犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡的研制

摘" 要：本研究采用免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICGT），以犬細(xì)小病毒單克隆抗體作為膠體金的標(biāo)記物及檢測(cè)線診斷物、羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，制備犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡。結(jié)果顯示，制備的試紙卡可在10 min內(nèi)完成顯色，對(duì)其他犬源病毒不存在交叉反應(yīng)，具有較高的特異性；犬細(xì)小病毒滅活病毒液的梯度稀釋檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的試紙卡具有較高的靈敏度，可達(dá)到4×109 TCID50/mL；通過(guò)對(duì)50份樣本的檢測(cè)，并與PCR結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，符合率達(dá)92.00％；同時(shí)，試紙卡可在室溫（22～25 ℃）穩(wěn)定保存約8個(gè)月，在4 ℃環(huán)境中穩(wěn)定保存約10個(gè)月。本研究所制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡具有較高的敏感性、特異性、重復(fù)性與穩(wěn)定性，對(duì)犬細(xì)小病毒的臨床診斷評(píng)估具有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；抗原檢測(cè)；膠體金免疫層析

中圖分類號(hào)：S852.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）03-0018-05

犬病毒性腹瀉是危害犬的一種重要疾病[1]，其中犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）是導(dǎo)致犬健康問(wèn)題的常見(jiàn)的病原體，引起了獸醫(yī)相關(guān)行業(yè)從業(yè)者和犬飼養(yǎng)者的極大關(guān)注。CPV屬于細(xì)小病毒科，是一種具有二十面體結(jié)構(gòu)的無(wú)包膜DNA病毒，直徑約25 nm，包含約5 kb的線性單鏈基因組[2]。CPV是引起犬（尤其是幼犬）死亡和發(fā)病的重要原因之一[3]，病毒在傳播過(guò)程中還會(huì)發(fā)生重組、變異和繼發(fā)感染等情況，因此對(duì)CPV的預(yù)防、檢測(cè)和控制應(yīng)加以重視[4]。

目前，對(duì)CPV的預(yù)防多采用疫苗注射的方式。對(duì)CPV的檢測(cè)常采用分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。其中PCR為常采用的分子生物學(xué)手段，具有高準(zhǔn)確性，同時(shí)可以對(duì)感染進(jìn)行分類。血紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICGT）等為CPV主要的免疫學(xué)檢測(cè)手段[5]。

然而，PCR與ELISA檢測(cè)需要大量的時(shí)間、儀器與相關(guān)專業(yè)背景知識(shí)，血紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)又受紅細(xì)胞狀態(tài)的直接影響，因此，本研究以ICGT技術(shù)為基礎(chǔ)，采用抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體為原料，制作出了犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡。該方法具有快速、簡(jiǎn)便和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)與當(dāng)下的結(jié)果定性判定，對(duì)CPV的抗原監(jiān)測(cè)以及相關(guān)流行病學(xué)的調(diào)查具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1 材料

氯金酸（AuCl4H）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自Sigma公司，檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硝酸纖維素膜購(gòu)自Sartrious公司，玻璃纖維膜和吸水紙購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，PVC板購(gòu)自南通浩杰特貿(mào)易有限公司，犬細(xì)小病毒單克隆抗體以及羊抗鼠IgG、犬細(xì)小病毒滅活病毒液（1×106 TCID50/mL）、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存并提供，20份犬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣本、20份犬細(xì)小病毒陰性樣本（通過(guò)PCR檢驗(yàn)）以及50份犬臨床眼、鼻分泌物待檢樣本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡的制備

1.2.1 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法對(duì)膠體金溶液進(jìn)行制備。取100 mL超純水于250 mL錐形瓶中，隨后加入1.0 mL 1.0％氯金酸溶液，并置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌并加熱至沸騰。在攪拌過(guò)程中，快速加入1.6 mL 1.0％檸檬酸三鈉溶液，可觀察到溶液逐漸由淺黃色變?yōu)橥该?，又變?yōu)榛液谏?，最后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱20 min，加熱結(jié)束后持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，最后加入超純水定容至100 mL，置于棕色瓶中 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金-抗原復(fù)合物的制備

