青海湖裸鯉顆粒蛋白基因克隆及其參與鹽堿適應(yīng)機(jī)制研究

摘要：【目的】探究青海湖裸鯉顆粒蛋白A基因（GrnA）和顆粒蛋白B基因（GrnB）的生物學(xué)功能，為揭示顆粒蛋白（Grn）在青海湖裸鯉耐鹽堿過程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】以青海湖裸鯉為研究對(duì)象，通過RACE和PCR克隆青海湖裸鯉GrnA基因cDNA序列和GrnB基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在各組織中的表達(dá)情況及在鹽堿耐受過程中的表達(dá)變化，并分析二者與成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子基因（Runx2）和補(bǔ)體基因C8g間的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】青海湖裸鯉GrnA基因cDNA序列全長(zhǎng)653 bp，其開放閱讀框（ORF）465 bp，共編碼159個(gè)氨基酸殘基；青海湖裸鯉GrnB基因CDS序列長(zhǎng)1560 bp，共編碼519個(gè)氨基酸殘基。青海湖裸鯉與銀鯽的GrnA氨基酸序列相似性高達(dá)89.61%，基于GrnA氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示青海湖裸鯉與鯉和鯽的親緣關(guān)系較近；青海湖裸鯉與多鱗白甲魚的GrnB氨基酸序列相似性高達(dá)89.69%，基于GrnB氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示青海湖裸鯉與多鱗白甲魚和虎皮魚的親緣關(guān)系較近。GrnA和GrnB基因在青海湖裸鯉不同組織中均有表達(dá)，且以脾臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（Plt;0.05，下同）。青海湖裸鯉鰓組織中的GrnA基因?qū)}脅迫濃度增加的響應(yīng)速度最快，其次是脾臟和腎臟；GrnB基因則表現(xiàn)為在腎臟中的響應(yīng)速度最快，其次是脾臟和鰓組織，但在鰓組織中能持續(xù)響應(yīng)。在堿脅迫下，青海湖裸鯉GrnA基因在3個(gè)組織中呈不規(guī)律性表達(dá)變化；GrnB基因表現(xiàn)為在鰓組織中的響應(yīng)最強(qiáng)，其次是腎臟。在鹽堿混合脅迫下，GrnA基因在鰓組織中的響應(yīng)強(qiáng)于脾臟，在腎臟中也有響應(yīng)；GrnB基因在鰓組織中最先響應(yīng)鹽堿混合脅迫，其次是腎臟和脾臟。在青海湖裸鯉鰓組織中，GrnA和GrnB基因在鹽脅迫或堿脅迫下與Runx2基因呈正相關(guān)；在脾臟中，GrnA基因與C8g基因在鹽脅迫下呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），堿脅迫下GrnA和GrnB基因與C8g基因呈正相關(guān)?！窘Y(jié)論】青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因除了在脾臟中高表達(dá)外，在鰓組織和腎臟中也有相應(yīng)表達(dá)，參與青海湖裸鯉的鹽堿適應(yīng)過程，且表現(xiàn)為GrnA基因?qū)}脅迫的響應(yīng)更明顯，而GrnB基因?qū)A脅迫的響應(yīng)更明顯。此外，青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在鰓組織中可能是通過調(diào)控Runx2基因影響鰓弓的生物礦化過程，在脾臟中可能是通過激活免疫調(diào)節(jié)過程，共同協(xié)助青海湖裸鯉適應(yīng)高鹽堿環(huán)境。

關(guān)鍵詞：青海湖裸鯉；顆粒蛋白（Grn）；鹽堿脅迫；GrnA基因；GrnB基因

中圖分類號(hào)：S965.116文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）05-1480-13

Cloning of granulin gene in Gymnocyprisprzewalskii and its involvement in salinity-alkalinity adaptation mechanism

YUE Miao1，2，WEI Wei1，2，GAO Zi-han1，2，WEI Fu-lei2，LIANG Jian1*

（1State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016，China；2College of Eco-environmental Engineering，Qinghai University，Qinghai，Xining 810016，China）

