黑果枸杞Y(jié)ABBY轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與生物信息學(xué)分析

摘要：為探究黑果枸杞（Lycium ruthenicum）YABBY基因家族在鹽脅迫下的耐鹽分子機(jī)制，本文采用生物信息學(xué)方法，對(duì)黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中YABBY家族成員的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化樹及表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選出10個(gè)YABBY家族成員，分布在YAB1/YAB3，YAB2和YAB5亞家族中。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其家族成員主要定位于細(xì)胞核。黑果枸杞Y(jié)ABBY家族蛋白分子量介于11 676.16～23 751.85 D；等電點(diǎn)介于6.47～9.62；總原子數(shù)介于1 584～3 294；氨基酸個(gè)數(shù)介于106～213 aa；脂溶指數(shù)介于55.06～81.04；不穩(wěn)定系數(shù)介于26.38～70.05；蛋白成員均為親水蛋白。LrYABBY家族的蛋白質(zhì)C端具有YABBY保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較大。表達(dá)分析證明，NaCl脅迫株的不同器官中LrYABBYs具有不同的表達(dá)趨勢(shì)，LrYABBY10在根中高表達(dá)，LrYABBY8在葉中高表達(dá)，表明其可能在黑果枸杞鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果為黑果枸杞Y(jié)ABBY家族及其鹽脅迫響應(yīng)方面的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞；NaCl脅迫；YABBY轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S722.3+6""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1729-13

Identification and Bioinformatics Analysis of YABBY

Transcription Factor Family in Lycium ruthenicum

LIU Yun1， LI Xiao-xiong2， JIA Xi-bei1， Ma Rui1， LIU Di1， DU Yu1， HU Xiao-tong1， MA Yan-jun1*

（1. Forest College， Gansu Agriculture University， Lanzhou， Gansu Province 730070， China; 2. Lan Zhou Resources amp;

Environment Voc-tech University， Lanzhou， Gansu Province 730030， China）

Abstract：To investigate the salt tolerance molecular mechanism of the YABBY gene family in Lycium ruthenicum under salt stress，the bioinformatics methods was used to study and analyze the physicochemical properties，conserved domains，evolutionary trees，and expression patterns of YABBY family members in the transcriptome database of Lycium ruthenicum. The results showed that a total of 10 members of the YABBY family genes were screened from the transcriptome data of Lycium ruthenicum，belonging to the YAB1/YAB3，YAB2，and YAB5 subfamilies. The prediction results of protein subcellular localization indicated that its family members are mainly located in the nucleus. The molecular weight of the YABBY family proteins ranged from 11 676.16 to 23 751.85 D. The isoelectric point ranged from 6.47 to 9.62. The total atomic number was between 1 584 and 3 294. The number of amino acids ranged from 106 to 213 aa. The lipid solubility index ranged from 55.06 to 81.04. The instability coefficient ranged from 26.38 to 70.05. All of LrYABBY proteins were hydrophilic proteins. The C-terminal of LrYABBY proteins had YABBY conserved domain，random curling and α-helix occupy a large proportion. Expression analysis had shown that LrYABBYs had different expression trends in different organs of NaCl stressed plants. LrYABBY10 was highly expressed in the roots，while LrYABBY8 was highly expressed in the leaves，indicating that it maight play an important role in the response of Lycium ruthenicum to salt stress. This result provided a reference for further research on the YABBY family genes of Lycium ruthenicum and their salt stress responses.

