凝膠過濾層析結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中游離甲狀腺激素

鄒海飛，李 敏，鄧順艷，夏 兵，周 燕*

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 101408）

三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）和甲狀腺素（Thyroxine，T4）是兩種主要的甲狀腺激素，其分泌量的增多或減少均可導(dǎo)致甲狀腺功能障礙，并可增加心血管疾?。?］、糖尿病并發(fā)癥［2］和妊娠并發(fā)癥［3］的發(fā)生風(fēng)險。正常情況下，T3、T4 分別約99.7%和99.97%與特異的血漿蛋白相結(jié)合，僅有0.3%和0.03%為游離狀態(tài)，簡稱為FT3和FT4［4］。而游離激素假說認(rèn)為，甲狀腺激素的游離形式才是其活性部分，與生物效應(yīng)密切相關(guān)［5］。FT3和FT4的測定不受血清結(jié)合蛋白的影響，是甲狀腺功能體外實(shí)驗(yàn)的靈敏指標(biāo)，可作為甲亢、甲減、甲狀腺腫、重癥感染發(fā)熱等疾病的輔助診斷［6］。

由于血清中FT3 和FT4 臨床檢測的重要性，50 多年來研究者們相繼開發(fā)了測定FT3 和FT4 的不同方法。但由于游離甲狀腺激素的濃度極低，F(xiàn)T3的血液濃度為1.4～6.0 pg/mL，F(xiàn)T4為8.0～20.0 pg/mL［7］。并且結(jié)合態(tài)與游離態(tài)之間的內(nèi)源性平衡易受到擾亂，使得其檢測結(jié)果的重復(fù)性、穩(wěn)定性較差。因此，臨床上準(zhǔn)確檢測游離甲狀腺激素仍然十分困難，極具挑戰(zhàn)性。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室通常通過免疫分析方法或物理分離方法檢測FT3 或FT4。通過免疫法間接測定的FT3、FT4 含量易因其動態(tài)平衡被破壞而有誤［8-9］。尤其是在妊娠期，由于其結(jié)合蛋白的顯著變化和嗜異性抗體的存在，使得免疫測定結(jié)果不準(zhǔn)確［10］。美國甲狀腺協(xié)會建議，在妊娠期測定FT4 的最佳檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法［11］。該法分析靈敏度高、特異性好［12-13］，已成為國外檢測人血清中FT3、FT4的金標(biāo)準(zhǔn)方法［14］。在結(jié)合態(tài)與游離態(tài)之間的內(nèi)源性平衡受干擾最小的情況下，從血清中分離出FT3 和FT4 是該方法前處理環(huán)節(jié)的關(guān)鍵［15］。經(jīng)過多年的發(fā)展與改進(jìn)，平衡透析和超濾已成為較為成熟和完善的物理分離技術(shù)，然而這兩種方法均因其自身的局限性，尚未推廣到大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室［15-16］。

凝膠過濾層析（GFC），利用分子篩作用和選擇性洗脫，可以實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的快速分離，加之凝膠載體的惰性高、吸附力弱，能夠減小對內(nèi)源性平衡的干擾。1979年，Romelli等［17］將凝膠過濾層析用于游離甲狀腺激素測定，證實(shí)了該方法不會顯著改變血清中的游離激素水平。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用GFC 技術(shù)，通過進(jìn)一步優(yōu)化，減少樣本量，簡化操作步驟，建立可靠的快速前處理方法，實(shí)現(xiàn)高通量樣本檢測，使其適用于臨床檢測實(shí)驗(yàn)室。在此基礎(chǔ)上，基于LC-MS/MS 技術(shù)建立高靈敏檢測方法，以實(shí)現(xiàn)臨床游離甲狀腺激素的高靈敏、穩(wěn)定、快速檢測，為甲狀腺激素臨床相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防、治療、預(yù)后和監(jiān)測等提供支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

LCMS-8050 CL 島津液相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司）；PCWJ-10超純水機(jī)（成都品成科技有限公司）；渦旋混勻儀（金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）；QB-8002 96孔板混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BT25S 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；BCY9602 96 孔正壓裝置、BCN9602 96 孔氮吹儀（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；FiveEasy Plus FE28 pH 計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；平衡透析裝置（北京匯智和源生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑與材料

