溶劑誘導(dǎo)萃取/UPLC-MS/MS法檢測農(nóng)田土壤中20種除草劑

瞿德業(yè)，王彩虹，陳 靜，朱夢晨，楊明月，夏 搏，柴文博，楊山泉

（1.西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省綠洲資源環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常需使用農(nóng)藥，根據(jù)防治對象的不同，農(nóng)藥可分為除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、脫葉劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等［1］。在所有類型的農(nóng)藥中，除草劑占世界產(chǎn)量的最大份額，并已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)踐的重要組成部分［2］。除草劑可以減少雜草生長、提升農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，因此我國每年在農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)中會使用大量的除草劑［3］。由于除草劑具有良好的水溶性和穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，大量和頻繁地使用會使其殘留在農(nóng)田土壤中。殘留除草劑通過食物鏈的生物積累和傳播進(jìn)一步擴(kuò)散［4］，對人體健康造成危害［5-7］。因此，除草劑殘留對土壤的污染不容忽視，建立一種高效的土壤中除草劑殘留檢測方法具有重要意義。

土壤中除草劑殘留檢測的難點(diǎn)在于復(fù)雜基質(zhì)的干擾，且待測目標(biāo)化合物的含量通常很低，因此，在處理前對樣品進(jìn)行有效的清洗成為準(zhǔn)確分析和檢測的條件，同時也能避免進(jìn)樣口、色譜柱及檢測器等污染［8-9］。目前，已被廣泛使用的除草劑樣品前處理技術(shù)有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、QuEChERS 方法、加速溶劑萃取等［10-12］。以上樣品前處理方法操作過程復(fù)雜，制約因素多，耗時久。本研究采用溶劑誘導(dǎo)萃取樣品前處理技術(shù)，該方法是在勻相的乙腈-水體系中添加一種疏水且與乙腈互溶的有機(jī)溶劑，從而誘導(dǎo)乙腈-水體系分層。溶劑誘導(dǎo)萃取最大的優(yōu)勢為經(jīng)誘導(dǎo)萃取劑誘導(dǎo)分離的乙腈層和水層能夠?qū)⑹杷院陀H水性物質(zhì)在線分離，從而實(shí)現(xiàn)樣品的凈化和濃縮，且有機(jī)相與反相液相色譜流動相兼容，可直接進(jìn)樣分析［13］。該前處理方法已被用于中藥成分和血漿中藥物的分析［14-15］，但很少用于土壤中除草劑殘留測定。本文擬建立一種優(yōu)化后的溶劑誘導(dǎo)萃取前處理方法，使之更適用于土壤樣品的處理，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對土壤中20種除草劑進(jìn)行多殘留檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）、Quattro Premier XE 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；BC-100 型多管渦旋混合儀（美國Scientific Industries）；3K30 型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；BSA 822 電子天平；移液槍（10～100 μL，100～1 000 μL，美國Thermo Electron公司）。

乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國默克公司）；甲酸銨、二氯甲烷、氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（純度＞98%，德國默克公司）；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（屈臣氏）；20種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液購于阿爾塔科技有限公司。樣品來自河南省開封市某農(nóng)業(yè)種植大棚基地的土壤，自然風(fēng)干后，去除雜草、植物根莖葉和碎石等雜物，用土壤研磨儀粉碎后，過60目篩網(wǎng)，待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理稱取上述處理好的土壤樣品10 g，加入5 mL乙腈、5 mL純凈水，渦旋8 min，充分混合均勻后，在6 ℃下以12 000 r/min 離心5 min；吸取上清液，并記錄上清液體積。加入1.5 mL 二氯甲烷至上清液中，渦旋8 min，靜置3 min，離心5 min。溶液產(chǎn)生分層現(xiàn)象，上層為乙腈層，下層為水層；記錄上下層體積，分別取1.0 mL過0.22 μm有機(jī)濾膜，裝入棕色進(jìn)樣小瓶，待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制20 種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈-水（體積比1∶1）定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/L的20種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏待用。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：取空白的土壤樣品，按照“1.2.1”方法進(jìn)行前處理。取農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白樣品溶液為溶劑，配制 0.1～100 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）；流動相A：0.1%甲酸水，B：乙腈；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.30 mL/min。流動相洗脫梯度：0～1 min，30% B；1～2 min，30%～40% B；2～5 min，40%～50% B；5～8 min，50%～30% B；8～8.5 min，30% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子方式掃描，毛細(xì)管電壓為3 500 V；霧化氣：2.76×105Pa；干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L/min。20 種除草劑的保留時間、定量定性離子對、碰撞能量及碎裂電壓見表1。