取1.2.1制備的膠體金溶液20 mL，加入超純水潤(rùn)洗后的燒杯中，一邊快速攪拌一邊滴加一定量的0.2 M K2CO3溶液，調(diào)整溶液pH至8.0，隨后加入62.5 μL抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體（3.2 mg/mL），繼續(xù)攪拌20 min，再加入終濃度為0.5％的BSA，繼續(xù)攪拌20 min。4 ℃ 8 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀溶于含5％蔗糖的磷酸緩沖液（0.05 mol/L）中，置于棕色瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫層析試紙卡的制備

該試紙條由樣本墊、金標(biāo)物結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和粘有一層聚氯乙烯片材作為襯膜的塑料聚乙烯板組成。將玻璃纖維用含 0.5％ BSA、1％聚乙烯吡咯烷酮-40、0.5％表面活性劑S9（tetronic 1307）的Tris-HCL緩沖液（0.02 mol/L）封閉后，置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上，即為樣本墊。將膠體金-抗原復(fù)合物噴涂于金標(biāo)物結(jié)合釋放墊上，并進(jìn)行真空干燥。將羊抗鼠IgG抗體（1 mg/mL）和犬細(xì)小病毒單克隆抗體（1.5 mg/mL）分別包被為硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線和檢測(cè)線，隨后置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上。將以上組分按照樣本墊、金標(biāo)物結(jié)合釋放墊、硝酸纖維膜以及吸水墊的順序依次粘在塑料聚乙烯板上，切成寬為" "2.8 mm的試紙卡，加干燥劑密封，室溫保存。

1.2.4 樣本的檢測(cè)

將樣本與樣本稀釋液分別滴入組裝好的試紙卡中，8～10 min后觀察結(jié)果。試紙卡纖維膜上出現(xiàn)2條紅色線判為陽(yáng)性；僅質(zhì)控線區(qū)出現(xiàn)1條紅色線判為陰性；質(zhì)控線區(qū)沒(méi)有出現(xiàn)紅色線視為結(jié)果無(wú)效。

1.3 犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡的評(píng)價(jià)

1.3.1 特異性評(píng)定

采用同一批次的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡分別對(duì)犬細(xì)小病毒滅活病毒液、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液進(jìn)行特異性評(píng)定。

1.3.2 敏感性評(píng)定

將犬細(xì)小病毒滅活病毒液（1×106 TCID50/mL）用生理鹽水依次以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512的比例稀釋，并設(shè)置空白對(duì)照組（生理鹽水），分別加入樣本孔中，以評(píng)定試紙卡的敏感性。

1.3.3 重復(fù)性評(píng)定

選取4份犬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣本和4份犬細(xì)小病毒陰性樣本，每份樣本平行做3個(gè)重復(fù)，用同一批次犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的批內(nèi)重復(fù)性。

選取4份犬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣本和4份犬細(xì)小病毒陰性樣本，每份樣本平行做3個(gè)重復(fù)，用3批不同批次的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的批間重復(fù)性。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將同一批試紙卡密封后置于4 ℃以及室溫（22～25 ℃）環(huán)境中，每隔30 d采用空白對(duì)照（生理鹽水）與同一批次的犬細(xì)小病毒滅活病毒液，對(duì)以上兩種環(huán)境中的試紙卡進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，總共進(jìn)行為期12個(gè)月的測(cè)試。

1.3.5 符合率試驗(yàn)

將本研究制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡對(duì)50份待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果與PCR的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)制備的試紙卡的符合率。

2" 結(jié)果

2.1 試紙卡特異性評(píng)定

如圖1所示，利用組裝的犬細(xì)小病毒膠體金試紙卡檢測(cè)犬細(xì)小病毒滅活病毒液、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液和生理鹽水（空白對(duì)照）。除犬細(xì)小病毒滅活病毒液呈陽(yáng)性外，其余皆呈陰性，說(shuō)明制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡具有良好的特異性。

2.2 試紙卡敏感性評(píng)定

如圖2所示，利用組裝的膠體金試紙卡檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)的犬細(xì)小病毒滅活病毒液，當(dāng)犬細(xì)小病毒滅活病毒液稀釋至1∶256時(shí)，試紙條T線依舊可以觀察到淺淡的顯色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡可以檢測(cè)到4×109 TCID50/mL，具有良好的敏感性。

2.3 試紙卡重復(fù)性評(píng)定

對(duì)4份犬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣本和4份犬細(xì)小病毒陰性樣本進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均完全一致，表明組裝的試紙卡具有良好的重復(fù)性。