Key words：Lycium ruthenicum;NaCl treatment;YABBY transcription factor;Bioinformatics analysis

YABBY 是種子植物特有的一個(gè)小轉(zhuǎn)錄因子家族［1-2］，YABBY蛋白屬于鋅指蛋白家族，其特征是在N端有一個(gè)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的YABBY結(jié)構(gòu)域［3-6］。YABBY 基因參與植物中的多種生物過(guò)程［7］，如葉及葉衍生器官的發(fā)育［8-10］，花的形成和發(fā)育［10-12］，種子的發(fā)育［13］，果實(shí)發(fā)育［13-16］和干旱、鹽脅迫等過(guò)程［17-19］。將大豆（Glycine max）GmYABBY10基因在擬南芥中超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脅迫處理可以抑制轉(zhuǎn)基因植株種子的萌發(fā)、植株的根長(zhǎng)和根表面積，推測(cè)大豆的GmYABBY10可能是植物在應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫等抗性環(huán)境中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，玉米（Zea mays）YABBY基因家族在抗旱和抗鹽的逆境脅迫應(yīng)答方面也可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［17］。菠蘿（Ananas comosus）AcYABBY4基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NaCl處理下導(dǎo)致根系短，表明AcYABBY4在抗鹽脅迫中具有負(fù)調(diào)控作用［19］。紫花苜蓿（Medicago sativa）中發(fā)現(xiàn) MsYABBY2 響應(yīng)鹽、堿、干旱等逆境脅迫，推測(cè)其可能在抗逆境脅迫中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［20］。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）的多年生落葉小灌木植物，生長(zhǎng)于西北鹽堿地［21-23］。其果實(shí)中含有豐富的氨基酸、維生素C、花青素和脂肪等，并可廣泛應(yīng)用于紡織、醫(yī)藥、輕工等領(lǐng)域，在植物中素有“軟黃金”之美稱［24］。它具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐鹽堿等能力，是我國(guó)西北鹽堿荒漠地區(qū)的重要植物［25-26］。所以研究其耐鹽分子機(jī)理對(duì)于人工栽培和良種選育具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）［27］、水稻（Oryza sativa）［28］、小麥（Triticum aestivum）［29］、煙草（Nicotiana tabacum）［30］、辣椒（Capsicum annuum）［31］、石榴（Punica granatum）［32］、荷花（Nelumbo nucifera）［33］、毛果楊（Populus trichocarpa）［34］、草莓（Fragaria vesca）［35］、陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barbadense）［36-37］等多種植物中鑒定出YABBY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，但在黑果枸杞中尚未有YABBY基因的相關(guān)研究報(bào)道。本研究基于不同濃度NaCl在不同浸泡時(shí)間處理下的黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法系統(tǒng)的鑒定了黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族成員，并分析其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹及表達(dá)模式，為之后深入研究YABBY基因在黑果枸杞抗鹽方面所能發(fā)揮的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中所用植物材料是保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院組培實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的黑果枸杞組培苗。組培的條件：光照強(qiáng)度是700 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為每天16個(gè)小時(shí)，相對(duì)濕度是65%，晝夜溫度保持在22℃/20℃（±2℃）范圍。培養(yǎng)基的配方：2.47 g·L-1的1/2MS培養(yǎng)基，0.2 mg·L-1的NAA，0.2 mg·L-1的IBA，5 g·L-1的瓊脂，20 g·L-1的蔗糖，pH值為5.7。于配置好的培養(yǎng)基中快繁黑果枸杞組培苗，兩周后取生長(zhǎng)健康且長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的黑果枸杞組培苗，煉苗5天。煉苗后的黑果枸杞組培苗清理根部殘留的培養(yǎng)基，移栽至裝有配置的1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH=5.7）的PC培養(yǎng)盒（長(zhǎng)10 cm，寬10 cm，高10 cm）中，培養(yǎng)兩周后對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫（NaCl）處理。NaCl處理方式為，在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中分別加入0 mmol·L-1，50 mmol·L-1和250 mmol·L-1的NaCl，對(duì)移入營(yíng)養(yǎng)液兩周后的黑果枸杞進(jìn)行鹽脅迫處理，然后于0 h、1 h和12 h分別取樣。以相同的NaCl處理方式對(duì)此樣本均做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)過(guò)NaCl處理后，取其不同方位且生長(zhǎng)良好的主根與完整葉片為本試驗(yàn)樣品對(duì)象，選取的測(cè)試樣品重量約0.1 g（表1），采集的樣品用液氮速凍并保存于-80℃的超低溫冰箱中備用。將提取和純化的RNA樣品密封送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。Illumina 平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)采用Trimmomatic軟件對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，之后使用Trinity軟件和CD-HIT軟件得到最終序列［38-39］。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族成員的鑒定 黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）的登錄號(hào)SRR7700825［40-41］。在 Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載YABBY家族（PF04690）［28，36，42-43］的隱馬爾可夫模型文件（Hidden Markov Model，HMM），使用TBtools軟件［44］進(jìn)行數(shù)據(jù)初篩，之后根據(jù)YABBY家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閅ABBY，用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件和SMART（https：//smart.embl.de/）在線軟件再次篩選，最終得到黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族成員。