表1 20種除草劑的保留時間及MRM參數(shù)Table 1 Retention times and MRM parameters of 20 herbicides

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行處理，采用Origin 2022 繪制柱狀圖，采用Design Expert 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇常用的質(zhì)譜電離源有ESI和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）兩種，ESI電離源適用于多電荷、中高極性、分子量較大、熱不穩(wěn)定的物質(zhì)［16］，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ESI 電離源的靈敏度較高，故選擇ESI 電離源。采用正離子模式掃描，選擇峰強(qiáng)度較大的離子作為定性定量離子。對所選離子對的去簇電壓和碎裂電壓進(jìn)行優(yōu)化，并對電噴霧電壓、離子源溫度和駐留時間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如“1.3.2”所示。通過梯度洗脫可實(shí)現(xiàn)多種化合物的有效分離。離子色譜圖雖有重疊，但各峰的定量離子和定性離子不同，因此不影響定量分析［17］。20種除草劑的總離子流圖如圖1所示。

2.1.2 色譜柱的選擇選擇色譜柱對于分離樣品非常重要，通常不同填料的色譜柱對同一樣品有不同的保留時間［18］?？疾炝薃CQUITY UPLCTMBEH C18（1.0 mm×50 mm，1.7 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）2 種色譜柱的分離效果。其中，前者的填料為三官能鍵合BEH 顆粒，可適用的pH 范圍更寬（pH 1～12），低pH 穩(wěn)定性好，柱滲漏非常低，適用于高靈敏度MS 應(yīng)用；而后者可在高壓下操作（達(dá)到6.00×107Pa），且裝填的C18填料適用于高速反相HPLC，該柱對所有類型化合物分析均能得到高柱效和優(yōu)異峰形。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱能使20 種目標(biāo)物的峰形對稱，色譜響應(yīng)較高，所以選用該色譜柱進(jìn)行分離。

2.1.3 流動相的優(yōu)化考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈（0.01%甲酸水+2 mmol/L 甲酸銨）、0.1%甲酸水（含2 mmol/L甲酸銨）-乙腈（0.1%甲酸水+2 mmol/L甲酸銨）、0.1%甲酸水（含2 mmol/L甲酸銨）-乙腈（0.1%甲酸水）4 種流動相的分離效果，結(jié)果表明，以0.1%甲酸水-乙腈為流動相時，所有目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度最高，出峰時間最短。因此，選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

