智三針療法對PSCI大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

翁瑜君 陳志寧 梁偉海 余永森 林國偉 唐梁 劉曉俊

廣州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510180

腦卒中后認(rèn)知功能障礙（PSCI）屬于血管性認(rèn)知功能障礙范疇［1］。根據(jù)2020 年《中國卒中報告》，中國卒中患病率為1 114.8/10萬，病死率為149.49/10萬［2］。大型國際隊列研究在近期的報道則顯示，發(fā)生卒中后的幸存者在10 年內(nèi)PSCI 患病率高達(dá)61%［3］，而且卒中患者中，伴有認(rèn)知功能障礙者，其病死率明顯升高。因自理能力減退，PSCI患者生存質(zhì)量也隨之下降，家庭及社會也面臨較大負(fù)擔(dān)。PSCI 病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，根據(jù)我國現(xiàn)有的醫(yī)療資源，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療該病，重點在控制危險因素和改善認(rèn)知兩方面，以藥物治療為主［3-8］，但認(rèn)知功能改善方面療效不甚理想。因此，積極尋求有效療法，使該疾病得到有效救治，具有較大意義。中醫(yī)理論認(rèn)為，PSCI 病因病機(jī)為髓海不足，腦失所用。我國知名針灸學(xué)家靳瑞創(chuàng)建嶺南代表性“靳三針療法”，其中“智三針”具有補髓充腦、開竅益智的作用，該療法取穴少、易于操作、治療費用低，主要用于治療各種類型的認(rèn)知障礙。同時通過文獻(xiàn)研究，智三針對PSCI 的相關(guān)研究報道較少［15-21］。因此，本實驗運用智三針療法治療PSCI大鼠，通過Morris 水迷宮實驗，觀察經(jīng)智三針療法干預(yù)后，各組大鼠逃避潛伏期及游泳距離的變化，評價3 組大鼠在干預(yù)前及干預(yù)后的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。分析智三針療法對改善PSCI 大鼠學(xué)習(xí)能力及記憶能力的療效，為智三針療法的臨床應(yīng)用提供實驗參考。

材料與方法

1.材料

1.1.實驗動物 2022 年8 月2 日至10 月3 日進(jìn)行動物實驗研究。本實驗動物由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司科研部動物實驗中心提供。用SPF 級體質(zhì)量（305.19±12.44）g的SD 雄性大鼠45 只，所有大鼠均在濕度30%～50%，溫度21～23 ℃，模擬日夜系統(tǒng)的溫室下自由飲食飼養(yǎng)3 周。大鼠攝食穩(wěn)定，體質(zhì)量穩(wěn)步增加。

1.2.實驗針灸器具 本實驗智三針療法采用東邦牌毫針，型號為0.3 mm×25.0 mm，從江蘇東邦醫(yī)療器械有限公司采購。

1.3.儀器 大鼠腦立體定位儀（北京銘泰佳信科技有限公司）；Morris水迷宮設(shè)備（江蘇賽昂斯科技有限公司）。

2.方法

2.1.分組及PSCI 大鼠模型的制備 實驗大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 周后，隨機(jī)分為3 組，假手術(shù)組、PSCI 大鼠對照組、智三針療法組，各15只。在造模前6 d均行Morris水迷宮實驗評定各組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。⑴PSCI大鼠對照組及智三針療法組：使用大腦中動脈栓塞（MCAO）［9-10］法制備PSCI大鼠模型，并于術(shù)后第3 天用Morris 水迷宮實驗檢驗PSCI 大鼠模型。⑵假手術(shù)組：將大鼠麻醉，切開手術(shù)部位皮膚后，立即縫合，不進(jìn)行MCAO 步驟。⑶造模方法：采用MCAO 法造模。大鼠造模前禁食12 h，禁水4 h，0.5 %戊巴比妥鈉麻醉，頸部備毛、消毒，做正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎相關(guān)動脈，用線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈的方式制造腦缺血及缺血再灌注狀態(tài)。完成操作后，縫合頸部傷口，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。⑷造模成功標(biāo)準(zhǔn)：與假手術(shù)組對比，PSCI 大鼠對照組及智三針療法組大鼠逃避潛伏期明顯延長，游泳距離明顯增長。

2.2.針灸干預(yù) 在采用MCAO 法造模術(shù)后第3 天，應(yīng)用Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力，并在Morris 水迷宮實驗結(jié)束后第1 天，分別對各組大鼠進(jìn)行干預(yù)。智三針療法的穴位由神庭穴及兩側(cè)本神穴組成。參照《實驗針灸學(xué)》［11］大鼠腧穴定位，神庭穴：在大鼠兩眼連線中點頭正中線上2 mm凹陷處；本神穴：在神庭穴與耳根連線的內(nèi)1/3 處。采用規(guī)格0.3 mm×25.0 mm 的毫針在穴位平刺進(jìn)針8 mm，用捻轉(zhuǎn)手法，以90°捻轉(zhuǎn)刺激，捻轉(zhuǎn)速度60 次/min。持續(xù)刺激2 min 后，休息3 min，如此反復(fù)，總共操作15 min，1 次/d，共持續(xù)21 d。PSCI 大鼠對照組及假手術(shù)組：給予智三針療法組大鼠同樣的抓取、固定、取穴、消毒操作，但是不進(jìn)行針刺治療。