甲醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（杭州娃哈哈公司）；氫氧化鈉（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鈉二水合物和三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水磷酸氫二鈉（分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；Proclin 300 抑菌劑、羥乙基淀粉和牛血清白蛋白（上海源葉科技有限公司）；表面活性劑Triton X-100（上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司）；納他霉素（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉（成都市科龍化工試劑廠）；Sephadex LH-20 96孔過濾板、96孔提取板、96孔收集板、96孔進(jìn)樣板（納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司）。

1.3 樣 品

T3 標(biāo)準(zhǔn)品（98%，批號：21A043-C3，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；T4 標(biāo)準(zhǔn)品（98%，批號：21A034-F6，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；T3 內(nèi)標(biāo)（T3-13C12，同位素豐度為99.3%，純度為94.2%，批號：PR-30090，青島騰龍微波科技有限公司）；T4 內(nèi)標(biāo)（T4-13C6，同位素豐度 ≥ 99%，純度 ≥ 98%，批號：22T021-T2，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）。血清樣品均來自淄博市中醫(yī)醫(yī)院的剩余樣本，樣本的收集及使用已取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取T3、T4 標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用5%氨水-甲醇溶解，并定容于10 mL 棕色容量瓶，分別配制得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的T3、T4 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用30%甲醇水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制得到質(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、50、100、150、200 pg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將內(nèi)標(biāo)儲備溶液用30%甲醇水稀釋，配制得到T3-13C12、T4-13C6質(zhì)量濃度均為200 pg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.5 質(zhì)控品的制備

準(zhǔn)確吸取50 μL Proclin 300、50 μL 0.1 mg/mL 納他霉素、50 μL Triton X-100，稱取0.9 g 氯化鈉、5.0 g 羥乙基淀粉、5.0 g 牛血清白蛋白，攪拌至完全在純水中溶解后，使用超純水稀釋至100 mL。使用0.45 μm 濾膜對稀釋后的溶液進(jìn)行過濾，收集濾液，得到空白基質(zhì)。將不同質(zhì)量濃度的T3、T4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白基質(zhì)中，配制得到低、中、高質(zhì)量濃度（分別為10、50、150 pg/mL）的質(zhì)控品。

1.6 樣品前處理

Sephadex LH-20 凝膠小柱預(yù)處理：依次使用2 mL 20%乙醇水、2 mL 超純水進(jìn)行活化，再用4 mL磷酸鹽緩沖液（PB，0.1 mol/L，pH 7.4）進(jìn)行平衡。取150 μL血清加載至經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20凝膠小柱，正壓裝置壓入填料內(nèi)，依次用4 mL Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）、150 μL甲醇進(jìn)行洗滌，以去除結(jié)合蛋白的甲狀腺激素，棄去洗滌液。然后用1.5 mL 甲醇對游離的甲狀腺激素進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，于室溫下氮?dú)獯蹈?，加?50 μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，振蕩混勻2 min，待分析。

1.7 分析條件

1.7.1 色譜條件Shim-pack Velox SP-C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.8 μm）；流動相：A 相為0.002%甲酸水溶液，B 相為甲醇；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；梯度洗脫：0～0.5 min，30% B；0.5～5 min，30%～98% B；5～7 min，98% B；7.01～9 min，98%～30% B。

1.7.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；數(shù)據(jù)掃描方式：正離子模式；測定方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；脫溶劑氣溫度：600 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；接口電壓：4.0 kV；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：5.0 L/min；加熱氣流速：15.0 L/min。各目標(biāo)物的保留時間、MRM 監(jiān)測離子對、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 各化合物的保留時間與MRM質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MRM mass spectrometry parameters of each compound

