堿脅迫下內(nèi)生真菌共生對布頓大麥抗氧化酶和ASA-GSH循環(huán)的影響

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌：布頓大麥：堿脅迫；抗氧化酶；ASA-GSH循環(huán)

我國鹽堿地面積約9900萬hm2，嚴(yán)重限制我國農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。禾本科牧草種植不僅可以提高土地利用率，還能平衡土壤養(yǎng)分、提高光能利用率以及助力綠色生態(tài)發(fā)展。目前就禾本科牧草的區(qū)域試驗、引種栽培、內(nèi)生真菌的影響等方面均已開展相關(guān)研究。布頓大麥?zhǔn)呛瘫究疲℅ramine-ae）大麥屬多年生草本植物，具有較好的耐鹽堿性。南志標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，布頓大麥可被內(nèi)生真菌侵染。本研究所用到的內(nèi)生真菌主要是真菌，該菌在宿主植物中度過整個或大部分生活史，但卻并不使宿主植物表現(xiàn)出任何外在癥狀。目前對布頓大麥一內(nèi)生真菌的研究多集中在抗病、抗蟲、耐鹽堿等方面。

生長在鹽堿環(huán)境中的植物體內(nèi)一般會產(chǎn)生活性氧（ROS），高濃度的活性氧通常會作為信號分子誘導(dǎo)植物氧化損傷和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，致使光合作用明顯降低。為了解除活性氧的毒害作用，鹽生植物會通過調(diào)節(jié)防御系統(tǒng)中的抗氧化酶活性提高其抗氧化應(yīng)激能力。有研究表明，植物在受到逆境脅迫時其抗氧化酶活性會升高以抵抗高濃度活性氧的傷害。喬新榮等研究發(fā)現(xiàn)，除了抗氧化酶的作用，抗壞血酸一谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)在植物抗逆過程中也扮演著重要角色：當(dāng)植物受到堿脅迫時，超氧化物歧化酶（SOD）能對抗堿脅迫造成的離子失衡問題，過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化物酶（POD）等多種酶能將H202還原為水。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）可以利用谷胱甘肽（GSH）還原H202，催化清除ROS；谷胱甘肽還原酶（GR）能將氧化型的谷胱甘肽（GSSG）催化還原為還原型的谷胱甘肽（GSH）。

鹽脅迫環(huán)境下，內(nèi)生真菌侵染可以提高宿主植株的抗氧化能力，但堿脅迫條件下內(nèi)生真菌對宿主布頓大麥體內(nèi)抗氧化酶活性的影響鮮見報道。本試驗通過分析堿脅迫下帶菌、不帶菌布頓大麥莖葉SOD、POD、CAT、GR、GPX、APX活性和GSH含量的差異，探究堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥的抗氧化性和ASA-GSH循環(huán)的影響，以期為合理利用內(nèi)生真菌共生體進(jìn)行禾本科牧草抗逆新種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

布頓大麥種子于2019-2020年采自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣（79°28'～81°30' E，40°52～42°15' N，海拔1132m）。將收集到的帶菌種子的一半用真菌殺菌劑處理獲得同質(zhì)不帶菌種子。

1.2試驗設(shè)計及方法

待帶菌和不帶菌的布頓大麥種子發(fā)芽后移栽至裝有蛭石和珍珠巖（體積比4：1）的盆中，做好標(biāo)記，在塔里木大學(xué)實驗站的溫室大棚內(nèi)培育。期間白天溫度（28+2）℃，夜間溫度（12+2）℃，定期澆灌Hoaglang營養(yǎng)液以保證其正常生長。

布頓大麥生長6周后（分蘗期），用苯胺藍(lán)染色法檢測內(nèi)生真菌。帶菌的記為E+，不帶菌的記為E-。檢菌后兩周，設(shè)置0、25、50、100、150、200mmol/L混合堿（摩爾濃度比Na，C03：NaHC03=1：1）溶液共6個處理，對布頓大麥進(jìn)行不同濃度堿脅迫，分別標(biāo)記為CK、AT1、AT2、AT3、AT4、AT5。每處理重復(fù)6次。

為防止堿激增造成的作物應(yīng)激現(xiàn)象，對布頓大麥進(jìn)行漸進(jìn)式堿溶液澆灌處理，每次澆灌相同體積的溶液，其中CK為等量清水。配制不同濃度的混合堿溶液，對布頓大麥進(jìn)行漸進(jìn)式堿溶液澆灌處理，每天以25mmol/L濃度梯度遞增，直至達(dá)到相應(yīng)設(shè)定濃度，之后各濃度連續(xù)澆施21d進(jìn)行堿脅迫處理。對脅迫處理后的布頓大麥莖、葉進(jìn)行采樣并稱重后放人自封袋，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測定指標(biāo)及方法

