骨化三醇通過(guò)B細(xì)胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路抑制大鼠高原肺水腫的發(fā)生*

戴重陽(yáng) 林 雪 王雅軒 呂中奎 朱夢(mèng)婷 鄧章昌 蒲小燕

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，西寧 810016）

高原肺水腫（high altitude pulmonary edema）是由于急性暴露于高海拔缺氧環(huán)境而導(dǎo)致肺部液體積聚的一種高原疾病，通常在海拔上升到2 500～3 000米以上的2～4 d內(nèi)發(fā)生。高原肺水腫可導(dǎo)致呼吸困難、運(yùn)動(dòng)不耐受、疲勞、咳嗽和發(fā)紺，如果不及時(shí)治療，可能會(huì)危及生命[1-2]。目前對(duì)高原肺水腫的治療包括乙酰唑胺、紅景天等抗高原反應(yīng)藥物，但其治療仍然有很大的局限性[3]。針對(duì)高原肺水腫的防治藥物亟待開(kāi)發(fā)。骨化三醇即1，25二羥基維生素D3[1，25-（OH）2-D3]能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，通過(guò)調(diào)節(jié)氣道平滑肌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使氣道重塑和炎癥反應(yīng)減輕[4]。此外，筆者前期測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)骨化三醇改善高原肺水腫與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路相關(guān)[5]。研究表明，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路的下游通路是B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）信號(hào)通路。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）是BCR信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)因子，可導(dǎo)致早期基因的表達(dá)，并進(jìn)一步激活參與B細(xì)胞增殖、分化及其他過(guò)程的其他基因表達(dá)[6]。因此，筆者推測(cè)骨化三醇改善高原肺水腫可能與B細(xì)胞受體/PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關(guān)。本研究旨在探討骨化三醇對(duì)高原肺水腫發(fā)生的抑制作用及機(jī)制，為骨化三醇防治高原肺水腫提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。大鼠飼養(yǎng)于青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件為溫度 25℃±2℃，濕度50%～60%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、清理消毒鼠籠。本研究經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照還原、細(xì)化、替代的3R原則進(jìn)行。

1.2 主要試劑

骨化三醇軟膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20143142）購(gòu)自正大制藥（青島）有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；B細(xì)胞活化因子（B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（interleukin 4，IL-4）、白介素-10（interleukin 10，IL-10）ELISA試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；一抗CD21購(gòu)自英國(guó)Abcam；一抗人核因子κB抑制蛋白α（NF-kappa-B inhibitor α，IkBα）購(gòu)自北京博奧森；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、FITC-Tyramide購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；PI3K兔克隆抗體、AKT兔克隆抗體、p-AKT兔克隆抗體、IkBα兔克隆抗體、p-IkBα兔克隆抗體購(gòu)自武漢Abclonal；p-PI3K兔克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam。

1.3 高原肺水腫大鼠模型構(gòu)建及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)將大鼠分為常氧組、低氧組、低氧+骨化三醇組，每組10只。常氧組和低氧組灌胃等體積生理鹽水；低氧+骨化三醇組灌胃骨化三醇（骨化三醇軟膠囊以體積比60∶10∶30溶解于丙二醇、乙醇和水的混合溶劑中，最終配置成濃度為0.252 μg/kg的骨化三醇溶劑），各組均每日灌胃1次，連續(xù)5 d。第6天常氧組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，低氧組、低氧+骨化三醇組大鼠置于模擬海拔6 000 m低氧環(huán)境的低壓氧艙內(nèi)（大鼠進(jìn)艙后以10 m/s速度減壓上升，10 min達(dá)到海拔6 000 m，氧含量9.8%），之后維持氧含量在9.7%～9.9%之間，艙內(nèi)大氣壓維持在46.57～49.02 kPa范圍內(nèi)，濕度維持在49%～55%之間。室內(nèi)溫度由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，白天保持在22℃～24℃，夜晚保持在16℃～18℃飼養(yǎng)48 h。飼養(yǎng)結(jié)束后，將低壓氧艙內(nèi)的海拔降至3 500 m，并在實(shí)驗(yàn)艙進(jìn)行大鼠樣本取材。

1.4 樣本采集

低氧組大鼠低氧脅迫48 h后，以斷頸法迅速處死大鼠，摘取完整肺組織，左肺上葉用于測(cè)定肺含水量，左肺下葉-80℃保存，右肺組織采用10%中性甲醛溶液固定；常氧組同一時(shí)間按上述方法在常氧條件下取材，并進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.5 肺含水量測(cè)定

采用干濕比重法測(cè)定肺含水量，左肺上葉稱(chēng)重后放入55℃烘箱中，直至干重的稱(chēng)重誤差在0.000 2 g以?xún)?nèi)。肺含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 H-E染色觀察肺組織病理變化

取經(jīng)10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋制作病理切片（5 μm），H-E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變情況。根據(jù)肺組織炎癥判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炎癥評(píng)分[7]：0分為無(wú)炎癥反應(yīng)；1分為輕度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內(nèi)有炎癥細(xì)胞灶；2分為中度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內(nèi)有片狀炎癥或局限性炎癥，面積＜1/ 3；3分為重度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內(nèi)有彌漫性炎癥細(xì)胞，面積在1/3～2/3之間。