Abstract：【Objective】To investigate the biological functions of granulin A gene（GrnA）and granulin B gene（GrnB）in Gymnocyprisprzewalskii，and to provide theoretical basis for revealing the mechanism of the role of granulin（Grn）in the salinity and alkalinity tolerance process of G.przewalskii.【Method】G.przewalskii was as research object，cDNA se-quence of GrnA gene and the coding region（CDS）sequence of GrnB gene were cloned by RACE and PCR，and real-timequantitative PCR was used to detect the expression of GrnA and GrnB genes in various tissues of G.przewalskii and the changes during salinity and alkalinity tolerance.Correlations among the two genes and osteogenic differentiation-specific transcription factor gene（Runx2）and complement gene C8g were also analyzed.【Result】The cDNA sequence of GrnA gene of G.przewalskii was 653 bp in length，with an open reading frame（ORF）of465 bp，encoding 159 amino acid resi-dues；the CDS sequence of GrnB gene was 1560 bp in length，encoding 519 amino acid residues.The amino acid se-quence similarity of GrnA between G.przewalskii and Silver prussian carp was as high as 89.61%，and the phylogenetic tree constructed on the basis of the GrnA amino acid sequence similarity showed that G.przewalskii was more closely re-lated to carp and crucian carp；and the amino acid sequence similarity of GrnB between G.przewalskii and Scaphesthesmacrolepis was as high as 89.69%，and the phylogenetic tree constructed on the basis of the similarity of GrnB amino acid sequences showed that G.przewalskii was closely related to S.macrolepis and Puntius tetrazona.GrnA and GrnB genes were expressed in different tissues of G.przewalskii，with the highest expression in spleen，which was significantly higher than that in other tissues（Plt;0.05，the same below）.The GrnA gene in gill tissue of G.przewalskii showed the fastest response to salt stress，followed by spleen and kidney；while the GrnB gene showed the fastest response in kidney，followed by spleen and gill，but sustained response in gill tissue.Under alkalinity stress，the GrnA gene showed irregular expression changes in the three tissues；the GrnB gene showed the strongest response in gill tissue，followed by kidney.Under salinity-alkalinity mixed stress，GrnA gene responded stronger in gill tissue than in spleen，and also re-sponded in kidney；GrnB gene responded first in gill tissue，followed by kidney and spleen.In gill tissue，GrnA and GrnB genes were positively correlated with Runx2 gene under salinity or alkalinity stress；in spleen，GrnA gene was ex-tremely significantly positively correlated with C8g gene under salinity stress（Plt;0.01），and GrnA and GrnB genes were positively correlated with C8g gene under alkalinity stress.【Conclusion】In addition to high expression in spleen，GrnA and GrnB genes are also expressed in gill and kidney，which are involved in saline and alkaline adaptation in G.przewal-skii，and GrnA gene shows a more obvious response to salinity stress，while GrnB gene shows a more obvious response to alkalinity stress.It is more likely that the GrnA and GrnB genes affect the biomineralization process of gill arches through the regulation of Runx2 gene in gill tissue and activate immune regulation in spleen，which together assists the adaptation to high salinity and alkalinity environments of G.przewalskii.

Key words：Gymnocyprisprzewalskii；granulin（Grn）；salinity-alkalinity stress；GrnA gene；GrnB gene Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31960741）

