定

使用電感耦合等離子體光譜法檢測酵母樣品中的總硒。使用冷凍干燥獲取干酵母樣品，稱重后取適量干酵母樣品置于聚四氟乙烯消解罐中，加入6.0 mL HNO3和 2.0 mL 30% H2O2，于通風(fēng)櫥中靜置過夜。密閉消解罐，按表1微波消解程序進行消解；消解完畢后，打開消解罐，將消解后的樣品溶液在電熱板130℃上加熱趕酸至 1～2 mL左右，冷卻后使用超純水定容至 25 mL，同時做空白試驗［18］。

取10 mL定容后的樣品上機待測。檢測條件：射頻功率 1 300 W，等離子體流量15 L·min-1，輔助氣流量0.2 L·min-1，霧化氣流量 0.6 L·min-1，軸向觀測。

1.5 硒納米顆粒的檢測

將培養(yǎng)后的菌體10 000 rpm離心10 min，棄上清，使用5 mL 1M氯化鈉洗3次，并在2.5 mL 1M硫化鈉（Na2S）溶液中溶解1 h，在4 000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞壁部分。用紫外分光光度計在500nm處測定樣品的吸光度。

硒納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)Biswas等［19］的方法構(gòu)建的。配制6 mg·mL-1亞硒酸鈉母液，分別吸取取50、100、200、300、400 μL母液并加入250 μl 0.1M 鹽酸羥胺使SeO32-定量還原為Se0。然后，向每個試管中加入1 mL 1M的Na2S溶液，1 h后，測量溶液在500 nm處的吸光度。以Se0的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，500 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

1.6 RNA的提取及RT-qPCR

酵母總RNA的提取使用生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒，純化后的RNA使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄操作，接著使用SYBR Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus）試劑盒進行RT-qPCR操作，以檢測不同濃度硫酸鹽影響下的硒代謝關(guān)鍵基因CTH、metE、metB的表達(dá)量，并以ACT1作為內(nèi)參基因。所用的引物由Primer3在線設(shè)計（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）。引物信息見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸鹽對酵母生長的影響

使用恒定濃度的亞硒酸鹽（30mg·L-1）及梯度濃度的硫酸鹽（0、5、10、20、40、60、120 mg·L-1）對R. glutinis X-20進行培養(yǎng)，每隔12h記錄菌液OD值以繪制硫酸鹽影響下的酵母生長曲線。實驗結(jié)果如圖3所示，在初始的10 h內(nèi)，添加了亞硒酸鹽的酵母生長速率與對照組相差較小，這與普遍認(rèn)為的硒能夠抑制酵母生長的觀點相沖突。Zhou等［20］研究認(rèn)為，硒的加入能夠改善酵母細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶的代謝，這可以幫助酵母細(xì)胞適應(yīng)發(fā)酵過程中的脅迫作用，從而促進酵母細(xì)胞的生長。但是隨著發(fā)酵時間的增長，亞硒酸鹽對酵母細(xì)胞的抑制作用更加顯著，其生長速率也逐漸減慢?？傮w上，只添加亞硒酸鹽時，粘紅酵母的生長受到明顯的抑制，但額外添加不同濃度的硫酸鹽時，酵母生長速率略有恢復(fù)，但始終低于對照組。

2.2 硫酸鹽對酵母富硒能力的影響

使用2.1相同的方式培養(yǎng)菌株，84 h后收集菌體，使用冷凍干燥儀干燥菌體后稱重，取0.2 g干菌體按照1.3中微波消解法處理樣品后使用電感耦合等離子體光譜法檢測酵母細(xì)胞中總硒的含量。圖4表明在不添加硫酸鈉和亞硒酸鈉的條件下，酵母生物量最高，為9.44 g·L-1。在單獨添加亞硒酸鈉時，菌體生物量最低，只有5.63 g·L-1，但此時總硒含量最高達(dá)到256.6 μg·g-1，說明亞硒酸鹽的細(xì)胞毒性對菌株的生長影響較大。隨著硫酸鹽的加入，菌體總硒含量降低至原來的60%左右，但生物量恢復(fù)至接近對照組的水平，說明硫酸鹽的加入能夠促進R.glutinis X-20在亞硒酸鈉環(huán)境中的生長。考慮到硒在酵母中的代謝是借助硫酸鹽代謝途徑進行的，因此推測硫酸鹽的加入能夠降低酵母細(xì)胞中硒對硫的取代，減少硒元素帶來的有害影響。研究［16］表明，酵母對硒酸鹽的吸收嚴(yán)格依賴于培養(yǎng)基中硫酸鹽的水平，只有在硫酸鹽含量不足時，硒酸鹽才能完全被酵母吸收和代謝。然而，在僅考慮酵母富硒能力時，硫酸鹽的加入顯然是不利的。