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化由于羧基和氨基的存在，甲狀腺激素可在正電離模式和負(fù)電離模式下檢測，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T3、T4在ESI正離子采集模式下的靈敏度更高。將T3、T4、T3-13C12、T4-13C6標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行Q1母離子掃描分析，掃描范圍為m/z100～1 000。分別調(diào)整脫溶劑氣溫度、接口電壓、加熱塊溫度、霧化氣流速、干燥氣流速、加熱氣流速等參數(shù)，使母離子響應(yīng)增強(qiáng)，噪音降低。經(jīng)過優(yōu)化，T3、T4、T3-13C12、T4-13C6產(chǎn)生的Q1 信號最高，以穩(wěn)定的［M+H］+為母離子，m/z分別為651.6、777.4、663.7、783.5。根據(jù)前體離子進(jìn)行產(chǎn)物離子的自動優(yōu)化，選擇離子豐度高、干擾小且穩(wěn)定的子離子作為定量離子，次強(qiáng)的作為定性離子。最佳的質(zhì)譜參數(shù)如“1.7.2”所示。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化考察了Waters XBridge Phenyl（2.1 mm×50 mm，5 μm）、Shim-pack GISS C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）、Shim-pack Velox SP-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）3 種色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，Shim-pack Velox SP-C18色譜柱對目標(biāo)化合物的信號響應(yīng)更高，峰形更好，因此選擇該色譜柱進(jìn)行樣品分離。分別考察了純水、甲酸水（0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002%）、氨水（0.1%、0.01%、0.002%）、0.002%乙酸水、0.1%甲酸+2 mmol/L 乙酸銨-水溶液作為流動相A，甲醇、乙腈、50%甲醇-乙腈、0.1%甲酸+2 mmol/L 乙酸銨-甲醇溶液作為流動相B時待測物的響應(yīng)強(qiáng)度，最終選擇0.002%甲酸水溶液和甲醇作為流動相。經(jīng)梯度優(yōu)化，使得樣品中T3 及其同分異構(gòu)體反三碘甲腺原氨酸（rT3）和T4具有良好的分離效果（見圖1）。

圖1 T3、rT3和T4的MRM色譜圖（A）與局部放大圖（B）Fig.1 MRM chromatograms of T3，rT3，T4（A） and local enlarged image of A（B）

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 尺寸排阻填料及填料量的優(yōu)化考察了羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20、葡聚糖凝膠Sephadex G-25、大孔樹脂TOYOPEARL HW-40F、硅膠微球BioCore SEC-150 的分離性能。將凝膠溶脹，濕法裝柱，SPE 凝膠小柱經(jīng)過活化、平衡、上樣、淋洗（1～8 管，用緩沖液洗去蛋白結(jié)合態(tài)）、洗脫（9～16管，用甲醇洗脫游離態(tài)），每管收集0.5 mL，分別進(jìn)行檢測，并將血清樣品與標(biāo)樣的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。以FT4為例，如圖2A 所示，根據(jù)結(jié)合態(tài)與游離態(tài)的分段情況，最終選用羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。

圖2 填料種類（A）和填料量（B）的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of filler type（A） and filler quantity（B）

進(jìn)一步考察了Sephadex LH-20填料量分別為5、10、15、20、30、40、60、100、150 mg時的分離效果。如圖2B 所示，當(dāng)填料量在5～40 mg 之間時，分離得到的FT3、FT4 趨于穩(wěn)定；而當(dāng)填料量大于40 mg 時，分離得到的FT3、FT4 明顯增多，說明部分與蛋白結(jié)合的T3、T4 發(fā)生了解離。因此，選用Sephadex LH-20填料量為15 mg，此時FT3、FT4的提取分離效果最好。

2.2.2 孵育時間及血清稀釋倍數(shù)的優(yōu)化為模擬體內(nèi)平衡過程，考察了在37 ℃下，孵育時間分別為0、0.5、1、1.5、2 h 的影響。結(jié)果顯示，隨著孵育時間的延長，分離得到的FT3、FT4 含量增多，因此選擇不孵育。進(jìn)一步考察了血清稀釋倍數(shù)分別為0、0.5、1、1.5、2 倍的影響，結(jié)果表明，隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，分離得到的FT3、FT4含量增多，因此選擇不稀釋。

2.2.3 淋洗液的優(yōu)化淋洗液主要用于洗去結(jié)合蛋白，一般用水或緩沖液?？疾炝薚ris-HCl 緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）、PB 緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）、0.9% NaCl 水溶液、超純水、PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）、HEPES 緩沖液（pH 7.4）的淋洗效果。圖3A 結(jié)果顯示，Tris-HCl 緩沖液、PB 緩沖液、0.9% NaCl 水溶液、HEPES 緩沖液的淋洗效果相近，考慮到溶液配制過程以及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，最終選用淋洗液為Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）。

