PLA2G4和ABCC1基因多態(tài)性與支氣管哮喘患兒孟魯司特療效的研究*

任夢洋，魏兵，李令雪，賈京晶，張世楠，尤瑄，支艷杰

（1.惠州市第一婦幼保健院，廣東 惠州 516007；2.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽 110016；3.中國醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽 110016；4.大連醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽 110016）

支氣管哮喘是與可逆性氣流阻塞且與支氣管高反應相關的慢性炎癥病變。全世界有3 億多人患有支氣管哮喘，被認為是兒童最常見的疾病之一，1990年全國城市14 歲以下兒童支氣管哮喘的累計患病率為1.09%，2000年為1.97%，2010年為3.02%，20 余年來我國兒童支氣管哮喘的患病率呈明顯上升趨勢[1-4]。支氣管哮喘的發(fā)病機制很復雜，多為基因和環(huán)境因素相互作用，現(xiàn)致病機制仍未明確，對該疾病的治療也以預防慢性癥狀、維持肺功能和允許正常的日?；顒訛橹?，使患兒達到“無癥狀”狀態(tài)[5]。孟魯司特是最常用的白三烯受體拮抗劑，是目前治療兒童支氣管哮喘的主要藥物之一。有研究證明孟魯司特可顯著降低氣道高反應性，改善氣道重塑，但孟魯司特療效有明顯的個體差異，其原因除患兒耐藥性差異外，還可能與患兒體內(nèi)白三烯（Leukotriene,LTs）調(diào)控及轉運基因的多態(tài)性有關[6-7]。LTs 是花生四烯酸的水解產(chǎn)物，磷脂酶A2是水解花生四烯酸的關鍵酶，ATP 結合盒亞家族C 成員1（ATP-binding cassette subfamily C member 1,ABCC1）基因編碼的多藥耐藥相關蛋白1 是內(nèi)源性物質(zhì)LTs 的轉運蛋白[8-9]。因此推測，調(diào)控和轉運LTs 的胞漿型磷脂酶A2（recombinant cytosolic phospholipase A2,PLA2G4）基因和ABCC1 基因是影響孟魯司特療效發(fā)揮的重要因素之一。本研究通過分析PLA2G4 基因和ABCC1 基因多態(tài)性與哮喘兒童孟魯司特療效的反應性，希望為支氣管哮喘患兒提供潛在的藥物遺傳學標記及用藥方案指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年3月—2021年9月于中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院診治的121 例支氣管哮喘患兒為研究對象。其中，男性80 例，女性41 例；年齡4～9 歲。所有入組兒童為東北地區(qū)漢族兒童。納入標準：①符合中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[4]的診斷標準；②1 個月內(nèi)未全身使用糖皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑；③能夠配合完成肺功能檢查和治療。排除標準：①既往有反復呼吸道感染史；②合并有心血管、肝、腎、內(nèi)分泌或造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病及精神??；③對本研究中的藥物過敏。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[倫審Y（2020）054 號]，所有患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法

根據(jù)疾病發(fā)作時的嚴重程度，依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[4]的治療方案，給予常規(guī)吸氧、霧化平喘、祛痰止咳、抗感染、糾正酸堿平衡等對癥治療。所有患兒睡前口服1次孟魯司特（順爾寧，杭州默沙東有限公司，國藥準字：J20140167），2～5 歲患兒服用劑量為4 mg，6～14 歲患兒服用劑量為5 mg，1 次/d，連續(xù)治療1 個月。

1.3 基因型檢測

抽取受試兒童外周靜脈血3 mL 于抗凝管中，置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫崛「鳂颖狙毎蚪MDNA 行PCR 擴增，應用Primer 3 軟件設計PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物純化后，采用ABI3730XL 測序儀對PLA2G4 基因rs10157410、rs10489409、rs932476 位點和ABCC1 基因rs215066 位點進行基因型檢測（上海天昊生物科技有限公司）。

表1 PLA2G4、ABCC1基因各位點的引物序列

1.4 觀察指標

1.4.1 肺功能檢查治療前及治療1 個月后應用肺功能儀（型號：MasterScreen，德國JAEGER 公司）對患兒進行肺通氣功能檢查，數(shù)據(jù)均用實測值占預計值百分比表示，納入指標包含：用力肺活量占預計值百分比（forced vital capacity in predicted,FVC%pred）、第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（forced expiratory volume in one second in predicted,FEV1%pred）、第1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in one second to forced vital capacity ratio,FEV1/FVC）、最大呼氣流量占預計值百分比（maximal expiratory flow in predicted,PEF%pred）、用力呼出50%肺活量時的瞬時流量占預計值百分比（forced expiratory flow at 50% of forced vital capacity in predicted,FEF50%pred）、FEF75%pred。