2.2 前處理單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化

2.2.1 提取劑體積的選擇為了驗(yàn)證不同體積的提取劑乙腈是否對目標(biāo)物回收率產(chǎn)生影響，將乙腈與水分別按照體積比2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2 移取10 mL，按照“1.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物主要集中在上層乙腈層，因此主要比較上層物質(zhì)的回收率。當(dāng)乙腈與水的比例為5∶5即乙腈體積為5 mL 時出峰效果最好，回收率較高。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 軟件采用單因素方差進(jìn)行差異性分析，結(jié)果表明不同體積的乙腈間存在顯著性差異。確定選擇乙腈體積為5 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 萃取劑的選擇萃取劑是決定萃取效率的重要因素，萃取劑的選擇必須考慮萃取劑的密度、揮發(fā)性、萃取目標(biāo)物的能力以及對后續(xù)色譜分離分析的影響［19］。大多數(shù)與乙腈互溶的疏水性溶劑均能作為萃取劑誘導(dǎo)乙腈-水體系分層［15］，因此本實(shí)驗(yàn)考察了二氯甲烷、乙酸乙酯、NaCl 以及二氯甲烷+NaCl 的萃取效果。在空白土壤中添加20 種除草劑混合標(biāo)樣，按照“1.2.1”處理，比較20 種除草劑的含量，并通過計算回收率確定20 種除草劑的轉(zhuǎn)移率。圖2 結(jié)果表明，選擇二氯甲烷為萃取劑進(jìn)行萃取時，目標(biāo)物的回收率最高，因此選擇二氯甲烷作為萃取劑。

圖2 不同萃取劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of different extractants on the recoveries of target compounds

2.2.3 萃取劑添加量的確定比較了二氯甲烷的添加量對目標(biāo)化合物回收率的影響。在其他條件一致的情況下，配制10 μg/L 空白加標(biāo)土壤樣品，分別添加1.0、1.2、1.5、1.8、2 mL 的二氯甲烷，按照“1.2.1”處理后上機(jī)測定。結(jié)果表明，二氯甲烷添加量為1.5 mL 時，20 種除草劑的回收率最高，因此選擇二氯甲烷添加量為1.5 mL。

2.2.4 渦旋時間的影響土壤和提取劑乙腈充分混合，會使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，因此渦旋至關(guān)重要?？疾炝藴u旋時間對20種除草劑回收率的影響，由圖3 可知，渦旋時間在5～8 min范圍內(nèi)目標(biāo)物的回收率呈上升趨勢，在8～10 min 范圍內(nèi)回收率呈下降趨勢，因此選擇渦旋時間為8 min。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 軟件采用單因素方差進(jìn)行差異性分析，結(jié)果表明不同渦旋時間存在顯著性差異。

圖3 渦旋時間對目標(biāo)物回收率的影響Fig.3 Effect of vortex time on the recoveries of target compounds

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果由“2.2”的結(jié)果可知，二氯甲烷體積為1.5 mL、提取劑乙腈體積為5 mL、渦旋時間為8 min 時目標(biāo)物的回收率較好。因此，通過極差對單因素水平進(jìn)行篩選，最終選擇二氯甲烷添加量、提取劑乙腈體積、渦旋時間為考察因素，通過響應(yīng)面法對3 個單因素進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

以二氯甲烷體積、乙腈體積、渦旋時間為因素，20種除草劑的回收率為響應(yīng)值（Y），經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：Y=97.94-9.87A+4.79B-2.76C-1.05AB+0.30AC+1.68BC-17.71A2-11.68B2-12.83C2。利用Design Expert 10 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)方差分析結(jié)果，該模型的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.993，說明模型的可信度高。該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），表明該二次模型能夠擬合實(shí)際結(jié)果，誤差較小。綜上，可以利用此回歸方程確定20 種除草劑的最佳萃取條件。A、B、A2、B2、C2對20種除草劑的回收率產(chǎn)生極顯著影響（p＜0.01），而AB、AC、BC對目標(biāo)物回收率的影響不顯著。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果各實(shí)驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。響應(yīng)面圖可較直觀地體現(xiàn)各因素交互作用對除草劑回收率的影響，曲線越陡峭，則表明該因素影響越大［20］。從表3 及圖4 可以看出，二氯甲烷體積對除草劑回收率的影響最大，乙腈體積、二氯甲烷體積、渦旋時間之間的交互作用對目標(biāo)物回收率的影響不大。根據(jù)軟件計算結(jié)果，預(yù)測20 種除草劑的最佳回收率為93.8%，乙腈體積為5.6 mL，二氯甲烷體積為1.4 mL，渦旋時間為7.5 min。將上述最優(yōu)萃取條件簡化為乙腈體積5 mL、二氯甲烷體積1.5 mL、渦旋時間8 min，進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到20 種除草劑的平均回收率為95.2%，測定結(jié)果穩(wěn)定，證明該結(jié)果合理可靠。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)樣品中內(nèi)源性組分和樣品前處理過程中引入的雜質(zhì)對目標(biāo)物檢測結(jié)果的影響稱為基質(zhì)效應(yīng)，它可能影響線性關(guān)系、檢出限等測定指標(biāo)［21］。通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評價基質(zhì)效應(yīng)（ME），該比值等于或接近1 時（在0.8～1.2 之間），表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；小于0.8 時，表明存在明顯基質(zhì)抑制作用；大于1.2 時，表明存在明顯基質(zhì)增強(qiáng)作用［22］。使用“1.2.2”配制的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了20種除草劑在土壤中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)前處理后，20種除草劑的ME值為0.89～1.07，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