1.3.1酶液制備取樣品0.2g，加入適量的磷酸緩沖液冰浴研磨后倒人離心管，3000r/min離心10min，上清液即為酶液，轉(zhuǎn)入10mL離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2相關(guān)酶活性測定POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定：SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測定：CAT活性用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的生化試劑盒及紫外分光光度法測定：APX活性用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒及紫外分光光度法測定；GSH含量、GPX活性用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒及可見分光光度法測定：GR活性用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒及紫外分光光度法測定。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用雙因素方差分析法檢測堿處理和內(nèi)生真菌對莖、葉SOD、POD．CAT、GR、GPX、APX活性和GSH含量的影響，采用獨立樣本t檢驗法檢測同一堿濃度下E+和E-對SOD、POD、CAT活性影響的差異。用SigmaPlot 14.0軟件作圖。圖中數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥莖葉抗氧化酶活性的影響

2.1.1對SOD活性的影響由圖1可知，相同濃度堿處理下，E+布頓大麥葉片SOD活性均顯著高于E-布頓大麥。不同濃度堿脅迫下，E+和E-布頓大麥葉片SOD活性隨堿濃度升高均呈先升高后降低趨勢，且均在AT2處理下達(dá)到最高。表明內(nèi)生真菌能有效提高布頓大麥葉片SOD活性。

2.1.2對POD活性的影響由圖1可知，相同濃度堿脅迫下，E+布頓大麥葉片POD活性均顯著低于E-布頓大麥，E+和E-布頓大麥葉片POD活性隨堿濃度升高均呈先升高后降低趨勢。

相同濃度堿處理下，除AT5處理的E+布頓大麥莖POD活性顯著高于E-布頓大麥外，其余處理的E+均顯著低于E-。隨堿濃度增大，E+布頓大麥莖POD活性呈先升后降再升的趨勢，而E-布頓大麥呈先升后降趨勢。

2.1.3對CAT活性的影響由圖1可知，相同濃度堿處理下，E+布頓大麥葉片CAT活性均高于E-，且除AT2組外，其余處理組的E+與E-布頓大麥葉片CAT活性間差異顯著。E+和E-布頓大麥葉片CAT活性隨堿濃度升高均呈先升后降趨勢，且均在AT，處理下達(dá)到最高。

相同濃度堿處理下，E+布頓大麥莖CAT活性均高于E-且在CK、AT4、AT；處理下差異顯著。AT處理各組的莖CAT活性均顯著低于CK，E+和E-布頓大麥莖CAT活性隨堿濃度升高均整體呈下降趨勢。

2.2堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥葉片抗壞血酸一谷胱甘肽（ ASA-GSH）循環(huán)的影響

2.2.1對APX活性的影響由圖2可知，相同濃度堿處理下，E+布頓大麥葉片APX活性均比E-高，且在CK、AT2、AT3、AT5處理下差異顯著。E+布頓大麥葉片APX活性隨堿濃度升高呈先升高后降低趨勢，AT2處理下達(dá)到最高，AT4處理后趨于平穩(wěn)：E-布頓大麥葉片APX活性隨堿濃度升高呈現(xiàn)升高一降低一趨于平穩(wěn)一降低的趨勢，AT1處理下達(dá)到最高，AT5處理較AT4顯著降低。

2.2.2對GR活性的影響由圖2可知，相同濃度堿處理下，E+布頓大麥葉片GR活性均顯著低于E-0E+布頓大麥葉片GR活性隨堿濃度升高呈現(xiàn)降低一升高一降低并趨于平穩(wěn)的趨勢，CK活性最高，AT２處理次之；E-布頓大麥葉片GR活性隨堿濃度升高呈現(xiàn)降低一升高一降低一升高的趨勢，CK活性最高，AT3、AT1處理次之。各AT處理E+和E-布頓大麥葉片GR活性均顯著低于對照。

2.2.3對GPX活性的影響由圖2可知，E+布頓大麥葉片GPX活性在CK、ATi和AT。處理下均顯著高于E-，但在AT3、AT4和AT5處理下則顯著低于E-。E+布頓大麥葉片GPX活性隨堿濃度升高呈現(xiàn)升高一降低一升高的趨勢，AT2處理下達(dá)到最高：E-布頓大麥葉片GPX活性隨堿濃度升高呈現(xiàn)升高一降低并趨于平穩(wěn)的趨勢，AT2處理下達(dá)到最高。

2.2.4對GSH含量的影響由圖2可知，相同濃度堿處理下，E+布頓大麥葉片GSH含量均顯著高于E-。E+和E-布頓大麥葉片GSH含量隨堿濃度升高均呈先升高后降低再升高的趨勢。E+布頓大麥葉片GSH含量在AT2處理下達(dá)到最高，而E-則在AT1處理下達(dá)到最高。