1.4.2 呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide,FeNO）檢查檢測儀器為一氧化氮分析儀（型號：NIOX VERO，英國CIRCASSIA 公司），操作參照《兒童肺功能及氣道非創(chuàng)傷性炎癥指標系列指南（七）：呼出氣體一氧化氮監(jiān)測》[10]。所有受試者需在檢測前4 h 內(nèi)禁食酒精類食物，2 h 內(nèi)禁食含硝酸鹽食物、禁食水、避免劇烈運動。測試過程中應保持吸氣及呼氣連續(xù)進行，不可屏氣或停頓。

1.4.3 實驗室指標分別抽取治療前和治療1 個月后患兒空腹靜脈血2 mL，采用血細胞分析儀（型號：LH780，德國COULTER 公司）檢測嗜酸性粒細胞計數(shù)（eosinophil count,EOS），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測患兒免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE）水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 療效評價

依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[4]對患兒近4 周的哮喘癥狀進行控制水平分級。評估項目：日間癥狀（＜6 歲，＞1 次/周；≥ 6 歲，＞2 次/周）；夜間因哮喘憋醒或咳嗽；應急緩解藥物使用（＜6 歲，＞1 次/周；≥ 6 歲，＞2 次/周）；因哮喘出現(xiàn)活動受限。良好控制：無上述各項；部分控制：存在1 或2 項；未控制：存在3 或4 項。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均值±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗的兩組比較用t檢驗、多組比較用單因素方差分析，符合正態(tài)分布但不符合方差齊性檢驗的兩組及多組比較用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；等級資料以等級表示，比較用Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗。采用Logistic 回歸對PLA2G4 基因與孟魯司特療效進行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PLA2G4、ABCC1 基因各位點不同基因型治療前后肺功能指標比較

如表2、3所示，PLA2G4 基因rs10157410、rs10489409 和rs932476 位點不同基因型間的肺功能指標治療前后比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PLA2G4 基因rs10157410 位點GC 和GG 基因型、rs10489409 位點CT 和TT 基因型和rs932476 位點GA 和 AA 基 因 型 的 FEV1%pred、FEV1/FVC、FEF50%pred、FEF75%pred 治療前后比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后較治療前均升高。此外，PLA2G4 基因rs932476 位點GG 基因型的FEV1/FVC 和FEF75%pred 治療前后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后較治療前升高。ABCC1 基因rs215066 位點只檢測出1 種基因型GG，故不再進行基因型間的肺功能指標分析。孟魯司特治療前后ABCC1 基因rs215066 位點GG 基因型的FEV1%pred、FEV1/FVC、FEF50%pred、FEF75%pred 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后較治療前均升高。

表2 PLA2G4基因各位點不同基因型治療前后肺功能指標比較 （±s）

表2 PLA2G4基因各位點不同基因型治療前后肺功能指標比較 （±s）

基因型n FVC%pred治療前t 值P 值FEV1%pred治療前P 值t 值P 值FEV1/FVC治療前治療后治療后rs10157410 GC 27 84.62±20.87 88.56±15.42治療后-0.799 0.431 75.73±24.36 90.59±13.39①t 值-2.470 0.020 77.72±9.74 87.04±7.60①-3.582 0.001 GG 94 88.93±15.55 90.26±11.86-0.7090.480 82.22±19.24 94.08±13.15①-5.1460.000 80.70±10.04 88.32±6.33①-6.0540.000 t/F/H 值0.696②-0.613 1.661②-1.211-1.366-0.883 P 值rs10489409 0.404 0.541 0.198 0.228 0.175 0.379 CC 8 89.10±17.39 93.58±13.97-0.560 0.593 80.28±27.33 95.95±14.53-1.226 0.260 79.87±12.46 87.22±7.65-1.197 0.270 CT 37 85.46±15.49 90.22±10.67-1.6870.100 78.99±20.41 93.20±11.73①-4.0800.000 80.66±8.86 87.47±6.29①-4.1540.000 TT 70 89.84±17.77 89.43±13.41 0.169 0.867 82.21±20.30 93.60±13.80①-3.847 0.000 79.61±10.69 88.84±6.77①-5.813 0.000 t/F/H 值0.808 0.399 0.294 0.143 0.127 0.625 P 值rs932476 0.448 0.672 0.746 0.867 0.881 0.537 GG 14 92.03±16.68 85.95±13.15 1.080 0.300 83.02±19.15 92.86±17.45-1.4720.165 78.04±13.05 90.44±6.35①-2.9840.011 GA 48 85.86±17.09 87.73±13.20-0.624 0.536 77.11±20.76 90.94±13.39①-3.706 0.001 79.00±9.00 88.12±6.51①-5.297 0.000 AA 59 88.72±16.80 92.57±11.77-1.5600.124 83.21±20.62 95.33±11.81①-3.9420.000 81.35±10.01 87.40±6.75①-3.8870.000 t/F/H 值0.836 2.770 1.266 1.485 1.043 1.204 P 值0.436 0.067 0.286 0.231 0.356 0.304