0引言

【研究意義】鹽度和堿度是重要的環(huán)境因子。魚類在一定的鹽堿脅迫限度范圍內(nèi)可通過自身生理生化機(jī)能，如離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)及組織結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境影響，但鹽堿度超過閾值范圍后就會(huì)對(duì)魚類造成不可逆的損傷，甚至導(dǎo)致死亡（王慧等，2003）。生活在鹽堿環(huán)境中的水生生物對(duì)鹽堿度的變化十分敏感，高鹽度會(huì)影響水生生物的滲透平衡，高堿度則引起水生生物的組織損傷及相關(guān)免疫酶活性下降（Liu et al.，2004），且鹽度和堿度對(duì)水生生物的生存及繁殖影響表現(xiàn)出一定程度的協(xié)同作用（黨云飛等，2012）。鹽堿環(huán)境中的魚類，一方面通過食物攝取來吸收和排出外界環(huán)境中的離子，另一方面通過鰓、皮膚等滲透器官完成與外界環(huán)境的離子交換，二者共同使其體內(nèi)外的滲透壓維持平衡狀態(tài)。已有研究證實(shí)，青海湖裸鯉（Gymnocyprisprzewal-skii）是耐高鹽堿能力最強(qiáng)的魚類，其次是尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）和瓦氏雅羅魚（Leucisuswaleckii）（史為良，1981）。青海湖裸鯉通過減少滲透調(diào)節(jié)耗能及耐低氧能力，在自然選擇和長(zhǎng)期進(jìn)化中已適應(yīng)高鹽堿環(huán)境（Weiet al.，2022）。青海湖裸鯉在適應(yīng)高鹽堿過程中常會(huì)發(fā)生器官損傷、傷口難自愈等問題。顆粒蛋白（Granulin，Grn）作為一類特別的蛋白生長(zhǎng)因子（Yang et al.，2015；Georgoulia and Glykos，2019），具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，因此，開展顆粒蛋白功能研究有助于揭示青海湖裸鯉耐鹽堿特性的分子機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】顆粒蛋白前體（Progranu-lin，PGrn）屬于分泌性糖蛋白，由7個(gè)Grn單體及一段信號(hào)肽組成（Palfree et al.，2015），信號(hào)肽被剪切后即產(chǎn)生Grn單體。大多數(shù)Grn是由12個(gè)半胱氨酸殘基和6個(gè)二硫鍵組成。（Ong and Bateman，2003；Tak-joo et al.，2020）；Grn在不同物種中的序列、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性存在明顯差異，而半胱氨酸殘基的環(huán)化形式?jīng)Q定了Grn結(jié)構(gòu)的保守性（Eichinger et al.，2005；Chen et al.，2006）。至今，已在魚類和許多無脊椎生物中發(fā)現(xiàn)多個(gè)Grn基因。斑馬魚基因組中含有4個(gè)Grn基因（Schmid and Haass，2013），分別是GrnA、GrnB、Grn1和Grn2。GrnA和GrnB是人類Grn的同源物，分別由12和9個(gè)Grn的結(jié)構(gòu)域組成。斑馬魚還有2種較短的Grn，即Grn1和Grn2，二者由1.5個(gè)Grn的結(jié)構(gòu)域組成。斑馬魚GrnA和鯉Grn1均含有明顯的蛋白結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)β-發(fā)夾堆疊（Bateman and Bennett，1998；Hrabaletal.，2023）。鯉Grn1的N端區(qū)域?qū)?yīng)肽段及人類GrnA的N端區(qū)域可獨(dú)立折疊成僅含2個(gè)二硫鍵的β結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮生物活性（Vranken et al.，1999，2002；Tolkatchev et al.，2000，2010）。此外，Grn可激活下游的ERK1/2磷酸化及成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子基因（Runx2）表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化（Feng et al.，2010；劉晨和畢良佳，2019）。硬骨魚類的主要滲透調(diào)節(jié)器官有鰓、腎臟及腸道，也有研究證實(shí)脾臟參與魚類的滲透調(diào)節(jié)，如金錢魚（Scatophagus argus）脾臟的il-17d、c8g和il-1β等免疫基因，在急性及長(zhǎng)期的鹽度適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用（蔡博生，2022）。目前，有關(guān)魚類鰓、腎臟和腸道在滲透調(diào)節(jié)方面的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道（Beyenbach，2004；Tseng and Hwang，2008；Bui and Kelly，2014；Tresguerres et al.，2023），但針對(duì)魚類的鹽堿耐受過程及其作用機(jī)理還不夠明確?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】青海湖裸鯉隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae），是青藏高原的特有物種（付生云等，2019），具有極強(qiáng)的耐鹽堿能力，在青海湖水生生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮重要作用（阿琳林等，2023；許保可等，2023），但Grn是否參與其耐鹽堿過程的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在鹽堿耐受過程中的表達(dá)變化，結(jié)合二者與補(bǔ)體基因C8g和Runx2基因間的相關(guān)性，探究青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的生物學(xué)功能，為揭示Grn在青海湖裸鯉耐鹽堿過程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試青海湖裸鯉為3～4齡的成魚（體長(zhǎng)150～200 mm，體質(zhì)量90～120 g），由青海湖裸鯉救護(hù)中心（青海湖裸鯉人工增殖放流站）提供。試驗(yàn)前將青海湖裸鯉暫養(yǎng)于青海大學(xué)高原冷水魚養(yǎng)殖車間，試驗(yàn)馴化約1周。馴化期前1 d不喂食，其后每天早中晚各喂食1次；馴化期間的養(yǎng)殖用水為海水素（青島?？仆ㄓ煤Ｋ赜邢薰荆┨幚淼淖詠硭?0 L青海本地自來水加10.0 g海水素，配制成鹽度6‰、堿度2 mmol/L的馴化水）；連續(xù)充氣增氧，每日換水1次（換水量為20 L）。動(dòng)物試驗(yàn)由青海大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)QHU-PJ201901-109。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣

將馴化后的青海湖裸鯉成魚分為淡水組、鹽度組、堿度組及鹽堿混合組，淡水組繼續(xù)以海水素處理的自來水養(yǎng)殖，鹽度組、堿度組、鹽堿混合組分別用海水素、NaHCO3和Na2CO3按海水素∶NaHCO3∶Na2CO3=64∶9∶1配制成相應(yīng)的鹽堿處理水養(yǎng)殖。試驗(yàn)期間，鹽堿處理濃度每天以5%遞增（鹽度按0.65‰/d的速度遞增，堿度按1.55 mmol/L/d的速度遞增），20 d后達(dá)100%鹽堿脅迫（鹽度為16‰，堿度為32 mmol/L）。當(dāng)3個(gè)處理組的鹽堿脅迫濃度分別達(dá)25%、50%、75%和100%時(shí)，各處理組每個(gè)濃度階段隨機(jī)選取3尾健康狀態(tài)良好的青海湖裸鯉進(jìn)行解剖，采集其鰓、腦、肌肉、脾臟、腸道、肝臟、心臟及腎臟等組織樣品，置于無酶凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3樣品總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法分別提取淡水組、鹽度組、堿度組及鹽堿混合組的青海湖裸鯉各組織總RNA，以微量核酸測(cè)定儀（NP80，德國(guó)Implen公司）檢測(cè)總RNA的濃度和純度。按照PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）操作說明，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因克隆及測(cè)序

參考本課題組前期對(duì)青海湖裸鯉的轉(zhuǎn)錄組全長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物GpGrnA-F/GpGrnA-R和GpGrnB-F/GpGrnB-R（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于擴(kuò)增青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因。PCR反應(yīng)體系25.0μL：Ex Taq DNA聚合酶12.5μL（日本TaKaRa公司），上、下游引物各1.0μL，cDNA模板1.0μL，去離子水補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后通過含Amp（100 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，陽性單克隆菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。根據(jù)菌液測(cè)序結(jié)果獲得的中間片段，分別設(shè)計(jì)3'-RACE和5'-RACE的特異性引物（表1）進(jìn)行末端擴(kuò)增。按照SMART ScribeTM Reverse Transcriptase試劑盒說明進(jìn)行操作，擴(kuò)增程序：94℃30 s，72℃3 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，57℃30 s，72℃3 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行純化回收、連接及轉(zhuǎn)化，最后將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

通過DNASTAR對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接，獲得青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因序列，并確定其起始密碼子、終止密碼子及編碼氨基酸數(shù)量等。根據(jù)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因核酸序列推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，再通過ProtParam預(yù)測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB蛋白的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)（pI）及正負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)等，利用SOPMA預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。獲得的青海湖裸鯉GrnA和GrnB氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，并通過ClustalW完成GrnA和GrnB氨基酸序列多重比對(duì)，然后采用MEGA 11.0中的最大似然法（Maximum likelihood estima-tion，MLE）繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因組織表達(dá)分析

根據(jù)擴(kuò)增獲得的青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物（表1），用于檢測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在不同組織中的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0μL：SYBR?Premix Ex TaqⅡ（2×）5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板1.0μL，無酶去離子水補(bǔ)足至10.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃5 s，57℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，將肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

為檢測(cè)鹽度組、堿度組及鹽堿混合組青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的表達(dá)變化，根據(jù)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在不同組織中的高表達(dá)情況，反轉(zhuǎn)錄合成鹽度組、堿度組及鹽堿混合組中相應(yīng)組織的cDNA模板，以EF-1α為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GrnA和GrnB基因在不同處理組青海湖裸鯉鰓、腎臟及脾臟中的表達(dá)情況。將淡水組青海湖裸鯉各組織中的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，通過2-ΔΔCt法計(jì)算其他處理組對(duì)應(yīng)組織中的相對(duì)表達(dá)量，并以GraphPad Prism 9.0進(jìn)行差異顯著性分析。

