狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡的研制

摘" 要：本研究采用膠體金免疫層析法（gold immunochromatographic assay，GICA），以狂犬病病毒G蛋白作為膠體金標記物及檢測線診斷物，兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體作為質控線，制備狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡。結果顯示，制備的試紙卡可在10～15 min完成顯色，與其他犬源性病毒陽性血清沒有交叉反應，具有較高的特異性；狂犬病病毒抗體標準陽性血清梯度稀釋檢測結果顯示，制備的試紙卡具有較高的靈敏度，可達到0.5 IU/mL；通過對100份樣本的檢測，并與熒光抗體病毒中和試驗（fluorescent antibody virus neutralization，F(xiàn)AVN）結果進行比對，符合率達96.0％；同時，試紙卡可在室溫（22～25 ℃）環(huán)境中穩(wěn)定保存36周，在4 ℃環(huán)境中穩(wěn)定保存48周。本研究制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡具有較高的敏感性、特異性、重復性與穩(wěn)定性，對臨床診斷以及疫苗免疫效果的評估具有一定的參考意義。

關鍵詞：狂犬病病毒；抗體檢測；膠體金免疫層析

中圖分類號：S852.23 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）03-0023-04

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患病，表現(xiàn)為以侵害溫血動物中樞神系統(tǒng)為主的急性致死性腦髓炎，又名恐水癥、瘋犬病[1]，具備高病死率、無法醫(yī)治的特點，主要通過攜帶病原體或發(fā)病的溫血動物（主要為犬）咬傷感染，每年全球約有70 000人因此死亡。對于狂犬病，疫苗注射為主要的預防方式?？焖贌晒庠钜种圃囼灒╮apid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）和熒光抗體病毒中和試驗（fluorescent antibody virus neutralization，F(xiàn)AVN）是世界動物衛(wèi)生組織推薦的體外測定血清中抗體水平的方法[2]。然而，這些測定方法需要大量的時間與精力，同時需要具有專業(yè)背景知識的人員操作。而膠體金免疫層析試紙卡具有快速、簡便和易于操作等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場與當下的定性判定。本研究基于膠體金免疫層析試紙卡的以上優(yōu)點，研制了一種狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡。

1" 材料與方法

1.1 材料

氯金酸（AuCl4H）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Sigma公司，檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，硝酸纖維素膜購自Sartrious公司，玻璃纖維膜和吸水紙購自懷遠縣通成紙制品有限公司，PVC板購自南通浩杰特貿易有限公司，狂犬病病毒G蛋白和兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體、犬瘟熱病毒陽性血清、犬細小病毒陽性血清、犬冠狀病毒陽性血清、犬腺病毒陽性血清、犬副流感病毒陽性血清、犬輪狀病毒陽性血清和犬呼腸孤病毒陽性血清由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存并提供，100份待測樣本（熒光抗體病毒中和試驗檢測）由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院提供。

1.2 狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡的制備

1.2.1 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法對膠體金溶液進行制備。取100 mL超純水于250 mL錐形瓶中，隨后加入2.0 mL 1.0％氯金酸溶液，并置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌并加熱至沸騰。在攪拌過程中，快速加入3.2 mL 1.0％檸檬酸三鈉溶液，可觀察到溶液逐漸由淺黃色變?yōu)橥该?，又變?yōu)榛液谏?，最后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱20 min，加熱結束后持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，最后加入超純水定容至100 mL，置于棕色瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金-抗原復合物的制備

取上述制備的膠體金溶液20 mL，加入用超純水潤洗的燒杯中，一邊快速攪拌一邊滴加一定量0.2 M K2CO3溶液，調整溶液pH至9.0，隨后加入100 μL狂犬病病毒G蛋白（2.0 mg/mL），繼續(xù)攪拌20 min，再加入終濃度為0.5％的BSA，繼續(xù)攪拌20 min。4 ℃ 8 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用含5％蔗糖的" " " " " " " " " " " " " " " " " "0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，置于棕色瓶中4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫層析試紙卡的制備