2.3.Morris水迷宮實驗步驟 本實驗在造模前6 d、造模后3 d 及針灸干預(yù)結(jié)束后1 d 進(jìn)行Morris 水迷宮實驗［12-13］。⑴定位航行實驗。實驗前1 d，先將大鼠放入水迷宮裝置中適應(yīng)性游泳，然后分別在裝置的4 個象限對大鼠進(jìn)行入水及尋找平臺訓(xùn)練，每天每只大鼠訓(xùn)練4次，共持續(xù)4 d。記錄大鼠在1 min內(nèi)尋找到并登上平臺的時間即為逃避潛伏期。⑵空間探索實驗。在定位航行實驗結(jié)束后第2 天，撤離平臺，大鼠隨機(jī)點入水，通過對其游泳的軌跡計算尋找到平臺時總的游泳距離。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料多組間比較用方差分析，LSD-t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，自身對照采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.大鼠一般情況

實驗開始時共45只大鼠，MCAO法造模過程中，智三針療法組死亡3 只，PSCI 大鼠對照組死亡2 只，假手術(shù)組死亡2 只。術(shù)后恢復(fù)及針灸干預(yù)過程中，智三針療法組死亡0 只，PSCI 大鼠對照組死亡2 只，假手術(shù)組死亡1 只。最終各組大鼠數(shù)為智三針療法組12 只、PSCI 大鼠對照組11 只、假手術(shù)組12只。

2.大鼠體質(zhì)量變化（表1）

表1 3組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量變化比較（g，± s）

表1 3組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量變化比較（g，± s）

注：PSCI為腦卒中后認(rèn)知功能障礙

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術(shù)組F值P值只數(shù)12 11 12干預(yù)前302.1±18.1 310.1±20.5 306.1±23.9 2.550 0.075干預(yù)后353.1±22.3 369.1±34.1 360.1±28.7 2.320 0.104 t值1.238 1.571 1.484 P值0.231 0.133 0.180

干預(yù)前（第1天）及干預(yù)后，3組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；通過t檢驗分析，3組大鼠在同組干預(yù)前后體質(zhì)量增長無明顯差別，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3.各組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結(jié)果（表2）

表2 3組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結(jié)果（± s）

表2 3組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結(jié)果（± s）

注：PSCI為腦卒中后認(rèn)知功能障礙；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與PSCI大鼠對照組比較，bP＞0.05

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術(shù)組F值P值只數(shù)12 11 12逃避潛伏期（s）造模前/假手術(shù)前37.32±6.19 35.90±6.08 37.66±7.02 2.210 0.093造模后/假手術(shù)后51.94±8.19ab 53.13±6.28a 41.66±6.65 4.060 0.022 t值2.713 2.692 1.478 P值0.026 0.029 0.183游泳距離（cm）造模前/假手術(shù)前623.52±42.22 629.36±39.87 617.96±45.60 2.190 0.092造模后/假手術(shù)后1 242.25±100.72ab 1 192.28±137.72a 702.92±85.60 4.240 0.017 t值2.208 2.276 1.372 P值0.046 0.044 0.195

造模前6 d，3 組大鼠逃避潛伏期、游泳距離比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），這提示造模前3 組大鼠的學(xué)習(xí)能力及記憶力無明顯差別。造模后3 d，3 組大鼠逃避潛伏期、游泳距離差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，PSCI大鼠對照組、智三針療法組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離均明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.228、2.219、2.304、2.343，均P＜0.05）；與PSCI大鼠對照組比較，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.630、1.866，均P＞0.05）。造模后3 d 與造模前6 d比較，智三針療法組、PSCI大鼠對照組的逃避潛伏期和游泳距離均有增長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與假手術(shù)前比較，假手術(shù)后大鼠的逃避潛伏期、游泳距離均無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

4.各組大鼠在針灸干預(yù)前后的Morris 水迷宮實驗結(jié)果（表3）

表3 3組大鼠在針灸干預(yù)前后的Morris水迷宮實驗結(jié)果（± s）

表3 3組大鼠在針灸干預(yù)前后的Morris水迷宮實驗結(jié)果（± s）

注：PSCI為腦卒中后認(rèn)知功能障礙；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與PSCI大鼠對照組比較，bP＜0.05

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術(shù)組F值P值只數(shù)12 11 12逃避潛伏期（s）干預(yù)前51.94±8.19 53.13±6.28 41.66±6.65 4.060 0.022針灸干預(yù)后45.64±7.70ab 56.33±10.32a 39.17±5.35 4.270 0.016 t值2.245 1.602 1.370 P值0.045 0.117 0.197游泳距離（cm）干預(yù)前1 242.25±100.72 1 192.28±137.72 702.92±85.60 4.240 0.017針灸干預(yù)后887.35±92.47ab 1 292.29±104.52a 621.33±56.41 4.320 0.015 t值2.211 1.681 1.824 P值0.046 0.108 0.075