2.4 試紙卡穩(wěn)定性評(píng)定

第8個(gè)月時(shí)，用在室溫（22～25 ℃）環(huán)境中保存的膠體金免疫層析試紙卡檢測(cè)犬細(xì)小病毒滅活病毒液，結(jié)果顯示，質(zhì)控線以及檢測(cè)線的顯色效果有所下降，但并不明顯。然而，用在4 ℃環(huán)境中保存的試紙卡檢測(cè)犬細(xì)小病毒滅活病毒液，結(jié)果顯示，質(zhì)控線以及檢測(cè)線的顯色水平較之前無(wú)差別，但在第10個(gè)月時(shí)出現(xiàn)了質(zhì)控線和檢測(cè)線顯色效果皆下降的現(xiàn)象。在第12個(gè)月時(shí)，兩種溫度環(huán)境條件下的試紙卡的檢測(cè)線顯色都較之前更弱，不可再用于試驗(yàn)檢測(cè)。同時(shí)，在為期12個(gè)月的試驗(yàn)中，所有樣本稀釋液（空白對(duì)照）的檢測(cè)線皆不顯色。結(jié)果表明，本研究制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡在室溫（22～25 ℃）環(huán)境下可穩(wěn)定保存約8個(gè)月，在4 ℃環(huán)境中可穩(wěn)定保存約10個(gè)月。

2.5 試紙卡符合率

本研究制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡對(duì)50份犬待檢血清的陽(yáng)性檢出量為38份，陰性檢出量為12份，PCR試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出量為42份，陰性檢出量為8份。其中，PCR試驗(yàn)檢測(cè)出的42份陽(yáng)性樣本包含試紙卡檢測(cè)出的38份陽(yáng)性樣本，因此該試紙卡的陽(yáng)性符合率為90.48％。同時(shí)試紙卡檢測(cè)出的12份陰性樣本包含了8份PCR試驗(yàn)檢測(cè)出的陰性樣本，因此該試紙卡的陰性符合率為100.00％。同時(shí)，在兩項(xiàng)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果中，46份樣本的檢測(cè)結(jié)果是相符合的，因此該研究制備的試紙卡的符合率為92.00％，說(shuō)明該試紙卡具備良好的準(zhǔn)確性。

3" 討論

犬細(xì)小病毒在我國(guó)乃至全世界廣泛傳播，尤其對(duì)幼犬影響較大，受到了獸醫(yī)和寵物飼養(yǎng)人員的廣泛關(guān)注。雖然可以對(duì)犬采取嚴(yán)格的管控，對(duì)相關(guān)人員加強(qiáng)培訓(xùn)，但對(duì)犬細(xì)小病毒有效的預(yù)防方法是接種疫苗。犬一旦感染細(xì)小病毒，治愈率低，死亡率高[6]，同時(shí)治療成本以及相關(guān)費(fèi)用也特別高。因此，對(duì)犬細(xì)小病毒進(jìn)行早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)以及早治療，對(duì)犬的健康十分重要。

ICGT作為病原體免疫診斷中常用的檢測(cè)手段，具有時(shí)效性高、準(zhǔn)確性高以及實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，常被用于病原體的臨床檢測(cè)及流行病學(xué)的調(diào)查。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，CPV存在多個(gè)相同的抗原表位[7]，因此可以采用同一單克隆抗體制作犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡。本研究研制的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡可對(duì)犬的排泄物或嘔吐物進(jìn)行犬細(xì)小病毒特異性檢測(cè)，不與其他犬源性病毒以及陰性樣本等發(fā)生交叉反應(yīng)。同時(shí)，該試紙卡具有靈敏度高、最低檢測(cè)限高（4×109 TCID50/mL）的特點(diǎn)。通過(guò)本研究制作的試紙卡可在常溫與4 ℃的環(huán)境中保存半年以上，具有較高的穩(wěn)定性。該試紙卡對(duì)樣本的測(cè)試結(jié)果與PCR測(cè)試結(jié)果的總體符合率高達(dá)92.00％。

通過(guò)本研究制備的犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙卡可用于臨床樣本中犬細(xì)小病毒檢測(cè)的定性分析，可對(duì)CPV的治療以及CPV的流行病學(xué)調(diào)查提供有效的輔助手段。

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*通信作者：蔣永青（1981－ ），碩士研究生，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病快速檢測(cè)及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)