1.2.2 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及理化性質(zhì)分析 在WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預(yù)測(cè)黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，用Expasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件分析黑果枸杞Y(jié)ABBY蛋白家族的親疏水性，使用Signa1P-6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service/Signalp-6.0/SignalP）在線軟件預(yù)測(cè)黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)信號(hào)肽，圖1是使用ChiPlot（https：//www.chiplot.online/）在線軟件繪制。

1.2.3 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析 在SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件進(jìn)行黑果枸杞Y(jié)ABBY家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對(duì)黑果枸杞Y(jié)ABBY家族蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的保守基序，使用TBtools軟件對(duì)LrYABBY 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹、LrYABBY蛋白預(yù)測(cè)的保守結(jié)構(gòu)域和保守基序進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.2.4 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析 在TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥YABBY基因家族，番茄（Solanum lycopersicum L.）YABBY基因家族和煙草YABBY基因家族于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載，利用MEGA-X軟件的工具M(jìn)USCLE進(jìn)行黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥YABBY蛋白的多序列比對(duì)，然后使用MEGA-X的領(lǐng)接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并把Bootstrap參數(shù)設(shè)置為100 0。圖5是使用ChiPlot TVBOT（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）［45］在線軟件繪制黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥YABBY蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族的表達(dá)模式分析 根據(jù)黑果枸杞Y(jié)ABBY轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)量 FPKM（Fragments per kilobase per million reads）Sequenced值［38］，使用ChiPlot在線軟件繪制圖6和圖7，并對(duì)其進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族的成員鑒定

通過(guò)YABBY家族的隱馬爾可夫模型文件和使用TBtools軟件初篩黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員之后，進(jìn)一步在NCBI Conserved Domains和SMART上，以YABBY家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閅ABBY而去除無(wú)此結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族成員共10個(gè)（表2）。

2.2 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及理化性質(zhì)分析

黑果枸杞Y(jié)ABBY家族中除LrYABBY6和LrYABBY10蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)于葉綠體，LrYABBY7亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在細(xì)胞質(zhì)，LrYABBY9亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)是細(xì)胞外基質(zhì)，其余6個(gè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均于細(xì)胞核（圖1），并且10條蛋白質(zhì)序列都不含有信號(hào)肽。黑果枸杞Y(jié)ABBY蛋白分子量介于11 676.16～23 751.85 D；等電點(diǎn)介于6.47～9.62，除LrYABBY6和LrYABBY10之外，其余8個(gè)LrYABBY蛋白家族成員的等電點(diǎn)都大于7.0，說(shuō)明黑果枸杞Y(jié)ABBY家族蛋白成員大多數(shù)富含堿性氨基酸；不穩(wěn)定系數(shù)介于26.38～70.05，除LrYABBY7，其余9個(gè)均為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)介于55.06～81.04；親水指數(shù)介于-0.695～-0.129；總原子數(shù)介于1 584～3 294；氨基酸個(gè)數(shù)介于106～213 aa（表2）。