該試紙條由樣本墊、金標物結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和粘有一層聚氯乙烯片材作為襯膜的塑料聚乙烯板組成。將玻璃纖維用含0.5％ BSA、1％聚乙烯吡咯烷酮-40、0.5％Tetronic 1307的Tris-HCL緩沖液（0.02 mol/L）封閉后，置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上，即為樣本墊。將膠體金-抗原復合物噴涂于金標物結合釋放墊上，并進行真空干燥。將兔抗狂犬病病毒G蛋白多克隆抗體（0.5 mg/mL）和狂犬病病毒G蛋白（1.5 mg/mL）分別包被為硝酸纖維素膜上的質控線和檢測線，隨后置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上。將以上組分按照樣本墊、金標物結合釋放墊、硝酸纖維膜以及吸水墊的順序依次粘在塑料聚乙烯板上，切成寬為2.8 mm的試紙卡，加干燥劑密封，室溫保存。

1.2.4 樣本的檢測

將樣本與樣本稀釋液分別滴入組裝好的試紙卡中，8～10 min后觀察結果。試紙卡纖維膜上出現(xiàn)2條紅色線判為陽性；僅質控線區(qū)出現(xiàn)" 1條紅色線判為陰性；質控線區(qū)沒有出現(xiàn)紅色線視為結果無效。

1.3 狂犬病病毒抗體快速免疫層析試紙卡的評價

1.3.1 特異性評定

采用同一批次的試紙卡分別對狂犬病病毒標準陽性血清、犬瘟熱病毒陽性血清、細小病毒陽性血清、犬冠狀病毒陽性血清、犬腺病毒陽性血清、犬副流感病毒陽性血清、犬輪狀病毒陽性血清和犬呼腸孤病毒陽性血清進行特異性評定。

1.3.2 敏感性評定

利用狂犬病病毒標準陽性血清（40 IU/mL）分別設置40.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、 0.5 IU/mL等8個濃度梯度，并設置空白對照（樣本稀釋液），分別滴入樣本孔中，以評定試紙卡的敏感性。

1.3.3 重復性評定

選取4份狂犬病病毒陽性血清樣本和4份狂犬病病毒陰性血清樣本，每份樣本平行做3個重復，用同一批次狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡進行檢測，確定試紙條的批內重復性。

選取4份狂犬病病毒陽性血清樣本和4份狂犬病病毒陰性血清樣本，每份樣本平行做3個重復，用3個不同批次的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡進行檢測，確定試紙條的批間重復性。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗

將同一批試紙卡密封后置于4 ℃以及室溫（22～25 ℃）環(huán)境中，每隔4周采用樣本稀釋液（空白對照）與狂犬病病毒標準陽性血清，對以上兩種環(huán)境中的試紙卡進行穩(wěn)定性測試，總共進行為期48周的測試。

1.3.5 符合率試驗

將本研究制備的狂犬病抗體膠體金免疫層析試紙卡對100份待測樣本進行檢測，同時結果與FAVN試驗的結果進行比對，檢測本研究制備的試紙卡的符合率。

2" 結果

2.1 試紙卡特異性評定

如圖1所示，利用組裝的膠體金免疫層析試紙卡檢測狂犬病病毒標準陽性血清、犬瘟熱病毒陽性血清、細小病毒陽性血清、犬冠狀病毒陽性血清、犬腺病毒陽性血清、犬副流感病毒陽性血清、犬輪狀病毒陽性血清和犬呼腸孤病毒陽性血清，包含空白對照。除狂犬病病毒標準陽性血清呈陽性外，其余皆呈現(xiàn)陰性。說明制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡具有良好的特異性。

2.2 試紙卡敏感性評定

如圖2所示，利用組裝的膠體金免疫層析試紙卡檢測不同稀釋倍數(shù)的狂犬病病毒標準陽性血清，當狂犬病病毒標準血清稀釋至0.5 IU/mL時，試紙條T線依舊可觀察到淺淡的顯色，檢測結果為陽性，說明制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡可檢測到標準陽性血清中0.5 IU/mL的狂犬病病毒抗體含量，具有良好的敏感性。