1.6不同鹽堿脅迫下青海湖裸鯉Runx2和C8g基因組織表達(dá)分析

以EF-1α為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)淡水組、鹽度組、堿度組及鹽堿混合組青海湖裸鯉鰓組織中Runx2基因和脾臟中C8g基因的表達(dá)情況，具體反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.5。將淡水組青海湖裸鯉各組織中的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，通過2-ΔΔCt法計(jì)算其他處理組對(duì)應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量，并使用Origin 2021進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，明確不同鹽堿脅迫下青海湖裸鯉GrnA、GrnB基因與Runx2和C8g基因的相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因克隆及生物信息學(xué)分析結(jié)果

青海湖裸鯉GrnA基因cDNA序列全長(zhǎng)653bp，包括43 bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）、145 bp的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）和465 bp的開放閱讀框（ORF）（圖1-A），共編碼159個(gè)氨基酸殘基；青海湖裸鯉GrnA蛋白相對(duì)分子量為17.4 kD，pI為5.58，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占11.69%、延伸鏈占9.09%、β-轉(zhuǎn)角占2.60%、無規(guī)則卷曲占76.62%（圖2-A）。青海湖裸鯉GrnB基因編碼序列（CDS）長(zhǎng)1560bp（圖1-B），共編碼519個(gè)氨基酸殘基；青海湖裸鯉GrnB蛋白相對(duì)分子量為56.04 kD，pI為5.82，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占1.73%、延伸鏈占4.62%、β-轉(zhuǎn)角占1.16%、無規(guī)則卷曲占92.49%（圖2-B）。

2.2青海湖裸鯉GrnA和GrnB氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果

由圖3-A可看出，青海湖裸鯉與銀鯽（Carassius auratus gibelio）的GrnA氨基酸序列相似性最高，達(dá)89.61%；與鯉（Cyprinus carpio）和南亞野鯪（Labeorohita）的GrnA氨基酸序列相似性次之，分別為87.01%和77.07%。由圖3-B可看出，青海湖裸鯉與多鱗白甲魚（Scaphesthesmacrolepis）的GrnB氨基酸序列相似性最高，達(dá)89.69%；與犀角金線鲃（Sinocy-clocheilusrhinocerous）、安水金線鲃（S.anshuiensis）、滇池金線鲃（S.grahami）和虎皮魚（Puntius tetrazona）的GrnB氨基酸序列相似性次之，分別為87.02%、87.02%、86.64%和85.69%。

基于GrnA和GrnB氨基酸序列相似性，采用MEGA 11.0中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析青海湖裸鯉與其他物種間的親緣關(guān)系?；贕rnA氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4-A）顯示，青海湖裸鯉與鯉和鯽的親緣關(guān)系較近，尤其是與鯉的親緣關(guān)系最近；基于GrnB氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4-B）顯示，青海湖裸鯉與多鱗白甲魚、虎皮魚的親緣關(guān)系較近，與其他陸地脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的組織表達(dá)特異性

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在鰓、腦、肌肉、脾臟、腸道、肝臟、心臟及腎臟等組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5）表明，青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在8個(gè)組織中均有表達(dá)，且以脾臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05，下同）。除了脾臟外，青海湖裸鯉GrnA基因在肝臟、腸道、心臟、鰓及腎臟等組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，GrnB基因在腎臟、心臟、腦及鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量較高。

2.4青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在不同鹽堿脅迫下的表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在不同鹽堿脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明：青海湖裸鯉鰓組織中的GrnA基因在鹽脅迫和鹽堿混合脅迫下極顯著上調(diào)表達(dá)（圖6-A）（Plt;0.01，下同），而GrnB基因在堿脅迫和鹽堿混合脅迫下極顯著上調(diào)表達(dá)，且隨堿度的升高呈遞增趨勢(shì)（圖6-D）；GrnA和GrnB基因的相對(duì)表達(dá)量均隨著鹽度的升高而呈下降趨勢(shì)。在青海湖裸鯉腎臟中，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，GrnA基因在鹽脅迫和鹽堿混合脅迫下的相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)，在堿脅迫下GrnA基因相對(duì)表達(dá)量呈明顯上升趨勢(shì)（圖6-B），即GrnA基因?qū)A脅迫的響應(yīng)更明顯；GrnB基因的相對(duì)表達(dá)量在鹽堿混合脅迫下均極顯著上升（圖6-E），對(duì)鹽堿混合脅迫的響應(yīng)更明顯。在青海湖裸鯉脾臟中，GrnA基因相對(duì)表達(dá)量隨著鹽脅迫濃度的增加呈極顯著上升趨勢(shì)，堿脅迫和鹽堿混合脅迫濃度≥50%時(shí)其相對(duì)表達(dá)量也極顯著上升（圖6-C）；GrnB基因相對(duì)表達(dá)量在鹽脅迫和堿脅迫下呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，在鹽堿脅迫下則表現(xiàn)為先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)（圖6-F）。

