忍冬愈傷組織形成過程轉(zhuǎn)錄組分析*

陳宏宇,楊 燁,于 瑩,黃 園,孫慶文,冉 飛

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

忍冬LonicerajaponicaThunb.是常用的藥用植物,其干燥花蕾或帶初開的花即金銀花,具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效。臨床上用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,金銀花具有抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化、保肝利膽、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)保護(hù)等功能[1-2]。

組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物資源保護(hù)、快速繁殖、遺傳改良和藥效物質(zhì)提取等方面有廣泛、深入的研究,可用于解決諸如品質(zhì)退化、種子病菌污染及農(nóng)藥殘留等問題[3-4]。高通量測序技術(shù)用于大規(guī)模分析基因表達(dá)并識別基因調(diào)控通路[5-6]。利用轉(zhuǎn)錄組測序中的數(shù)字表達(dá)譜技術(shù),對玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中3個典型階段樣本進(jìn)行了分析,識別了大量愈傷組織形成相關(guān)基因[7]。通過比較玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中4個時期樣本轉(zhuǎn)錄組,并識別microRNA,預(yù)測了靶基因與miRNA關(guān)系[8]。在小麥胚性愈傷組織形成的3個重要時期取樣,構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序和miRNA測序文庫,篩選了差異表達(dá)基因和差異表達(dá)miRNA[9]。

植物愈傷組織形成與很多類型的基因有關(guān)。利用分子生物學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)ARF10基因的互作蛋白HBI1能促進(jìn)愈傷組織起始及形成過程,并揭示其與WOX12、TIR1和AXR2等基因的調(diào)控關(guān)系[10]。利用基因工程驗證了基因改變植物再生和轉(zhuǎn)化效率[11]。這些研究為揭示植物組織培養(yǎng)技術(shù)中愈傷組織形成過程機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

忍冬分子生物學(xué)研究取得了較大進(jìn)展[12],但是忍冬愈傷組織形成過程的分子機(jī)制研究相對較少。本實驗對忍冬愈傷組織形成的3個時期分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并比較分析,識別愈傷組織形成相關(guān)重要基因,分析調(diào)控通路,為進(jìn)一步研究忍冬愈傷組織形成分子機(jī)制提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

忍冬6年樹苗購買于山東平邑,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)楊燁鑒定為忍冬(LonicerajaponicaThunb.),取新生莖作為外植體。外植體用75%乙醇消毒30 s,10%次氯酸鈉消毒15 min,無菌水沖洗3次,切成1 cm小段放入培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6BA+0.1 mg/L IAA),在恒溫光照培養(yǎng)箱(25 ℃,14 h光照/天)中培養(yǎng)。從出現(xiàn)愈傷組織開始,至第5天(5d)、第10天(10d)和第15天(15d),分別取愈傷組織(圖1),稱取相同的質(zhì)量,混樣后經(jīng)液氮冷凍提取總RNA。

圖1 忍冬愈傷組織

1.2 RNA提取與測序

利用Trizol提取RNA,去除DNA,檢查RNA質(zhì)量和純度后反轉(zhuǎn)錄,利用Illumina平臺進(jìn)行測序。原始測序數(shù)據(jù)利用軟件SOAPnuke[13]去除接頭序列(即接頭污染)、含N堿基大于5%以及低質(zhì)量讀序(reads)(即質(zhì)量值低于15的堿基占該reads總堿基數(shù)比例大于20%)。利用Trinity程序(v2.0.6)[14]從頭拼接組裝,聚類、拼接和去冗余處理后,得到非冗余單基因(unigene)序列。利用Nr(Non-Redundant Protein Database)、Nt、SwissProt、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)、Pfam和GO(Gene Ontology)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋。