續(xù)表2

表2 PLA2G4基因各位點不同基因型治療前后肺功能指標比較 （±s）

注：①與治療前比較，P＜0.05；②為非參數(shù)檢驗H 值。

基因型n PEF%pred治療前t 值P 值t 值P 值t 值P 值治療后FEF50%pred治療前治療后FEF75%pred治療前治療后rs10157410 GC 27 61.95±22.87 67.16±16.78-0.878 0.388 53.43±27.25 73.80±20.10①-2.897 0.008 43.14±26.17 75.74±30.14①-3.839 0.001 GG 94 67.81±18.59 70.83±17.31-1.242 0.217 62.71±26.53 79.17±18.19①-5.050 0.000 55.61±29.59 80.58±26.37①-6.133 0.000 t/F/H 值-1.369-0.980-1.594-1.320-1.977-0.814 P 值rs10489409 0.174 0.329 0.114 0.189 0.050 0.417 CC 8 66.85±30.07 66.72±14.65 0.011 0.992 66.69±40.87 78.12±14.15-0.679 0.519 57.58±39.36 77.34±25.96-1.038 0.334 CT 37 64.56±18.97 72.34±17.43-1.803 0.080 59.55±23.90 78.22±18.16①-3.898 0.000 48.93±26.72 80.35±27.28①-4.818 0.000 TT 70 66.36±18.76 69.74±17.40-1.232 0.222 60.58±27.11 78.34±19.56①-4.524 0.000 55.00±30.05 81.07±27.43①-5.406 0.000 t/F/H 值0.113 0.468 0.228 0.001 0.596 0.069 P 值rs932476 0.894 0.628 0.797 0.999 0.553 0.934 GG 14 69.02±19.82 64.22±18.35 0.862 0.404 61.24±33.18 76.52±20.40-1.493 0.159 60.44±29.95 85.88±30.67①-2.545 0.024 GA 48 64.24±20.22 68.99±16.75-1.279 0.207 55.88±23.14 75.87±18.56①-4.522 0.000 47.61±29.17 75.60±26.04①-4.564 0.000 AA 59 67.74±19.35 72.24±17.16-1.329 0.189 64.37±27.90 80.02±18.48①-3.616 0.001 55.26±28.88 81.16±27.30①-4.952 0.000 t/F/H 值0.546 1.384 1.334 0.698 1.455 0.987 P 值0.581 0.255 0.267 0.500 0.238 0.376

表3 ABCC1基因rs215066位點治療前后肺功能指標比較 （n=121，±s）

表3 ABCC1基因rs215066位點治療前后肺功能指標比較 （n=121，±s）

組別FVC%pred FEV1%pred FEV1/FVC PEF%pred FEF50%pred FEF75%pred治療前治療后t 值P 值87.97±16.88 89.89±12.69-1.053 0.295 80.77±20.56 93.30±13.23-5.625 0.000 80.03±10.02 88.04±6.62-7.056 0.000 66.50±19.68 70.02±17.19-1.529 0.129 60.64±26.86 77.97±18.68-5.840 0.000 52.83±29.22 79.50±27.20-7.246 0.000

2.2 PLA2G4、ABCC1 基因各位點不同基因型治療前后炎癥指標比較

PLA2G4 基因rs10157410、rs10489409、rs932476位點不同基因型間的炎癥指標治療前后比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療前后PLA2G4 基因rs10489409 位點CC 基因型的EOS 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PLA2G4、ABCC1 基因各位點不同基因型的炎癥指標比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后較治療前改善。見表4。