綜上所述，青海湖裸鯉鰓組織中的GrnA基因?qū)}脅迫濃度增加的響應(yīng)速度最快，其次是脾臟和腎臟；GrnB基因則在腎臟中的響應(yīng)速度最快，其次是脾臟和鰓組織，但在鰓組織中能持續(xù)響應(yīng)。在堿脅迫下，青海湖裸鯉GrnA基因在3個(gè)組織中呈不規(guī)律性表達(dá)變化；GrnB基因表現(xiàn)為在鰓組織中響應(yīng)最強(qiáng)，其次是腎臟，脾臟中GrnB基因?qū)A脅迫的響應(yīng)較弱。在鹽堿混合脅迫下，GrnA基因在鰓組織中的響應(yīng)強(qiáng)于脾臟，在腎臟中也有響應(yīng)；GrnB基因在鰓組織中最先響應(yīng)鹽堿混合脅迫，其次是腎臟和脾臟。說明青海湖裸鯉鰓GrnA和GrnB基因在鰓組織、腎臟及脾臟中參與鹽堿耐受過程。

2.5不同鹽堿脅迫下青海湖裸鯉Runx2和C8g基因的表達(dá)差異

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同鹽堿脅迫下青海湖裸鯉鰓組織中Runx2基因和脾臟中C8g基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，Runx2基因在鹽脅迫下的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著上升；在堿脅迫下的相對(duì)表達(dá)量呈下降—上升—下降—上升的變化趨勢(shì)，與淡水組相比差異均極顯著；在鹽堿混合脅迫下，Runx2基因相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)（圖7-A）。說明在青海湖裸鯉鰓組織中，Runx2基因?qū)}脅迫、堿脅迫和鹽堿混合脅迫均有響應(yīng)，且對(duì)堿脅迫和鹽堿混合脅迫的響應(yīng)強(qiáng)于鹽脅迫。C8g基因在鹽脅迫和堿脅迫下的相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高，而在鹽堿混合脅迫下其相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，在鹽堿100%（鹽度16～，堿度32 mmol/L）條件下的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值（圖7-B）。說明在青海湖裸鯉脾臟中，C8g基因?qū)}脅迫、堿脅迫和鹽堿混合脅迫均有響應(yīng)，且對(duì)鹽堿混合脅迫的響應(yīng)強(qiáng)于鹽脅迫和堿脅迫。

Spearman相關(guān)分析結(jié)果（圖8）表明，在青海湖裸鯉鰓組織中，GrnA和GrnB基因在鹽脅迫或堿脅迫下與Runx2基因呈正相關(guān)（圖8-A和圖8-B），在鹽堿混合脅迫下與Runx2基因呈負(fù)相關(guān)（圖8-C）；在脾臟中，GrnA基因與C8g基因在鹽脅迫下呈極顯著正相關(guān)（圖8-D），堿脅迫下GrnB基因與C8g基因的正相關(guān)性大于GrnA基因與C8g基因的相關(guān)性（圖8-E），鹽堿混合脅迫下GrnA和GrnB基因與C8g基因均呈負(fù)相關(guān)，且GrnB基因與C8g基因的負(fù)相關(guān)性大于GrnA基因與C8g基因的相關(guān)性（圖8-F）。