Expasy-ProtScale在線軟件分析黑果枸杞Y(jié)ABBY蛋白家族的親疏水性，結(jié)果如圖2所示，LrYABBY1最高值為2.078，在42位；最低值為-3.456，在106位；LrYABBY2最高值為1.956，在33位；最低值為-3.456，在126位；LrYABBY3最高值為2.533，在27位；最低值為-3.456，在107位；LrYABBY4最高值為2.533，在27位；最低值為-3.456，在107位；LrYABBY5最高值為2.533，在26位；最低值為-3.456，在115位；LrYABBY6最高值為1.911，在28位；最低值為-2.3，在102位；LrYABBY7最高值為2.033，在21位；最低值為-2.433，在88位；LrYABBY8最高值為1.122，在25位；最低值為-3.456，在89位；LrYABBY9最高值為2.078，在27位；最低值為-2.633，在69和70位；LrYABBY10最高值為1.911，在28位；最低值為-3，在104位。10條LrYABBY蛋白均存在明確的親疏水區(qū)域，并且親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，表明LrYABBY蛋白家族的多肽鏈均為親水性蛋白。

2.3 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

LrYABBY蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，10個(gè)蛋白均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈。在LrYABBY家族的蛋白質(zhì)中α-螺旋分布由7.41%～53.77%，β-轉(zhuǎn)角分布由1.92%～7.41%，無(wú)規(guī)則卷曲分布由35.85%～66.03%，延伸鏈分布由6.60%～32.41%，其中無(wú)規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角的數(shù)量最多（表3）。

LrYABBY蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模預(yù)測(cè)的分析結(jié)果顯示，LrYABBY家族的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)都較為相似，如LrYABBY6和LrYABBY10等，黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的10個(gè)蛋白序列中無(wú)規(guī)則卷曲均有分布且占比最大（圖3）。為后續(xù)黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的蛋白質(zhì)研究提供理論參考。

在黑果枸杞的10個(gè)LrYABBY蛋白序列中，有5個(gè)含有1個(gè)YABBY結(jié)構(gòu)域，分別是LrYABBY1，LrYABBY2，LrYABBY3，LrYABBY8和LrYABBY9；另外5個(gè)含有1個(gè)YABBY superfamily結(jié)構(gòu)域，分別是LrYABBY4，LrYABBY5，LrYABBY6，LrYABBY7和LrYABBY10。MEME在線軟件對(duì)LrYABBY家族的結(jié)果分析中，Motif1（EQLCYVPCNFCNTVLAVSVPCSSLFDIVTVRCGH-CTNLLSVNIAAAFQSH），Motif2（EKRQRVPSAYNQFIKEEIQRIKAGNPDISHREAFSTAAK-NWAHFPHIHFG），Motif3（WQNHHVQVPNYTAPEYRMDFGSSTKCNMNRMSMRTPITNNT-QQERIVNRP），Motif4（LQDLQQRQELNIEDGSRGCGSSSSSTNCHRFSPIAADDQPR）和 Motif5（YQSHQQLHQVANYTNSPHECSTRMAARPS-ITNNSPREERIV）共5個(gè)保守基序，其中含1個(gè)Motif的黑果枸杞Y(jié)ABBY蛋白序列有1個(gè)，含2個(gè)Motif的LrYABBY蛋白序列有8個(gè)，含3個(gè)Motif的LrYABBY蛋白序列有1個(gè)，除LrYABBY7和LrYABBY8外，其余蛋白質(zhì)均含Motif1。由圖4可知，Motif1的氨基酸序列相比其他基序的保守性較高，與LrYABBY家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的保守性基本一致。