1.7 TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡

取經(jīng)10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，切片（5 μm），檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，熒光TUNEL孵育液37℃孵育，DAPI襯染，甘油明膠封片。采用Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行掃描采集圖像，再根據(jù)組織大小采集3個(gè)區(qū)域9張圖像，進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析。

1.8 免疫熒光染色觀察肺組織CD21和IκBα的表達(dá)

取經(jīng)10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，切片（5 μm），將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉液封閉，滴加一抗CD21（1∶100）4℃過(guò)夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗（1∶100）室溫孵育30 min，加入FITC-Tyramide（1∶500）室溫孵育10 min；將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，滴加一抗IκBα（1∶100）4℃過(guò)夜，滴加熒光二抗（1∶100）室溫孵育30 min，滴加DAPI室溫孵育10 min，使用抗熒光衰減封片劑封片。顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，采用Image-J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定所采集全部圖像的熒光強(qiáng)度。

1.9 ELISA檢測(cè)肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10含量

取-80℃保存的肺組織，勻漿，10 000 r/min離心10 min后取上清液，采用ELISA試劑盒步驟檢測(cè)肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10含量。

1.10 免疫印跡檢測(cè)肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα表達(dá)

取-80℃保存的肺組織，從樣本中提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDA-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺二氟（PVDF）膜上。將膜在室溫下用5%的脫脂牛奶阻斷2 h，用一抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα（1∶2 000）或β-actin（1∶50 000）孵育膜在4℃下?lián)u晃過(guò)夜。第2天用生物素化山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影，檢測(cè)所有條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨化三醇對(duì)高原肺水腫大鼠肺質(zhì)量、肺含水量的影響

與常氧組比較，低氧組肺組織濕重、干重及含水量均明顯升高（P＜0.05）；與低氧組比較，低氧+骨化三醇組肺組織濕重、干重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但肺組織含水量明顯降低（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠肺質(zhì)量、肺含水量變化（n=10，±s）

表1 各組大鼠肺質(zhì)量、肺含水量變化（n=10，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs常氧組；△△P＜0.01 vs低氧組

組別肺組織濕重（g）肺組織干重（g）肺組織含水量（%）常氧組0.16±0.020.12±0.0274.18±0.91低氧組0.21±0.03*0.16±0.03**77.82±0.95**低氧+骨化三醇組0.19±0.030.14±0.0274.73±0.66△△

2.2 骨化三醇對(duì)高原肺水腫大鼠肺組織病理變化的影響

常氧組大鼠肺組織表面被覆漿膜，未見(jiàn)明顯水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維結(jié)締組織增生。低氧組大鼠肺組織見(jiàn)輕微肺泡隔增寬，細(xì)胞成分增多，可見(jiàn)少量肺泡上皮細(xì)胞增生，間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及少量纖維組織增生，肺泡腔輕度擴(kuò)張，可見(jiàn)肺泡間隔變窄，細(xì)胞成分減少，肺泡上皮細(xì)胞水腫。低氧+骨化三醇組大鼠肺組織少量肺泡上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞質(zhì)淡染，細(xì)胞體積增大，且少量肺泡上皮細(xì)胞脫落于肺泡腔內(nèi)，間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A～1C，見(jiàn)封二）。與常氧組比較，低氧組肺組織炎癥評(píng)分及細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；與低氧組比較，低氧+骨化三醇組肺組織炎癥評(píng)分及細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）（圖2A～2C，圖4A、4B）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化，H-E染色，A1～C1：×100，標(biāo)尺=200 μm；A2～C3：×400，標(biāo)尺=50 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組.

圖2 各組大鼠肺組織TUNEL染色，×400，標(biāo)尺=20 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組。A1～C1：Merged；A2～C2：DAPI；A3～C3：TUNEL.

圖3 各組大鼠肺組織CD21和IκBα免疫熒光染色，×400，標(biāo)尺=20 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組。A1～C1：Merged；A2～C2：DAPI；A3～C3：CD21；A4～C4：IκBα.

圖4 各組大鼠肺組織病理炎癥評(píng)分（A）、細(xì)胞凋亡率（B）、CD21熒光強(qiáng)度（C）及IκBα熒光強(qiáng)度（D）比較

2.3 骨化三醇對(duì)高原肺水腫大鼠肺組織B細(xì)胞活化及炎癥細(xì)胞因子的影響

與常氧組相比，低氧組大鼠肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明顯升高，IL-4、IL-10含量明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組大鼠肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明顯降低，IL-4、IL-10含量明顯升高（P＜0.01）（圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織B細(xì)胞活化因子及炎癥細(xì)胞因子含量變化