3討論

3.1青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系

整個(gè)Grn基因家族進(jìn)化歷史是從后生動(dòng)物開始（包括黏液霉菌和綠色植物），一直延伸到動(dòng)物基因組（包括鯉和斑馬魚）。因此，Grn家族被認(rèn)為是當(dāng)代生物界最早存在的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白（Bateman and Bemett，2009；Chitramuthuetal.，2010）。魚類中典型的Grn基因可劃分為GrnA和GrnB基因，其中斑馬魚的Grn基因能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖（Cadieux et al.，2005），與生長(zhǎng)因子的功能一致。有關(guān)Grn的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明，其僅在大約15億年前進(jìn)化過一次（King et al.，2008）。本研究從青海湖裸鯉中成功克隆獲得GrnA和GrnB基因，其中，青海湖裸鯉GrnA基因cDNA序列全長(zhǎng)653 bp，共編碼159個(gè)氨基酸殘基，青海湖裸鯉GrnB基因CDS序列長(zhǎng)1560 bp，共編碼519個(gè)氨基酸殘基；基于GrnA氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，青海湖裸鯉與鯉和鯽的親緣關(guān)系較近，尤其是與鯉的親緣關(guān)系最近；基于GrnB氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，青海湖裸鯉與多鱗白甲魚、虎皮魚的親緣關(guān)系較近。柳芳等（2023）基于DNAJC2氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示青海湖裸鯉與鯽和鯉的親緣關(guān)系較近；許保可等（2023）研究表明，從慢收縮骨骼肌型肌鈣蛋白I（TNNI1）氨基酸序列來看，青海湖裸鯉與金線鲃屬魚類、鯽、鯉的親緣關(guān)系較近；從快收縮骨骼肌型肌鈣蛋白I（TNNI2）氨基酸序列來看，青海湖裸鯉與鯉的親緣關(guān)系最近，其次是鯽和金線鲃屬魚類?？梢姡嗪：沲幣c鯉科魚類的親緣關(guān)系較近。

3.2鹽堿脅迫下青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GrnA和GrnB基因在淡水養(yǎng)殖青海湖裸鯉不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因除了在脾臟中高表達(dá)外，在腎臟和鰓組織中也有相應(yīng)表達(dá)，表明這2個(gè)基因可能參與了青海湖裸鯉的鹽堿適應(yīng)過程。鰓作為魚類的呼吸器官，承擔(dān)著魚類與外界環(huán)境的氣體交換、體內(nèi)外的鹽堿平衡等功能（Sollid et al.，2003）。環(huán)境鹽度的變化會(huì)改變硬骨魚類鰓組織中泌氯細(xì)胞的大小、數(shù)量及細(xì)胞結(jié)合力。已有研究表明，尼羅羅非魚（莊青青等，2012）、星斑川鰈（Platichthysstellatus）幼魚（尤宏?duì)幍龋?013）的鰓絲泌氯細(xì)胞通過改變其數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)來適應(yīng)鹽度，排出體內(nèi)多余的鹽以維持魚體的水鹽平衡。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，青海湖裸鯉鰓組織中的GrnA基因在鹽脅迫和鹽堿混合脅迫下極顯著上調(diào)表達(dá)，而GrnB基因在堿脅迫和鹽堿混合脅迫下呈極顯著上調(diào)表達(dá)，即青海湖裸鯉GrnA基因?qū)}脅迫和鹽堿混合脅迫的響應(yīng)更明顯，而GrnB基因?qū)A脅迫和鹽堿混合脅迫的響應(yīng)更明顯，且GrnA基因在鰓組織中的響應(yīng)強(qiáng)于GrnB基因，故推測(cè)GrnA基因在青海湖裸鯉鰓組織的鹽堿適應(yīng)中發(fā)揮主導(dǎo)作用。硬骨魚類的腎臟可調(diào)節(jié)體內(nèi)的水鹽平衡，通常魚類生活的外界環(huán)境與其體液滲透壓不完全相同，因此需要腎臟及鰓組織的共同作用來調(diào)節(jié)和補(bǔ)償內(nèi)外環(huán)境的滲透壓差值（周佳楠，2021；邢韶穎，2023）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，青海湖裸鯉腎臟中的GrnA基因相對(duì)表達(dá)量在鹽脅迫和鹽堿混合脅迫下均呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)，且在堿脅迫下呈明顯上升趨勢(shì)，即GrnA基因?qū)A脅迫的響應(yīng)更明顯；GrnB基因在鹽堿混合脅迫下呈極顯著上調(diào)表達(dá)?？梢?，GrnA和GrnB基因共同在腎臟中參與青海湖裸鯉的鹽堿耐受過程。脾臟作為重要的造血組織，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。硬骨魚類脾臟中的C8g等免疫基因在急性和長(zhǎng)期鹽度適應(yīng)中發(fā)揮重要作用，即鹽度不僅影響廣鹽性海洋硬骨魚類的生存、繁衍、滲透壓調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及重要激素分泌等生理過程，還對(duì)海洋魚類的免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用（蔡博生，2022）。綜上所述，青海湖裸鯉脾臟中的GrnA基因?qū)}脅迫的響應(yīng)更明顯，而GrnB基因?qū)A脅迫的響應(yīng)更明顯。