2.4 黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了更全面地了解黑果枸杞Y(jié)ABBY家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將黑果枸杞的10個(gè)YABBY蛋白，番茄的14個(gè)YABBY蛋白，煙草的20個(gè)YABBY蛋白和擬南芥的6個(gè)YABBY蛋白，共 50個(gè)YABBY蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。根據(jù)4種植物的YABBY家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，YABBY家族成員可分為五個(gè)亞家族，黑果枸杞中YAB1/YAB3亞家族包括LrYABBY1，LrYABBY2；YAB2亞家族包括LrYABBY6，LrYABBY7，LrYABBY9，LrYABBY10；YAB5亞家族包括LrYABBY3，LrYABBY4，LrYABBY5，LrYABBY8；INO亞家族和CRC亞家族中未存在黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員。YABBY系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其存在3個(gè)同源基因?qū)Γ謩e為L(zhǎng)rYABBY3和LrYABBY4，LrYABBY5和LrYABBY8以及LrYABBY6和LrYABBY10。在YABBY家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的50個(gè)成員中，YAB1/YAB3亞家族LrYABBY2與煙草Nt016492403，Nt016477431的親緣關(guān)系最近，LrYABBY1與煙草Nt016505067的親緣關(guān)系最近；YAB2亞家族LrYABBY6，LrYABBY10與煙草Nt016461884的親緣關(guān)系最近，LrYABBY7與擬南芥At1G08456的親緣關(guān)系最近，LrYABBY9與番茄Sl001234390的親緣關(guān)系最近；YAB5亞家族LrYABBY3，LrYABBY4與煙草Nt16452662，Nt16489012的親緣關(guān)系最近，LrYABBY5，LrYABBY8與番茄Sl004242778，Sl025887658的親緣關(guān)系最近。根據(jù)以上結(jié)果，說(shuō)明在3種代表物種中黑果枸杞Y(jié)ABBY家族與煙草YABBY家族親緣關(guān)系最近，其次是番茄。推測(cè)LrYABBY家族蛋白具有多樣性，而親緣關(guān)系較近的蛋白質(zhì)可能還具有相似或相近的生物學(xué)功能。

2.5 黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

為初步探索黑果枸杞Y(jié)ABBY基因的功能，分析不同濃度NaCl在不同浸泡時(shí)間的處理下，10個(gè)LrYABBY基因在根與葉的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在鹽脅迫下，不同LrYABBY基因在不同器官中的表達(dá)量存在明顯差異，并且YABBY基因在黑果枸杞的葉中相較于根中表達(dá)更為活躍。其中葉部LrYABBY1的表達(dá)量較低，而LrYABBY8表達(dá)量較高；根部LrYABBY10的表達(dá)量較高，而LrYABBY2的表達(dá)量較低。YAB5亞族的4個(gè)成員中，LrYABBY5和LrYABBY8在高濃度（250 mmol·L-1）鹽脅迫下，1 h和12 h兩組內(nèi)，葉和根中表達(dá)量均表現(xiàn)為上調(diào)；低濃度（50 mmol·L-1）鹽脅迫下，葉中為上調(diào)，根中為下調(diào)。