表4 PLA2G4、ABCC1基因各位點不同基因型治療前后炎癥指標比較 （±s）

表4 PLA2G4、ABCC1基因各位點不同基因型治療前后炎癥指標比較 （±s）

注：①與治療前比較，P＜0.05；②非參數(shù)檢驗H 值。

基因型n EOS/%治療前t 值P 值IgE/（IU/mL）治療前t 值P 值t 值P 值治療后治療后FeNO/ppb治療前治療后PLA2G4 rs10157410 GC 27 5.43±4.21 1.52±1.63①4.9480.000 275.03±325.36 59.31±22.94①3.376 0.002 29.93±15.47 12.44±4.35①5.577 0.000 GG 94 5.55±6.06 1.95±1.91①5.593 0.000 292.48±578.42 58.91±19.88①3.904 0.000 34.22±17.20 13.23±4.51①11.535 0.000 t/F/H值-0.100-1.071-0.150 0.088-1.167-0.807 P 值PLA2G4 rs10489409 0.920 0.287 0.881 0.930 0.245 0.421 CC 8 4.51±3.50 1.55±0.82 2.155 0.068 214.41±147.71 59.04±16.88①3.016 0.020 38.13±21.25 10.25±5.06①3.541 0.009 CT 37 6.26±8.42 1.67±1.61①3.2520.002 224.91±211.23 60.38±22.44①4.682 0.000 32.32±12.82 12.78±4.49①8.397 0.000 TT 70 5.11±3.76 1.96±2.07①6.489 0.000 334.72±676.17 57.98±19.37①3.412 0.001 33.03±18.56 13.29±4.35①8.860 0.000 t/F/H值0.613 0.202②0.576 0.169 0.609②1.698 P 值PLA2G4 rs932476 0.543 0.904 0.564 0.845 0.737 0.188 GG 14 4.25±2.67 2.20±2.22①2.700 0.018 237.34±238.01 48.91±15.06①2.894 0.013 29.36±20.04 11.57±3.27①3.135 0.008 GA 48 5.02±4.02 2.19±2.13①4.6370.000 407.55±805.47 60.98±23.70①2.969 0.005 32.26±16.12 13.77±4.57①8.098 0.000 AA 59 6.24±7.14 1.50±1.45①4.964 0.000 203.96±161.15 59.79±18.30①6.798 0.000 35.00±16.73 12.83±4.59①9.664 0.000 t/F/H值1.006 2.495②0.081②1.996 0.771 1.471 P 值ABCC1 rs215066 0.369 0.287 0.960 0.140 0.465 0.234 GG 0.000 121 5.53±5.68 1.86±1.86①6.778 0.000 288.58±531.30 59.00±20.50①4.733 0.000 33.26±16.86 13.10±4.47①12.816

2.3 PLA2G4、ABCC1 基因各位點不同基因型的癥狀控制水平分級及Logistic回歸分析

PLA2G4 基因3 個位點的癥狀控制水平分級比較結果顯示，rs10157410 位點和rs932476 位點基因型間的癥狀控制水平分級比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中rs10157410 位點GC 基因型良好控制比例明顯高于GG 基因型，未控制顯著低于GG 基因型（P＜0.05）；rs932476 位點GA 和AA 基因型的良好控制比例與GG 基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ABCC1 基因rs215066 位點只檢測出1 種基因型，故未做基因型間的癥狀控制水平分級比較。見表5。

表5 PLA2G4、ABCC1基因各位點不同基因型的癥狀控制水平分級比較 例

表6 PLA2G4基因各位點不同基因型癥狀控制水平分級的Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

哮喘是兒童最為常見的慢性氣道炎癥性疾病，治療目標是有效控制哮喘癥狀，維持正常的活動水平。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)根治哮喘的治療方法，頻繁的發(fā)作和長期的藥物治療嚴重影響患兒的身心健康，給患兒家庭帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和精神壓力[11-12]。目前，在治療哮喘炎癥和緩解氣道痙攣方面的藥物選擇十分有限，部分藥物雖能夠有效控制癥狀，但療效的個體差異性大?；蚨鄳B(tài)性影響藥物靶分子或影響藥物代謝從而導致個體對哮喘治療的差異性，故探尋基因多態(tài)性與藥物療效之間的關系具有十分重要的意義。