2.4.2 線性方程與檢出限在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，用乙腈-水（1∶1）配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，20 種除草劑在對應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 0。以3倍信噪比計算目標(biāo)化合物的檢出限（LOD）為0.1～1.0 μg/kg，以10倍信噪比計算目標(biāo)化合物的定量下限（LOQ）為0.2～5.0 μg/kg，結(jié)果見表4。

表4 20種除草劑的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 4 Linear relations，detection limits and quantitation limits of 20 herbicides

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度選用空白土壤樣品，準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低（1 μg/kg）、中（10μg/kg）、高（50 μg/kg）水平的加標(biāo)樣品，按照優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行處理和測定，每個加標(biāo)水平重復(fù)測定5 次。表5 結(jié)果顯示，20 種除草劑的加標(biāo)回收率為77.6%～115%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.40%～3.8%，本方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

表5 加標(biāo)土壤樣品的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of spiked soil samples

2.5 與相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)比較

因本研究與NY/T 1616-2008［23］檢測的目標(biāo)物部分重合，比較發(fā)現(xiàn)，本方法前處理只需乙腈、二氯甲烷2 種試劑，而NY/T 1616-2008 方法需使用乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸、冰乙酸、氫氧化鈉6 種試劑；本方法前處理時間縮短，且檢出限（0.1～1.0 μg/kg）低于標(biāo)準(zhǔn)方法（0.6～3.8 μg/kg）。綜上，本方法所用試劑少，操作簡單，前處理時間短，檢出限低。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本方法對采集的245 份土壤樣品中的20 種除草劑進(jìn)行檢測（見表6），結(jié)果表明：上述實(shí)際樣品中有48 份樣品有檢出，共檢出9 種除草劑，其中莠去津的檢出含量較高，表明莠去津除草劑使用較廣，使用效率較高。與孟繁磊等［24］的研究相比，該采樣區(qū)土壤中莠去津的濃度較低，但當(dāng)?shù)鼐用耖L期食用受污染的蔬菜，對身體會造成一定危害。所以在農(nóng)業(yè)土壤的管理中對以上被檢出的9 種除草劑應(yīng)給予更多關(guān)注。

表6 土壤樣品中除草劑的檢測結(jié)果Table 6 Detection results of herbicide residues in soil samples

3 結(jié) 論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)的前處理?xiàng)l件：萃取劑為1.5 mL二氯甲烷、提取劑為5 mL乙腈、渦旋時間為8 min。在該條件下，20種除草劑的平均回收率為77.6%～115%，RSD 為0.40%～3.8%，檢出限為0.1～1.0 μg/kg，定量下限為0.2～5.0 μg/kg，均能滿足檢測要求。溶劑誘導(dǎo)萃取不僅能夠提高檢測通量，而且試劑用量少，能夠在線完成凈化和富集，操作簡單，有效降低了成本。本方法為其他除草劑或農(nóng)藥殘留的高通量檢測提供了新的思路。