LrYABBY3和LrYABBY4在高濃度鹽脅迫下，葉和根中表達(dá)量的表現(xiàn)與YAB5亞族另外兩個(gè)成員相同，而低濃度時(shí)則相反。在葉部中LrYABBY1，LrYABBY4，LrYABBY8，LrYABBY10在鹽處理（50 mmol·L-1和250 mmol·L-1）不同時(shí)段下表達(dá)量均高于對(duì)照組（L0），屬于受鹽脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)的基因；LrYABBY6和LrYABBY9在鹽處理不同時(shí)段下表達(dá)量均低于L0，屬于受鹽脅迫誘導(dǎo)而下調(diào)的基因，在根部中LrYABBY10在鹽處理不同時(shí)段下表達(dá)量均高于對(duì)照組（R0），屬于受鹽脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)的基因（圖6）。在濃度為50 mmol·L-1時(shí)，隨著時(shí)間的增加（1 h，12 h），根部LrYABBY1，LrYABBY2和LrYABBY6的表達(dá)量均高于對(duì)照組且呈上升趨勢(shì)；LrYABBY5和LrYABBY7的表達(dá)量均低于對(duì)照組且呈下降趨勢(shì)（圖7A）。這個(gè)濃度下1 h和12 h時(shí)，葉部LrYABBY1，LrYABBY5，LrYABBY8和LrYABBY10的表達(dá)量均高于對(duì)照組且隨時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì)；LrYABBY9的表達(dá)量均低于對(duì)照組且隨時(shí)間的增長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)（圖7B）。在濃度為250 mmol·L-1，且12 h的鹽處理下，根部LrYABBYs的表達(dá)量均高于對(duì)照組，1 h時(shí)所有成員的表達(dá)量均低于12 h的，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，根部的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。根和葉的LrYABBYs在高濃度時(shí)，隨著時(shí)間的變長(zhǎng)，LrYABBY1，LrYABBY4，LrYABBY8和LrYABBY10的表達(dá)量均在12 h時(shí)高于對(duì)照組，且隨時(shí)間的加長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)；LrYABBY3，LrYABBY5和LrYABBY7的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)PKM由低于對(duì)照組上升至高于對(duì)照組；LrYABBY6的表達(dá)量均低于對(duì)照組且隨時(shí)間增長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，LrYABBY9與之相反（圖7）。根部LrYABBY10中，R0與R250_1差異顯著（Plt;0.05）；R0與R50_1差異極顯著（Plt;0.001）；R50_1與R250_1差異極顯著（圖7A）。葉中L0與L50_1差異顯著的基因是LrYABBY4；L0與L50_12差異顯著的是LrYABBY1；L0與L250_1差異顯著的是LrYABBY1，LrYABBY4和LrYABBY6；L0與L250_12差異顯著的是LrYABBY1，LrYABBY3和LrYABBY6；L50_12與L250_1差異顯著的是LrYABBY7；LrYABBY3的L50_12與L250_12為差異非常顯著（Plt;0.01），L250_1與L250_12差異顯著（圖7B）。綜上所述，推測(cè)它們可能在響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討論