2.3 硫酸鹽對硒納米顆粒形成的影響

硒納米顆粒與其他氧化態(tài)相比，零價硒具有低毒性和更好的生物利用度，具有其它形式的硒不具備的優(yōu)勢，如小尺寸（50～300 nm）、高穩(wěn)定性、疏水性和大表面積［21］。生物合成的納米顆粒具有顯著的特性，例如良好的粘附性、摩擦學(xué)特性、光學(xué)和電學(xué)特性等［22-24］。在硒脅迫環(huán)境下，R.glutinis X-20在培養(yǎng)過程中也產(chǎn)生了明顯的紅色沉淀，是硒納米顆粒形成的明顯特征。在對硒納米顆粒濃度檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，硫酸鹽對硒納米顆粒生物合成的影響與其對酵母總硒的影響相似，在只添加亞硒酸鈉的情況下，酵母生物合成硒納米顆粒的能力最強，硒納米顆粒濃度為45.29 μg·g-1（圖5）。但此時菌體生物量最少，只有空白組的59.6%。后續(xù)加入硫酸鹽后硒納米顆粒合成量降低至只添加亞硒酸鈉時的50%左右，產(chǎn)生這種影響的原因可能與硫酸鹽對總硒的影響相關(guān)。

2.4 硫酸鹽對富硒相關(guān)基因表達(dá)量的影響

依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，酵母硒代謝過程中，調(diào)控?zé)o機硒向有機硒轉(zhuǎn)化的胱硫醚γ合酶基因（cystathionine gamma-synthase，metB），調(diào)控硒代半胱氨酸合成的胱硫醚γ-裂解酶基因（cystathionine gamma-lyase，CTH），調(diào)控硒代甲硫氨酸合成的5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（5-methyltetrahydropteroy-ltriglutamate-homocysteine S-methyltransferase，metE）是其中的關(guān)鍵基因。利用RT-qPCR方法檢測了在不同硫酸鹽濃度下CTH、metB、metE基因表達(dá)量的變化。圖6是使用對獲得的RT-qPCR數(shù)據(jù)進行分析獲得的溶解曲線，每條溶解曲線只有一個峰，且特征峰出現(xiàn)在80℃之后，說明RT-qPCR過程中沒有引物二聚體等非特異性擴增，實驗獲得的數(shù)據(jù)可信。

qPCR獲得的實驗結(jié)果見圖7，在只加入亞硒酸鈉的條件下，CTH、metE、metB 3個基因均有上調(diào)，分別上調(diào)至對照組的2.93倍、1.29倍和1.35倍。加入硫酸鹽后，CTH的表達(dá)量恢復(fù)至對照組的水平。metE，metB被抑制表達(dá)，表達(dá)量分別下降42%和64%。結(jié)合總硒及硒納米顆粒檢測結(jié)果，CTH、metE、metB基因?qū)單猁}和硫酸鹽有明顯的響應(yīng)，亞硒酸鈉的加入使這3個基因的表達(dá)水平提高，此時酵母總硒及硒納米顆粒含量均有增加；加入不同濃度硫酸鈉后CTH、metE、metB表達(dá)量均有降低，相應(yīng)的，酵母總硒及硒納米顆粒含量也隨之降低。這說明這3個基因是影響酵母總硒及硒納米顆粒合成的關(guān)鍵因素。同時硫酸鹽能夠調(diào)節(jié)硒環(huán)境中CTH、metE、metB基因的表達(dá)，進而影響酵母硒代謝。