1.3 基因表達(dá)與調(diào)控通路分析

利用RSEM程序(v1.2.8)[15]的FPKM(Fragment Per Kilo Bases per Million Reads)方法計算基因表達(dá)量。利用DESeq[16]計算差異基因,以2個樣本間基因表達(dá)差異log2FC大于2倍,且FDR≤0.001定義為顯著差異表達(dá)基因(DEG)。利用GO數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology)對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,Qvalue ≤0.05定義為顯著富集。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)對基因進(jìn)行調(diào)控通路注釋,推測基因的生物功能。

2 結(jié)果

2.1 測序與注釋

對忍冬3個樣本測序,去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后,分別獲得6.29Gb、6.40Gb和6.34Gb的clean data數(shù)據(jù),所有樣本Q20均大于97.98%,Q30均大于93.05%。從頭組裝后在3個組織共獲得83 120條長的、非冗余單基因(unigene),其中長度為200～300 bp的單基因數(shù)量最多,有14 639個(圖2)。在單基因中識別編碼區(qū),共得到47 263個CDS序列,長度分布在297～13 122 bp之間。利用Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG、Pfam和GO數(shù)據(jù)庫分別注釋了56 145、46 550、42 628、43 695、44 129、43 410和44 057條單基因,共58 668條單基因,其中7個數(shù)據(jù)庫均能注釋的基因有23 638個。

圖2 組裝基因長度分布

2.2 差異表達(dá)基因分析

由于發(fā)育程度不同,愈傷組織形成過程中3個階段樣本的基因表達(dá)預(yù)計有一定差異。經(jīng)過計算,與5d樣本相比,10d樣本共有差異表達(dá)基因7 026個,其中上調(diào)表達(dá)3 829個基因,下調(diào)表達(dá)3 197個基因。類似的,與5d樣本相比,15d樣本共有差異表達(dá)基因12 218個,其中上調(diào)表達(dá)4 726個基因,下調(diào)表達(dá)7 492個基因。結(jié)果說明,隨著忍冬愈傷組織的形成,基因表達(dá)模式發(fā)生較大變化,而且隨著發(fā)育時間的延長,下調(diào)基因的數(shù)量明顯較多。SERK、LEC2、WUS、AGL15和HBI1等基因與植物愈傷組織形成有關(guān),基因表達(dá)量變化見表1。

表1 忍冬愈傷組織形成相關(guān)基因的表達(dá)量

2.3 基因調(diào)控通路分析

利用GO聚類分析對顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類,研究具有相同代謝過程或細(xì)胞途徑的基因類群。結(jié)果表明,5d樣本和10d樣本之間差異表達(dá)基因有39個顯著富集功能聚類,分為3大類:生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function),分別有22、2和15個功能聚類。如生物過程中的生物調(diào)控有包括GTPase活性激活、生長素分解代謝過程、生長素內(nèi)穩(wěn)態(tài)、碳水化合物穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等差異表達(dá)基因614個。5d樣本和15d樣本之間差異表達(dá)基因有42個顯著富集功能聚類,3大類分別為23、2和17個。如分子功能中的催化活性有包括酯鍵水解酶活性、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、谷胱甘肽水解酶活性和核苷二磷酸酶活性等差異表達(dá)基因4427個。表2列舉了每個類別顯著富集程度最高的5個組。

表2 忍冬愈傷組織形成過程GO聚類分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析,推測參與生化代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的相互協(xié)調(diào)特征。結(jié)果表明,5d樣本和10d樣本之間差異表達(dá)基因歸屬通路分為5大類:細(xì)胞過程、環(huán)境信息過程、遺傳信息過程、代謝和生物系統(tǒng)分別有1、2、4、11和1個通路。如“轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝”“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”“折疊、分類和降解”“定位”“碳水化合物代謝”和“環(huán)境適應(yīng)”等通路富集程度較高。5d樣本和15d樣本之間差異表達(dá)基因與前者差異程度類似,基因總數(shù)更多。表3為顯著富集的KEGG通路。