智三針療法組大鼠針灸干預(yù)后逃避潛伏期與針灸干預(yù)前比較明顯縮短，游泳距離明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；干預(yù)后，PSCI 大鼠對照組、假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離與干預(yù)前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。針灸干預(yù)結(jié)束后1 d，3組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，PSCI 大鼠對照組、智三針療法組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離均延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.508、2.482、2.473、2.318，均P＜0.05）；與PSCI 大鼠對照組比較，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期縮短，游泳距離明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.261、2.201，均P＜0.05）。

討論

對于中風(fēng)記載最早出現(xiàn)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，如對昏迷、半身不遂等有“仆擊、大厥、偏風(fēng)”等描述。根據(jù)主要臨床表現(xiàn)，“卒中后認(rèn)知障礙”可歸屬為“呆病、善忘”等病癥。腦主元神是精神意識的主宰。我國知名針灸學(xué)家靳瑞在長期性的臨床實踐及科學(xué)研究過程中，創(chuàng)建嶺南代表性“靳三針療法”［19］。其中“智三針”由神庭和本神穴組成，主要用于治療各種認(rèn)知障礙，前期已有研究均提示其對血管性認(rèn)知功能障礙療效顯著［15-21］。目前，中醫(yī)界認(rèn)為PSCI 的病因病機(jī)為髓海不足，腦失所用。其證候特征：虛證則以精氣虧虛，腦失所養(yǎng)；實證則以痰及瘀為主，痹阻腦竅。據(jù)此，筆者認(rèn)為，神庭穴屬于督脈，督脈入絡(luò)腦；本神穴屬足少陽膽經(jīng)穴位。本，人之根本，是頭部元神所在之處，主治神志病。針刺二穴可以起到補髓充腦，開竅益智的作用，適合用于PSCI 治療。通過文獻(xiàn)研究，智三針對PSCI 的相關(guān)研究及報道較少，加上智三針穴位組成較少，可以在大鼠上找到相應(yīng)穴位，進(jìn)行動物實驗的可行性較大［11，15-21］?；诖耍緦嶒為_展智三針療法對PSCI 大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力的療效觀察，為該療法的臨床應(yīng)用提供實驗參考。

本研究應(yīng)用Morris 水迷宮實驗評定大鼠學(xué)習(xí)和記憶的能力。20 世紀(jì)80 年代初，英國心理學(xué)家Morris 設(shè)計出Morris 水迷宮，用于大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能研究。此后，Morris 水迷宮系統(tǒng)被廣泛運用在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究。目前，Morris水迷宮實驗是世界公認(rèn)的評價學(xué)習(xí)記憶的方法，主要實驗動物是大鼠和小鼠。Morris水迷宮實驗測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗。定位航行試驗記錄逃避潛伏期，反映動物的學(xué)習(xí)能力；空間探索試驗記錄游泳軌跡及距離，反映動物的記憶能力［12］。

Morris水迷宮實驗中，逃避潛伏期越短，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)；游泳距離越短，記憶能力越強(qiáng)。本研究顯示，MCAO 法造模后，智三針療法組、PSCI大鼠對照組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離較造模前均有增長。假手術(shù)組大鼠未進(jìn)行MCAO 法操作，其學(xué)習(xí)能力及記憶能力較假手術(shù)前無變化。同時，造模后，與假手術(shù)組對比，智三針療法組、PSCI 大鼠對照組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離均明顯延長（均P＜0.05），且智三針組和PSCI 大鼠對照組對比，兩組大鼠的學(xué)習(xí)能力及記憶力無明顯差別（均P＞0.05），這提示造模成功。針灸干預(yù)后，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離與干預(yù)前對比顯著縮短（均P＜0.05），同時較PSCI 大鼠對照組的逃避潛伏期及游泳距離也顯著縮短（均P＜0.05）。

大鼠在卒中后認(rèn)知障礙狀態(tài)下，經(jīng)過智三針療法干預(yù)，在學(xué)習(xí)能力及記憶力方面都有改善，這提示智三針療法對PSCI 大鼠有一定療效?；谠擁椦芯拷Y(jié)論，后續(xù)將嘗試進(jìn)一步從膽堿能通路角度觀察智三針療法對PSCI 大鼠的作用靶點和療效機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 翁瑜君：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，起草文章，統(tǒng)計分析；陳志寧：實施研究，采集數(shù)據(jù)；梁偉海：分析/解釋數(shù)據(jù)；余永森：醞釀和設(shè)計試驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析；林國偉：采集數(shù)據(jù)；唐梁：醞釀和設(shè)計試驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)；劉曉?。簩ξ恼碌闹R性內(nèi)容作批評性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)