2.3 試紙卡重復性評定

對4份狂犬病病毒陽性血清樣本和4份狂犬病病毒陰性血清樣本的批內重復性試驗和批間重復性試驗的檢測結果均完全一致，表明組裝的試紙卡具有良好的重復性。

2.4 試紙卡穩(wěn)定性評定

第40周時，用放置于室溫（22～25 ℃）環(huán)境中的膠體金免疫層析試紙卡檢測狂犬病病毒標準陽性血清，結果顯示，質控線以及檢測線的顯色都明顯下降。用保存在4 ℃環(huán)境中的試紙卡檢測標準陽性血清，結果顯示，第48周時質控線以及檢測線的顯色較之前無差別。同時為期48周的試驗中，所有樣本稀釋液（空白對照）的檢測線皆不顯色。結果表明本研究制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡可在室溫（22～25 ℃）環(huán)境中穩(wěn)定保存36周，在4 ℃環(huán)境中可穩(wěn)定保存48周。

2.5 試紙卡符合率

本研究制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡對100份犬待檢血清的陽性檢出量為72份，陰性檢出量為28份，F(xiàn)AVN試驗的陽性檢出量為68份，陰性檢出量為32份。其中，本研究制備的試紙卡檢測出的72份陽性樣本中包含F(xiàn)AVN試驗檢測出的68份陽性樣本，因此該試紙卡的陽性符合率為100.0％，該試紙卡的陰性符合率為87.5％。同時兩種試驗檢測結果中有96份樣本的結果是相符合的，因此該研究制備的試紙卡的符合率為96.0％，說明該試紙卡具備良好的準確性。

3" 討論

本研究研制的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡可對血清中存在的狂犬病病毒性抗體進行特異性檢測，不與其他犬源病毒陽性血清以及陰性血清等發(fā)生交叉反應，具有高靈敏度（0.5 IU/mL）、高特異性、高穩(wěn)定性等特點。對于100份樣本的陽性判定率與FAVN的結果符合率高達96.0％。

為預防狂犬病病毒的傳播，可以采取對犬嚴格管控或對相關人員加強教育，但重要的方法是疫苗的接種。狂犬病病毒抗體的檢測是對狂犬病免疫水平監(jiān)測的重要手段。目前，雖然存在部分狂犬病病毒抗體膠體金試紙卡的應用文獻，但市場中效果較好的產(chǎn)品鮮有聞之。

當前已有的國內文獻對狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡的研發(fā)多采用金標廣譜性葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）或全病毒等方式[3-4]，但由于SPA的廣譜性，制備出的試紙卡具有較高的非特異性，同時采用金標全病毒雖然會提高試紙卡的靈敏度，但也會降低試紙卡的特異性。然而，評價膠體金免疫層析試紙卡好壞的關鍵指標是其特異性[4]，如若膠體金免疫層析試紙卡的假陽性太高，則無法投入使用。為了降低假陽性率，本研究采用了真核表達的狂犬病病毒G蛋白作為金標與包被的抗原，以雙抗原夾心的方式對狂犬病病毒抗體膠體金試紙卡進行研制?？袢〔《綠蛋白可直接影響狂犬病病毒的致病力，且位于狂犬病病毒表面，與機體中和抗體的產(chǎn)生息息相關[5]，因此，G蛋白具有很好的免疫原性[6]。這一做法使得狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡在具有高靈敏度的同時也具備了較好的特異性。

本研究制備的狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析試紙卡可用于臨床樣本中狂犬病病毒抗體檢測的定性分析，作為輔助性手段，對獲得免疫犬體內的抗體水平的定性判定提供了一定的助力以及參考依據(jù)。

參考文獻

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[3] 王鐵成，張濤，楊松濤，等．狂犬病病毒抗體膠體金檢測試紙的制備[J]．生物工程學報，2011，27（5）：799-804.

[4] 范曉娟，李剛，邱文英，等．膠體金免疫層析檢測犬、貓抗狂犬病病毒IgG抗體的研究[J]．中國人獸共患病學報，2010，26（8）：753-757.

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[6] CHABAUD-RIOU M，MORENO N，GUINCHARD F，et al．G-protein based ELISA as a potency test for rabies vaccines[J]．Biologicals，2017，46：124-129.