表3 忍冬愈傷組織形成過程KEGG通路分析

3 討論

體細(xì)胞胚性愈傷組織的形成與發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、胚性潛力誘導(dǎo)和重組體細(xì)胞等,其過程可能涉及很多類型的基因表達(dá)或抑制。隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展,很多基因的結(jié)構(gòu)和功能逐漸被揭示出來。體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體激酶(Somatic embryogenesis receptor kinase,SERK),富含亮氨酸重復(fù)序列,是體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因。SERK基因最早在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn),在胚性愈傷組織感受態(tài)階段到胚性愈傷組織球形胚階段均有較高表達(dá),而在非胚性愈傷組織中表達(dá)量較低。擬南芥過表達(dá)SERK基因明顯提高了胚性愈傷組織的誘導(dǎo)能力。趙玲玲等人克隆了芒屬植物南獲的SERK基因,利用熒光定量PCR證明基因在胚性愈傷組織中的表達(dá)量更高,并且隨著愈傷組織的發(fā)育過程,其表達(dá)量先升高后下降[17]。本實驗利用轉(zhuǎn)錄組分析了忍冬愈傷組織形成過程的基因表達(dá)信息,3個樣本中共識別了4個可能的SERK基因,其中Unigene5295_All在3個樣本中表達(dá)量均較高,但在樣本之間差異較小(表1)。LEC基因(Leafy Cotyledon),包括LEC1和LEC2,最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥。研究表明,當(dāng)LEC基因發(fā)生突變時,擬南芥胚胎無法形成。本實驗識別了7個可能的LEC基因,但表達(dá)量均相對較低(表1)。WUS基因(WUSCHEL)也與植物愈傷組織形成有關(guān),研究表明WUS功能獲得性突變能促進(jìn)擬南芥體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞。本實驗識別了7個可能的WUS基因,Unigene1500_All和CL5416.Contig1_All表達(dá)量相對較高,CL5416.Contig2_All在愈傷組織形成第3個時期表達(dá)量下降(表1)。AGL15基因(AGAMOUS-LIKE15),最初是在擬南芥用于鑒定胚發(fā)育的表達(dá)基因,在胚發(fā)育中表達(dá)且蛋白積累達(dá)很高,發(fā)芽后表達(dá)降低。本實驗識別了5個可能的AGL15基因,但表達(dá)量均相對較低(表1)。HBI1基因(HOMOLOG OF BEE2 INTERACTING WITH IBH1)與愈傷組織起始有關(guān)。王龍等發(fā)現(xiàn)HBI1可以調(diào)控WOX12等基因,能促進(jìn)愈傷組織起始及形成過程[10]。本實驗識別了1個可能的HBI1基因,但表達(dá)量均相對較低,且在樣本之間差異較小(表1)。

基于高通量測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析在植物愈傷組織形成機(jī)制研究中有一定基礎(chǔ)。羅旭等對玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中3個典型階段樣本進(jìn)行了分析,與幼胚對照相比,分別識別了4 825、5 119和5 463個差異表達(dá)基因,根據(jù)KEGG分析,玉米愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因可能分別集中在脂肪酸生物合成、細(xì)胞色素代謝外源性物質(zhì)等途徑[7]。江舟等比較了玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中4個時期miRNA與靶基因,并按照調(diào)控關(guān)系建立了關(guān)聯(lián)。這個過程中,有78個miRNA可能參與調(diào)控,并預(yù)測213個靶基因中的14個基因可能參與愈傷組織形成調(diào)控[8]。楚宗麗等比較了小麥胚性愈傷組織形成的3個重要時期轉(zhuǎn)錄組,在3、6和15時間階段,識別了3 181、2 085和1 468個差異表達(dá)基因,同時也分別識別了30、33和18個差異表達(dá)miRNA[9]。本實驗利用忍冬愈傷組織形成的3個時期,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,計算獲取差異表達(dá)基因的數(shù)量和類別,推測差異基因的生物調(diào)控通路,為進(jìn)一步研究忍冬愈傷組織形成分子機(jī)制提供基礎(chǔ)和參考。