貴州本土微生物牛發(fā)酵床不同深度微生物組成研究

摘" 要：為了研究貴州本土微生物牛發(fā)酵床的微生物多樣性及微生物組成情況，推動(dòng)綠色生態(tài)養(yǎng)牛技術(shù)及提高養(yǎng)牛糞污綜合利用率，本試驗(yàn)采集貴州本土微生物牛發(fā)酵床多位點(diǎn)不同深度樣本，并對(duì)發(fā)酵床中所含發(fā)酵菌進(jìn)行宏基因組測(cè)序，分析其Shannon、Chao、Ace、Simphan等微生物多樣性指數(shù)以及微生物在屬水平、種水平上的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴州本土微生物牛發(fā)酵床中層和表層墊料中的微生物多樣性顯著高于底層墊料中的（P＜0.05）；屬水平上的微生物主要以小單孢菌屬、球形桿菌屬和鏈霉菌屬的細(xì)菌等為主；種水平上的以變形桿菌、類(lèi)細(xì)菌、綠彎菌、放線桿菌、嗜熱球形桿菌等為主。研究結(jié)果表明，貴州本土微生物牛發(fā)酵床表層及中層微生物多樣性較高，發(fā)酵床底層較表層和中層可能具有更好的抑菌效果和氨基酸合成效率，本研究進(jìn)一步論述了本土微生物牛發(fā)酵床微生物組成情況，以助推綠色生態(tài)養(yǎng)殖模式可持續(xù)發(fā)展。

關(guān)鍵詞：貴州本土微生物；牛發(fā)酵床；發(fā)酵床微生物；發(fā)酵床宏基因組

中圖分類(lèi)號(hào)：S815.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）03-0010-04

發(fā)酵床技術(shù)于2000年引入我國(guó)北方地區(qū)，用于開(kāi)展養(yǎng)豬、養(yǎng)牛、養(yǎng)雞等生產(chǎn)工作[1]，主要采用單一菌種接種發(fā)酵床，初步具有除臭發(fā)酵的基本功效。隨著養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的需求，原先單一菌種發(fā)酵床逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合菌種發(fā)酵床。但是，受復(fù)合菌種的選擇及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等因素的影響，發(fā)酵床常出現(xiàn)死床現(xiàn)象[2]。顧亞蘭等[3]發(fā)現(xiàn)采用不同菌種的發(fā)酵床對(duì)牛的健康和墊料均有一定的影響，發(fā)酵床采用酵母菌和乳酸菌按2∶1的比例配制成的發(fā)酵菌后，其相對(duì)濕度低于以復(fù)合芽孢桿菌為發(fā)酵菌的試驗(yàn)組發(fā)酵床的，且優(yōu)勢(shì)菌群顯著。張學(xué)峰等[4]研究不同深度的墊料對(duì)養(yǎng)豬土著微生物發(fā)酵床穩(wěn)定期微生物菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 cm處為發(fā)酵床的核心發(fā)酵層，同時(shí)也是土著微生物的主要分布區(qū)域，在其穩(wěn)定期土著微生物發(fā)酵床各層的菌種分布主要受外界環(huán)境變化的影響。

貴州的地質(zhì)屬于喀斯特地貌，有著十里不同天、晝夜溫差變化大、高寒高濕的氣候特點(diǎn)[5]。同時(shí)，貴州也是養(yǎng)牛大省。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2023年貴州省共存欄536.68萬(wàn)頭牛，出欄128.94萬(wàn)頭牛[6]，發(fā)酵床養(yǎng)牛模式也是貴州主要的養(yǎng)牛生產(chǎn)模式之一，但大多數(shù)牛場(chǎng)常出現(xiàn)死床現(xiàn)象。Sun等[8]研究喀斯特地貌中真菌對(duì)植物的影響，結(jié)果表明本土微生物復(fù)合菌劑較商業(yè)菌劑具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。本研究擬通過(guò)使用貴州本土微生物菌群制作牛發(fā)酵床來(lái)開(kāi)展養(yǎng)牛生產(chǎn)試驗(yàn)，以探明發(fā)酵床不同深度的墊料中微生物多樣性及微生物組成情況，進(jìn)而為利用本土微生物發(fā)酵床養(yǎng)牛打下基礎(chǔ)，提高養(yǎng)牛業(yè)糞污綜合利用率，加快綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展。

1" 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)從貴州省紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)賢會(huì)家庭農(nóng)場(chǎng)牛發(fā)酵床采集樣本，其發(fā)酵床接種的貴州本土微生物分別是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母等10余種微生物組成，這些微生物分別分離自紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)土壤、落葉、發(fā)酵制品、淤泥、水體、動(dòng)物發(fā)酵糞等樣本。試驗(yàn)分別在牛發(fā)酵床的表層（0～20 cm）、中層（20～35 cm）、底層（35～50 cm）采集墊料樣本，共計(jì)9份樣本，采集好的樣本裝入50 mL無(wú)菌的離心管中，加入15％無(wú)菌甘油，放置－20 ℃冰盒中送往蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物宏基因組測(cè)序。