通過(guò)生物信息學(xué)的方法鑒定得到10個(gè) LrYABBY家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹及表達(dá)模式進(jìn)行了分析。

目前已在擬南芥［27］、水稻［28］、玉米［46］、番茄［47］、小麥［29］、煙草［30］、大白菜（Brassica rapa ssp.）［48］、蘋果（Malus pumila）［42］、人參（Panax ginseng）［44］、辣椒［31］、石榴［32］、荷花［33］、毛果楊［34］、草莓［35］、紫花苜蓿［20］、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）［49］、北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）［50］和杜仲（Eucommia ulmoides）［43］等不同植物中鑒定出YABBY基因家族成員。在不同植物中的YABBY基因家族的成員數(shù)量存在差異，如擬南芥有6個(gè)YABBY基因；水稻有8個(gè)YABBY基因；玉米有13個(gè)YABBY基因；番茄有9個(gè)YABBY基因；煙草有7個(gè)YABBY基因；大白菜有11個(gè)YABBY基因；蘋果有13個(gè)YABBY基因；人參有16個(gè)YABBY基因；荷花有9個(gè)YABBY基因；毛果楊有12個(gè)YABBY基因；草莓有6個(gè)YABBY基因；巴西橡膠樹有11個(gè)YABBY基因；北美鵝掌楸有6個(gè)YABBY基因；杜仲有10個(gè)YABBY基因等，本研究共鑒定到10個(gè)黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族成員，黑果枸杞與已完成測(cè)序的植物中YABBY家族成員數(shù)量相差不大。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中，黑果枸杞Y(jié)ABBY家族中多數(shù)成員定位于細(xì)胞核中，這與北美鵝掌楸［50］、人參［44］、草莓［35］、毛果楊［34］、陸地棉和海島棉［37］等植物相同。黑果枸杞的10個(gè)蛋白中有9個(gè)不穩(wěn)定蛋白和1個(gè)穩(wěn)定蛋白，且均為親水蛋白。在巴西橡膠樹［49］、杜仲［43］、荷花［33］、毛果楊［34］、蘋果［42］、人參［44］、石榴［32］、煙草［30］等植物中，它們的YABBY蛋白也均是親水蛋白，而親水性蛋白質(zhì)對(duì)植物抵抗非生物脅迫有利［51］。LrYABBY蛋白家族成員的等電點(diǎn)多數(shù)都大于7.0，這與大部分植物YABBY蛋白家族中多數(shù)成員的理論等電點(diǎn)大于7.0的情況基本相一致［7，20，37，52］。保守結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證是基因家族鑒定的核心［53-54］，YABBY家族中YABBY保守結(jié)構(gòu)域是發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域，黑果枸杞與其他植物研究中此家族均含有YABBY保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)黑果枸杞Y(jié)ABBY蛋白質(zhì)保守基序分析中有8個(gè)成員含Motif1，這與紫花苜蓿［20］、煙草［30］、西瓜［52］、水稻［28］、石榴［32］、人參［44］、毛果楊［34］、辣椒［31］、荷花［33］、番茄［47］、陸地棉與海島棉［36-37］等均是Motif1在YABBY家族成員中占多數(shù)的情況類似。LrYABBY3和LrYABBY4聚類于YAB5亞家族的同一分支中；LrYABBY5和LrYABBY8聚類于YAB5亞家族的同一分支中；LrYABBY6和LrYABBY10聚類于YAB2亞家族的同一分支中，它們的蛋白保守結(jié)構(gòu)域的組成、排列順序及位置基本相同，說(shuō)明LrYABBY的分類進(jìn)一步得到了保守基序的支持，也意味著其亞族成員間序列的高度保守性一致，而且親緣關(guān)系越近，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)也越相似（圖3，圖4）［37］。根據(jù)其它植物YABBY家族的研究，YABBY家族可以分為5個(gè)亞族，但是黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員只在YAB1/YAB3，YAB2和YAB5，這三個(gè)亞族中有分布，另外兩個(gè)（INO和CRC）亞族中未出現(xiàn)LrYABBY成員，在杜仲［43］、人參［44］、番茄［47］、巴西橡膠樹［49］、北美鵝掌楸［50］等植物中也出現(xiàn)YABBY家族成員未均出現(xiàn)在五類亞族中的研究報(bào)道。所有亞族中的黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員與煙草和番茄的YABBY家族成員均相聚較近，這與黑果枸杞跟煙草和番茄進(jìn)化距離相近較一致。