圖3 淋洗液種類（A）和淋洗液體積（B）的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of eluent type（A） and volume（B）

考察了Tris-HCl 緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）體積分別為2、4、6、8 mL 時的淋洗效果。如圖3B 所示，當(dāng)填料量為15 mg，上樣量為150 μL 時，淋洗液體積達(dá)到4 mL 以上時提取效果較好，因此選擇淋洗液體積為4 mL。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量下限按“1.4”配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度從低到高依次進(jìn)行檢測，每個濃度水平測定3次。通過LabSolutions Ver.5.60軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)T3、FT4 分別在2～200 pg/mL、4～200 pg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.999 9、0.999 5。

將不同質(zhì)量濃度的T3、T4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白基質(zhì)中，配制得到質(zhì)量濃度分別為8、4、2、1 pg/mL 的樣品，按“1.6”方法前處理后進(jìn)行檢測。分別以信噪比S/N＞3 和S/N＞10 確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到FT3、FT4的檢出限分別為1、2 pg/mL，定量下限分別為2、4 pg/mL。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)（ME）一般通過比較目標(biāo)物在樣品基質(zhì)和空白溶劑中的信號響應(yīng)進(jìn)行評價。取6 個不同人體的血清樣品按“1.6”方法進(jìn)行提取后，分別添加低、中、高濃度（10、50、150 pg/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平平行制備3 份，將上述樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜測定。參照文獻(xiàn)方法［18］進(jìn)行計算，一般認(rèn)為ME 在85%～115%范圍時，沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)T3、FT4在低、中、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)為85.8%～114%，說明沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.3 回收率按“1.5”方法制備得到低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備3 份，按“1.6”方法前處理后上機(jī)檢測；同時將相同濃度的T3、T4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測。通過比較質(zhì)控樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定值，計算得到FT3和FT4的回收率分別為85.8%～103%和89.7%～107%。

2.3.4 準(zhǔn)確度與精密度按“1.5”方法配制低、中、高3 個濃度水平的質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備6 份，按“1.6”方法前處理后上機(jī)檢測，得到批內(nèi)準(zhǔn)確度及批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。通過3 個分析批連續(xù)三天進(jìn)行檢測，得到批間準(zhǔn)確度及批間RSD。結(jié)果顯示：FT3 和FT4 的批內(nèi)和批間RSD 分別為3.4%～10%和1.8%～8.8%，批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度分別為85.4%～110%和89.1%～102%。

2.4 方法對比

將建立的凝膠過濾層析法（GFC）與平衡透析法（ED）同時用于95 例血清樣本的檢測。按“1.6 ”方法和ED 方法（參照CLSI C45-A 指導(dǎo)文件［19］）分別對血樣進(jìn)行前處理，然后按“1.7”儀器條件進(jìn)行檢測。使用IBM SPSS Statistics 26 和MedCalc 統(tǒng)計軟件（v. 20.0.0）對檢測結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)分析、Passing-Bablok 回歸分析和Bland-Altman 一致性分析。如圖4 所示，本研究建立的GFC/LC-MS/MS 法與ED/LC-MS/MS法的測定結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），兩種方法之間存在較好的一致性。

圖4 凝膠過濾層析和平衡透析法測定結(jié)果的Passing-Bablok回歸分析（A、C）和Bland-Altman圖（B、D）Fig.4 Passing-Bablok regression analysis（A，C） and Bland-Altman diagram（B，D） of the determination results of gel filtration chromatography and equilibrium dialysis

3 結(jié) 論

本研究基于凝膠過濾層析進(jìn)行前處理，結(jié)合LC-MS/MS 分析，建立了血清中游離甲狀腺激素FT3和FT4的高通量、高靈敏檢測新方法。將該方法應(yīng)用于95例血清樣本的檢測，結(jié)果與平衡透析法存在較好的一致性。本方法快速（5 h）、簡便，受干擾因素相對較少，更便于臨床推廣。該方法可為臨床實(shí)驗(yàn)室游離甲狀腺激素的快速、高效、準(zhǔn)確檢測提供參考。