1.2 測(cè)序引物及多樣性分析

基于Illumina NovaSeq/HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，采用全基因組鳥(niǎo)槍法（whole genome shotgun，WGS）策略，將提取到的菌群宏基因組總DNA，或宏轉(zhuǎn)錄組（以mRNA為模板合成的cDNA雙鏈），隨機(jī)打斷為短片段，并構(gòu)建合適長(zhǎng)度的片段文庫(kù)，對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙端（paired-end，PE）測(cè)序。每個(gè)樣本構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)。采用Cutadapt（Vol.1.17）識(shí)別3'端潛在的接頭序列（極少數(shù)測(cè)通的情況會(huì)出現(xiàn)），并在識(shí)別的接頭序列處截?cái)?。要求與接頭序列（R1：AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA；R2：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT）的匹配長(zhǎng)度至少達(dá)到3 bp，且控制不超過(guò)20％堿基錯(cuò)配率。

測(cè)序原始數(shù)據(jù)以存儲(chǔ)核酸序列（FASTQ格式）保存，使用R 3.5.2軟件，分析發(fā)酵床不同深度處墊料中菌群的α多樣性及種水平、屬水平上的微生物組成，且對(duì)各樣本中的優(yōu)勢(shì)物種（此處取總體豐度位于前20位的物種）在各分類(lèi)水平下繪制柱狀圖。通過(guò)Shannon、Simpson、ACE、Chao指數(shù)評(píng)估菌群中實(shí)際存在的物種數(shù)以及菌群的多樣性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用R 3.5.2軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS Vol.20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 2018制作微生物多樣性圖。

2" 結(jié)果

2.1 貴州本土微生物養(yǎng)牛發(fā)酵床不同深度處墊料中微生物多樣性研究

圖1顯示，貴州本土微生物牛發(fā)酵床中層墊料中微生物的Shannon指數(shù)顯著高于表層及底層墊料中微生物的（P＜0.05），表層和中層墊料中微生物的Chao、ACE、Simpson指數(shù)顯著高于底層墊料中微生物的（P＜0.05），表明本土微生物牛發(fā)酵床表層及中層墊料中的微生物多樣性高于底層墊料中的。

2.2 貴州本土微生物發(fā)酵床不同深度處墊料中微生物組成研究

由圖2可知，貴州本土微生物牛發(fā)酵床墊料中的發(fā)酵菌，在屬水平上主要以小單孢菌屬、球形桿菌屬、鏈霉菌屬的細(xì)菌等為主，并且底層墊料中小單孢菌屬、球形桿菌屬菌種的表達(dá)量顯著高于表層和中層墊料中的（P＜0.05）；在種水平上以變形桿菌、類(lèi)細(xì)菌、綠彎菌、放線桿菌、嗜熱球形桿菌等為主，底層墊料中的類(lèi)細(xì)菌差異高于表層和中層墊料中的（P＜0.05）。

3" 討論

通過(guò)對(duì)貴州本土微生物牛發(fā)酵床不同深度的墊料進(jìn)行采樣以及對(duì)墊料中所含發(fā)酵菌進(jìn)行宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在本土微生物牛發(fā)酵床中，表層及中層墊料中的微生物多樣性高于底層墊料中的，這表明表層和中層墊料是牛發(fā)酵床的核心發(fā)酵區(qū)，研究結(jié)果與鄭超超[9]的研究結(jié)果相同，后者也發(fā)現(xiàn)糞污主要在發(fā)酵床的中上層區(qū)域進(jìn)行發(fā)酵，由多種微生物協(xié)同發(fā)酵，使發(fā)酵床可持續(xù)運(yùn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵床底層墊料中小單孢菌屬、球形桿菌屬細(xì)菌的表達(dá)量高于表層和中層墊料中的。研究表明小單孢菌屬、放線菌屬細(xì)菌是發(fā)酵床中重要的微生物群落，是生物活性次生代謝產(chǎn)物的資源庫(kù)[10]。小單孢菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的大量磷霉素是一種廣譜抗生素，主要通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，使細(xì)菌的細(xì)胞壁缺損，從而導(dǎo)致細(xì)菌失去細(xì)胞壁的保護(hù)，致使菌體膨脹裂解，起到殺菌作用[11]。球形桿菌屬細(xì)菌可以合成多種轉(zhuǎn)氨酶，同時(shí)具有高溫穩(wěn)定性，主要合成ω-轉(zhuǎn)氨酶，以促進(jìn)氨基酸殘基合成β和γ氨基酸。這表明貴州本土微生物牛發(fā)酵床主要在底層墊料中進(jìn)行病原菌殺滅及合成代謝酶。

4" 結(jié)論

本研究表明，貴州本土微生物牛發(fā)酵床表層和中層墊料中的微生物多樣性較高，發(fā)酵床底層較表層和中層可能具有更好的抑菌效果以及氨基酸合成效率。

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基金項(xiàng)目：基于生豬糞污生物降解地方微生物資源的研究（項(xiàng)目編號(hào)：黔科合[2023]一般474號(hào)）；農(nóng)作物秸稈綜合利用（項(xiàng)目編號(hào)：P52000020230009V6）；農(nóng)業(yè)秸稈發(fā)酵床養(yǎng)豬推廣應(yīng)用（項(xiàng)目編號(hào)：黔南科合[2023]24號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：任麗群（1990－ ），女，碩士，高級(jí)畜牧師，主要從事畜牧技術(shù)推廣和育種繁殖技術(shù)研究；E-mail：1007717538@qq.com

*通信作者：燕志宏（1961－ ），本科，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種資源開(kāi)發(fā)研究；E-mail： 2321462718@qq.com