LTs 是一種能夠引起支氣管收縮的炎性介質(zhì)，通過增強炎癥細胞反應、支氣管收縮力、黏液分泌和氣道重塑，從而介導哮喘的發(fā)生[13]。PLA2G4基因能夠編碼磷脂酶A2，水解膜磷脂，釋放花生四烯酸，在5-脂加氧酶氧化下生成LTs 等炎性介質(zhì)，參與氣道高反應性[14-15]。因此推測，PLA2G4基因可能與哮喘患兒的肺功能指標和炎癥指標密切相關。孟魯司特作為FDA 批準的LTRA，與白三烯競爭受體，從而阻斷白三烯與受體的結合，進而減輕炎癥反應和氣道高反應性[16]。孟魯司特具有良好的依從性和有效性，在哮喘的治療中廣泛應用，但受到個體差異的影響，療效不盡相同。故本研究探討了哮喘患兒PLA2G4 基因rs10157410、rs10489409 和rs932476 位點突變對肺功能指標、炎癥指標及癥狀控制水平的影響。結果顯示與治療前相比，rs10157410位點GC、GG基因型的FEV1%pred、FEV1/FVC、FEF50%pred、FEF75%pred 肺功能指標及EOS%、IgE、FeNO 炎癥指標均有顯著改善，提示孟魯司特能有效緩解GC、GG 基因型哮喘患兒的氣道阻塞和氣道炎癥，但在控制水平分級方面GC基因型良好控制比例明顯高于GG 基因型，未控制顯著低于GG 基因型，且Logistic 回歸分析提示GC基因型是患兒孟魯司特治療良好控制的獨立影響因素，故認為GC 基因型對孟魯司特具有更好的反應性?？紤]可能與該基因位點編碼的磷脂酶A2 介導下產(chǎn)生的白三烯與受體的結合受到了抑制，從而緩解了支氣管收縮和氣道炎癥相關。TREMBLAY等[17]研究了長鏈n-3 脂肪酸和PLA2G4 基因rs10157410 位點的交互作用，發(fā)現(xiàn)補充長鏈n-3 脂肪酸可導致花生四烯酸減少，從而影響LTs 等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，與本研究結果一致，國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)該位點與哮喘的相關研究。JONG 等[18]通過全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)PLA2G4 基因rs932476 位點能夠激活p38MAPK 通路進而影響肺功能。此外，郭青等[14]研究表明孟魯司特對該位點AA 型患兒炎癥反應的控制及肺功能的改善均優(yōu)于GG 型，提示該位點多態(tài)性可能對孟魯司特的療效有一定的影響。本研究結果證實rs932476位點GA、AA基因型的FEV1%pred、FEV1/FVC、FEF50%pred、FEF75%pred 肺功能指標及EOS%、IgE、FeNO 炎癥指標相比治療前改善明顯，GA 和AA 基因型良好控制比例顯著高于GG 基因型，Logistic 回歸分析提示AA 基因型是患兒孟魯司特治療良好控制的獨立影響因素，綜上說明rs932476 位點AA 基因型對孟魯司特療效更加顯著。

ABCC1 基因編碼的MRP1 利用ATP 水解的能量實現(xiàn)底物在細胞內(nèi)外的跨膜轉運，在LTs 轉運中具有重要作用，因此推測ABCC1 基因可能與孟魯司特療效相關。目前國外關于該基因與孟魯司特療效關系的研究較少，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)ABCC1 基因與兒童哮喘的相關研究。在一項由577 例美國哮喘患者參加的關于孟魯司特療效相關基因的SNPs 與5-脂加氧酶抑制劑關系的研究中檢測出ABCC1 基因rs215066 位點有GG、GA 和AA 3 種基因型[19]。本研究受試兒童中只檢測出一種GG 基因型，基因型分布與國外分布不同，考慮與樣本量較少和人種差異相關。國外研究表明哮喘患者經(jīng)孟魯司特治療后，ABCC1 基因rs215066 位點的FEV1%pred 指標較治療前顯著升高[20]。本研究表明治療后ABCC1 基因rs215066 位點GG 基因型的FEV1%pred、FEV1/FVC、FEF50%pred、FEF75%pred 肺功能指標和炎癥指標均顯著改善，提示孟魯司特對GG 基因型炎癥反應的控制及肺功能改善有一定作用。

綜上所述，PLA2G4 基因及ABCC1 基因多態(tài)性與孟魯司特療效有關。其中，PLA2G4 基因rs10157410 位點GC 基因型和rs932476 位點AA 基因型對孟魯司特療效具有更好的敏感性，為基因檢測指導下的個體化治療提供參考依據(jù)。本研究存在樣本量不足及人種、地域單一的問題，未來仍需要大規(guī)模、多中心的聯(lián)合研究。