煙草和番茄的YABBY基因順式元件分析中發(fā)現(xiàn)它們都有多個(gè)應(yīng)答不同生物脅迫和非生物脅迫順式作用元件，說(shuō)明其可能參與逆境響應(yīng)，而黑果枸杞LrYABBY1和煙草Nt016505067位于同一亞族YAB1/YAB3，黑果枸杞LrYABBY9和番茄Sl001234390位于同一亞族YAB2，都在亞家族中相聚較近，通常情況下位于同一亞族的基因，其可能具有相似的功能，且LrYABBY1和LrYABBY9在鹽脅迫表達(dá)模式分析中表達(dá)量均有所波動(dòng)，說(shuō)明黑果枸杞Y(jié)ABBY家族可能參與鹽脅迫響應(yīng)。以YAB5亞族為代表，黑果枸杞不同器官YABBY家族成員在高、低鹽濃度的不同時(shí)間處理下，表達(dá)量的表現(xiàn)有相反情況，也有相同的情況，說(shuō)明黑果枸杞中同一亞族的基因，在表達(dá)模式中，既存在表達(dá)特異性，也有相似性，這與野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）［56］研究報(bào)道相似。黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員的表達(dá)量在葉中較多，根中較少，這與小麥YABBY家族成員在根中表達(dá)量偏低或不表達(dá)［29］的研究結(jié)果相似。LrYABBY8位于YAB5亞族，其在鹽脅迫下，葉部的表達(dá)量均高于其他黑果枸杞Y(jié)ABBY家族成員（圖5，圖6），而YAB5亞族調(diào)控植物葉的生長(zhǎng)發(fā)育等［55］，這可能是其表達(dá)量不論在對(duì)照組（L0）或者不同濃度鹽處理（L50_1/12，L250_1/12）中都高于其他成員的原因。高鹽濃度12 h脅迫下，LrYABBY7和LrYABBY10在根和葉中的表達(dá)量均為上調(diào)，這與草莓FvYABBY2和FvYABBY5［35］的研究結(jié)果相一致。圖6根部LrYABBY家族表達(dá)模式中，R0與R250_1聚類在一起，說(shuō)明對(duì)照組和短期（1 h）高濃度鹽處理組的LrYABBY家族表達(dá)模式相近，推測(cè)黑果枸杞的根部可能對(duì)這種短時(shí)間內(nèi)高濃度鹽脅迫的環(huán)境變化反應(yīng)較為遲鈍，根內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)未出現(xiàn)較大變動(dòng)，從而影響基因的表達(dá)量，這與玉米［57］YABBY家族成員在鹽脅迫中和紫花苜蓿［20］鹽脅迫的研究結(jié)果類同。圖7根中LrYABBY10的表達(dá)量在同一濃度同一時(shí)間脅迫下均高于其他LrYABBY家族成員，低濃度短期脅迫時(shí)顯著上調(diào)，長(zhǎng)期（12 h）時(shí)下調(diào)，與高濃度相反，說(shuō)明它在低鹽濃度和高鹽濃度時(shí)受到脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短存在不同的反應(yīng)，推測(cè)它在黑果枸杞根部受不同濃度鹽脅迫時(shí)所起的調(diào)控作用可能也有所不同。葉中LrYABBY8的表達(dá)量在長(zhǎng)期脅迫下低濃度的上調(diào)幅度大于高濃度的，而短期脅迫則是高濃度大于低濃度，說(shuō)明其對(duì)低鹽濃度長(zhǎng)期脅迫更敏感，推測(cè)其可能在黑果枸杞葉部組織受到低濃度長(zhǎng)期鹽脅迫時(shí)起重要作用。這與其它植物YABBY家族的鹽脅迫研究有相似之處［17，19-20，35，46］。因此推測(cè)LrYABBY基因的功能可能與抗鹽脅迫相關(guān)。LrYABBY基因的鑒定與分析為進(jìn)一步對(duì)黑果枸杞在鹽脅迫方面的基因研究提供理論依據(jù)，并對(duì)后續(xù)獲取黑果枸杞耐鹽轉(zhuǎn)基因植物與進(jìn)一步分析此類基因的鹽脅迫應(yīng)答能力提供參考基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在NaCl脅迫下的黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組中共篩選出10個(gè)YABBY基因，分布于YAB1/YAB3，YAB2和YAB5亞家族中。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中其家族成員主要定位于細(xì)胞核，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中10個(gè)蛋白均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示在擬南芥、煙草和番茄這3種植物中，黑果枸杞Y(jié)ABBY家族與煙草YABBY家族親緣關(guān)系最近，其次是番茄。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，LrYABBY10在根中高表達(dá)，LrYABBY8在葉中高表達(dá)，根和葉中 LrYABBY8 和LrYABBY10在高濃度不同時(shí)段鹽脅迫下表達(dá)量均呈現(xiàn)為上升趨勢(shì)，低鹽濃度短期脅迫時(shí)表達(dá)量也均高于對(duì)照組，由此推測(cè)其功能可能與抗鹽脅迫相關(guān)。本研究結(jié)果為黑果枸杞Y(jié)ABBY基因家族的功能鑒定及后續(xù)黑果枸杞耐鹽脅迫基因的進(jìn)一步篩選提供參考。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）