3.3鹽堿脅迫下青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因的功能探討

從滲透調(diào)節(jié)的重要器官（鰓和腎臟），到免疫相關(guān)的脾臟，青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因均存在持續(xù)升高的表達(dá)模式，說明二者在鹽堿適應(yīng)中扮演著重要角色。已有研究表明，Grn通過調(diào)控Runx2而發(fā)揮作用（Li etal.，2019）。在青海湖裸鯉鰓組織中，GrnA和GrnB基因在鹽脅迫或堿脅迫下與Runx2基因呈正相關(guān)，在鹽堿混合脅迫下與Runx2基因呈負(fù)相關(guān)，說明GrnA和GrnB基因在不同環(huán)境中可能與Runx2基因共同應(yīng)對(duì)鹽堿耐受。Runx2與生物礦化過程極其密切，魚類鰓弓正是生物礦化的產(chǎn)物，故推測(cè)Grn通過調(diào)控Runx2而影響鰓弓的生物礦化過程，進(jìn)而參與青海湖裸鯉的鹽堿適應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫會(huì)引起青海湖裸鯉的免疫反應(yīng)，在鰓組織和腎臟中顯著富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，確認(rèn)C8g基因參與青海湖裸鯉的免疫和滲透調(diào)節(jié)（張海琛等，2023）。本研究也發(fā)現(xiàn)，在青海湖裸鯉脾臟中，GrnA基因與C8g基因在鹽脅迫下呈極顯著正相關(guān)，堿脅迫下GrnB基因與C8g基因的正相關(guān)性大于GrnA基因與C8g基因的相關(guān)性，鹽堿混合脅迫下GrnA和GrnB基因與C8g基因均呈負(fù)相關(guān)，與van der Ende等（2019）的研究結(jié)果相似，但C8g基因與GrnA和GrnB基因間的調(diào)控關(guān)系還需進(jìn)一步探究。

此外，在取樣過程中發(fā)現(xiàn)隨著鹽堿脅迫濃度的增加，青海湖裸鯉的脾臟出現(xiàn)異常增大現(xiàn)象，說明Grn在青海湖裸鯉應(yīng)對(duì)高鹽堿環(huán)境時(shí)，一方面可能是通過增大自身免疫器官（脾臟）體積來減少吸氧的相對(duì)表面積，從而應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境；另一方面可能是通過免疫調(diào)節(jié)來參與鹽堿耐受過程。張永安等（2000）研究表明，當(dāng)硬骨魚類受到一定的外源刺激時(shí)，其脾臟、腎臟等免疫器官可產(chǎn)生大量的黑色素巨噬細(xì)胞，進(jìn)而通過與抗體和淋巴細(xì)胞相結(jié)合來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能。還有研究發(fā)現(xiàn)，GrnB不僅具有促炎作用，還在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，能以濃度依賴的方式適度激活炎癥因子NF-κB（Hayden and Ghosh，2008；Ghag etal.，2016）。青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在脾臟中高表達(dá)，故推測(cè)其可能主要通過激發(fā)免疫調(diào)節(jié)來參與鹽堿適應(yīng)過程。

4結(jié)論

青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因除了在脾臟中高表達(dá)外，在鰓組織和腎臟中也有相應(yīng)表達(dá)，參與青海湖裸鯉的鹽堿適應(yīng)過程，且表現(xiàn)為GrnA基因?qū)}脅迫的響應(yīng)更明顯，而GrnB基因?qū)A脅迫的響應(yīng)更明顯。此外，青海湖裸鯉GrnA和GrnB基因在鰓組織中可能是通過調(diào)控Runx2基因影響鰓弓的生物礦化過程，在脾臟中可能是通過激活免疫調(diào)節(jié)過程，共同協(xié)助青海湖裸鯉適應(yīng)高鹽堿環(huán)境。

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（責(zé)任 編輯蘭宗寶）