2.4 骨化三醇對(duì)高原肺水腫大鼠組織PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的影響

免疫熒光共染結(jié)果顯示，CD21蛋白表達(dá)呈現(xiàn)綠色，IκBα蛋白表達(dá)呈現(xiàn)紅色，均定位于細(xì)胞核。與常氧組相比，低氧組CD21熒光強(qiáng)度明顯升高，IκBα熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組CD21熒光強(qiáng)度明顯降低，IκBα熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.05）（圖3，圖4C、4D）。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高，p-IκBα蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低，p-IκBα蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；而各組間PI3K、AKT、IκBα蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠肺組織PIK3/AKT/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子變化

3 討論

高原肺水腫的發(fā)生與缺氧及炎癥有關(guān)[8]。研究表明，暴露在高海拔地區(qū)的受試者血清中IL-6的水平增加，在暴露的第2天達(dá)到峰值[9]。對(duì)暴露于低氣壓缺氧條件72 h大鼠的研究顯示，其血清中IL-1β的水平增加[10]。此外，大鼠在急性低氣壓下（3 h、7 620 m）肺部促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平增加[11]。研究顯示高海拔或低氣壓缺氧可影響免疫平衡機(jī)制，可能導(dǎo)致與缺氧狀況相關(guān)的疾病發(fā)生，TNF-α、IL-6、IL-10等促炎細(xì)胞因子在早期高原肺水腫中發(fā)揮作用，并可能與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)[12]。一項(xiàng)研究表明，高原肺水腫大鼠在接受高壓氧療法后，表現(xiàn)出增加組織氧合、改變中性粒細(xì)胞功能和損害細(xì)菌復(fù)制等有益影響，并能特異性地抑制TNF-α和低氧誘導(dǎo)因子-1，從而有利于抗氧化及抗水腫作用[13]。同時(shí)，肺組織病理?yè)p傷、細(xì)胞凋亡率及肺含水量是評(píng)價(jià)肺水腫嚴(yán)重程度的指標(biāo)[14]。本研究首先測(cè)定了骨化三醇對(duì)高原肺水腫大鼠肺組織含水量及病理變化的影響，結(jié)果顯示骨化三醇減輕肺組織損傷，肺組織呈現(xiàn)少量肺泡上皮細(xì)胞水腫及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺含水量明顯降低，表明骨化三醇可以緩解高原肺水腫造成的肺組織損傷。同時(shí)，骨化三醇抑制了肺組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ含量及肺組織細(xì)胞凋亡，增高了IL-4、IL-10含量，這一結(jié)果表明，骨化三醇減輕了高原肺水腫大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，該結(jié)果與大多數(shù)高原肺水腫相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床研究相一致[15-16]。

研究顯示B細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的重要組成部分，其產(chǎn)生和分泌數(shù)百萬(wàn)種不同的抗體分子，每一種都能識(shí)別不同的外來(lái)抗原[17]。BCR是一種由2對(duì)膜結(jié)合的免疫球蛋白重鏈和輕鏈組成的細(xì)胞表面受體，由CD79A（Ig-α）和CD79B（Ig-β）組成的異二聚體與BCR形成復(fù)合物，并在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起至關(guān)重要的作用[18]。BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)集中參與了正常和惡性B細(xì)胞的激活、生存和增殖，在抗原刺激下，蛋白酪氨酸激酶（PTKs）-SRC家族激酶LYN、SYK及TEC家族激酶BTK被激活[19]。此外，被激活的SYK會(huì)使B細(xì)胞核心受體CD19和PI3K磷酸化，這種信號(hào)最終直接導(dǎo)致早期基因的表達(dá)，進(jìn)一步激活參與B細(xì)胞增殖、分化以及其他過(guò)程的其他基因的表達(dá)[20]。此外，缺氧可通過(guò)刺激NF-κB基因轉(zhuǎn)錄和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而B(niǎo)CR可以介導(dǎo)NF-κB途徑的下游激活[21]。筆者前期測(cè)序研究顯示骨化三醇改善高原肺水腫與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路相關(guān)，而B(niǎo)CR信號(hào)通路是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路的下游通路[5]。先前的研究表明，在急性高原肺水腫大鼠中PI3K/AKT途徑被激活，而山柰酚可能通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路預(yù)防低壓低氧誘導(dǎo)的急性高原肺水腫的發(fā)生[22]。本研究結(jié)果顯示，低氧組BAFF含量、CD21熒光強(qiáng)度、p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高，p-IκBα蛋白表達(dá)明顯降低，提示低壓低氧誘導(dǎo)B細(xì)胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路激活。經(jīng)骨化三醇干預(yù)后，BAFF含量、CD21熒光強(qiáng)度、p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低，表明骨化三醇可以抑制B細(xì)胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路。因此，骨化三醇可能通過(guò)抑制B細(xì)胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路進(jìn)而緩解高原肺水腫。

綜上所述，骨化三醇通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)可預(yù)防高原肺水腫的發(fā)生，這種保護(hù)作用機(jī)制可能與其抑制B細(xì)胞受體/PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這為后續(xù)將骨化三醇開(kāi)發(fā)成為防治高原肺水腫的藥物奠定了理論基礎(chǔ)。