3 討論與結(jié)論

由于硒元素與硫元素化學(xué)性質(zhì)的相似性，微生物對硒的代謝與硫代謝機制相似。硒酸鹽和亞硒酸鹽進入酵母細(xì)胞后，能夠借助硫酸鹽的還原途徑［25］，還原為硒代謝重要中間產(chǎn)物硒化氫（H2Se），這可能是硒酸鹽或亞硒酸鹽產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要原因［26］。同時，硒元素能夠取代含硫氨基酸中的硫元素生成硒代氨基酸，并且非特異性的插入蛋白質(zhì)中，相關(guān)研究表明，蛋白質(zhì)中硒代甲硫氨酸取代甲硫氨酸雖然不會顯著改變酶的動力學(xué)特征，但是會影響它們的物理特性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。例如，50%的蛋氨酸殘基被硒代甲硫氨酸取代的β-半乳糖苷酶蛋白具有與野生型酶相似的 Km和 Vmax值，但是，與野生型酶相比，含有硒代甲硫氨酸的β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性較差［8，27］，這也是硒元素細(xì)胞毒性的原因之一。

本研究中，使用30 mg·L-1亞硒酸鈉對R.glutinis X-20進行培養(yǎng)，實驗獲得的生長曲線及生物量相關(guān)數(shù)據(jù)均表明亞硒酸鈉對菌株的生長產(chǎn)生了明顯的抑制，并且在加入不同濃度的硫酸鹽后，菌株生物量得以恢復(fù)，但始終無法恢復(fù)至對照組的水平。在相同培養(yǎng)條件下對總硒和硒納米顆粒的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，相比于只添加亞硒酸鈉的酵母菌株，添加不同濃度硫酸鈉后總硒及硒納米顆粒含量均有所降低，且在5～120 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，總硒及硒納米顆粒含量的降低程度與硫酸鈉濃度無關(guān)。因此，可以初步推斷硫酸鹽在酵母生長過程中硒與硫的競爭中存在明顯的優(yōu)勢，硫酸鹽的加入降低了酵母對硒元素的富集，這減少了硒化氫（H2Se）的合成，降低了含硫蛋白質(zhì)中硒元素的摻入，從而使R.glutinis X-20在亞硒酸鈉環(huán)境中的生物量有所恢復(fù)。但是此過程中使用硫酸鹽的最低濃度還需要進一步研究。而在對硒代謝關(guān)鍵基因CTH、metE、metB表達(dá)量的檢測表明硫酸鹽會導(dǎo)致硒代謝相關(guān)基因表達(dá)量的下降，這可能是加入硫酸鹽后造成菌株富硒能力下降的原因之一。此外，硒酸鹽或亞硒酸鹽在進入酵母細(xì)胞時主要是依賴硫的轉(zhuǎn)運途徑進行的［28］，硫酸鹽的加入可能會與亞硒酸鹽競爭相關(guān)的轉(zhuǎn)運途徑，從而使酵母細(xì)胞對硒的吸收量降低，從而導(dǎo)致總硒及硒納米顆粒含量降低。

總之，硫酸鹽雖然降低了酵母對硒的富集，但也提高了R.glutinis X-20在亞硒酸鈉環(huán)境中的生物量，因此，在實際生產(chǎn)中可通過額外添加硫酸鹽來提高富硒酵母的產(chǎn)量。此外，RT-qPCR結(jié)果為進一步提高R.glutinis X-20硒富集能力提供了新的思路，通過對CTH、metE、metB基因進行過表達(dá)等分子生物學(xué)手段提高其表達(dá)量進而加強R.glutinis X-20對硒元素的吸收。這對R.glutinis X-20富硒能力的進一步優(yōu)化具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：編輯郭蕓婕）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-31

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（22178226）；兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃項目（2017CB007）

作者簡介：郭錦堂（1996—），男，碩士研究生，專業(yè)方向為生物化工。

*通信作者：張根林（1981—），男，教授，從事微生物資源開發(fā)與利用方向的研究，e-mail：zhgl_food@sina.com。