3討論

有研究表明，當(dāng)植物受到生物或非生物脅迫時，其抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量也會受到一定的影響。堿脅迫環(huán)境下，隨著堿濃度增加植物體內(nèi)的理化性質(zhì)也會隨之變化，會使植株體內(nèi)的活性氧含量增加進(jìn)而加劇植物體內(nèi)的氧化反應(yīng)。植物可以通過提高自身的抗氧化酶活性來清除體內(nèi)多余的活性氧從而抵抗氧化反應(yīng)，進(jìn)而提高其抗逆性?；钚匝醯姆e累會加速植株衰老與死亡，因此研究堿脅迫下內(nèi)生真菌對宿主植物抗氧化性的影響尤為重要。本研究得出，堿脅迫條件下，E+布頓大麥的SOD、CAT活性以及ASA-GSH系統(tǒng)中除GR活性和高濃度堿脅迫處理（AT3、AT4、ATs）下GPX活性外的其他指標(biāo)均大于E-的相應(yīng)指標(biāo)值。

SOD作為植物體內(nèi)清除氧自由基的重要酶類之一，是清除ROS的第一道防線，是一種典型的誘導(dǎo)酶。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著堿濃度增加，E+與E-布頓大麥葉片的SOD活性均先升高后降低，但E+植株的SOD活性均顯著高于E-植株，這與前人研究結(jié)果一致。表明內(nèi)生真菌侵染布頓大麥后促進(jìn)SOD產(chǎn)生，使得E+植株中的SOD活性高于E-植株。但堿濃度過大時SOD活性有所下降，這可能是因為堿濃度過大使得細(xì)胞內(nèi)的活性氧增多，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而使SOD活性受到抑制。

POD可以使植物體內(nèi)的過氧化氫轉(zhuǎn)化為活性較低的物質(zhì)，是植物體內(nèi)清除多余過氧化氫和有毒物質(zhì)的重要酶類之一。本研究得出，E+布頓大麥的POD活性比E-低（ATs處理的莖除外）。這與陳水紅等對高羊茅和任安芝等對黑麥草的相關(guān)研究結(jié)果基本一致。但與陳水紅關(guān)于內(nèi)生真菌侵染野大麥的研究結(jié)果不一致，這可能是由菌系或植物基因型不同等引起的。隨著堿濃度增加，E+布頓大麥POD活性與E-植株的差距整體逐漸縮小，ATs處理莖的POD活性甚至高于E-。綜上表明，堿脅迫處理下，E+布頓大麥植株對堿性環(huán)境的適應(yīng)性更強。

CAT是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要物質(zhì)，它可以催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧。本研究結(jié)果顯示，在堿脅迫環(huán)境下E+布頓大麥的CAT活性比E-的高，表明堿脅迫下內(nèi)生真菌可以提高宿主植株的抗氧化能力，進(jìn)一步提高布頓大麥的抗堿性。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似：Chen等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌侵染野大麥植株的CAT活性可以提高4%～16%；對水稻幼苗進(jìn)行鹽脅迫時，內(nèi)生真菌處理下CAT等抗氧化酶的活性會顯著提高，以此來抵抗植株受到的活性氧危害；堿脅迫下，內(nèi)生真菌能提高木麻黃幼苗SOD、CAT等的活性，進(jìn)而提高其抗鹽能力。

ASA-GSH循環(huán)是存在于植物體內(nèi)清除H202的重要途徑。APX有助于清除H202使其還原為H20。本研究結(jié)果表明，在堿脅迫條件下，E+布頓大麥葉片的APX活性均高于E-，表明堿脅迫環(huán)境下內(nèi)生真菌可提高植株體內(nèi)的APX活性，從而提高其清除H202的能力，進(jìn)一步提高植物的抗堿性。GSH含量也是衡量植株抗逆境生長能力的一個重要指標(biāo)。堿脅迫下，E+布頓大麥葉片GSH含量明顯高于E-，表明堿脅迫下內(nèi)生真菌可提高植株體內(nèi)的GSH含量，使得ASA-GSH循環(huán)口快清除活性氧，更好地抵御逆境。在非生物脅迫條件下對大麥等進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，植株可通過增加GSH和ASA或減少GSSG和脫氫抗壞血酸（DHA）來維持高比例的GSH／GSSG或ASA／DHA，這可能是保護其有效減少非生物脅迫誘導(dǎo)的ROS積累并增強抗氧化能力的重要過程。內(nèi)生真菌侵染能夠顯著提高布頓大麥葉片GSH含量，故推測E+布頓大麥的GSH／GSSG值可能高于E-，這有助于宿主及時清除ROS。GPX是植物體內(nèi)催化過氧化氫分解的酶，也是使GSH轉(zhuǎn)化為GSSG的重要酶，起到保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本研究結(jié)果表明，低堿濃度時E+布頓大麥葉片GPX活性顯著高于E-，當(dāng)堿濃度達(dá)到100mmol／L（AT3）后，GPX活性迅速下降且E+顯著低于E-，分析可能的原因是堿濃度過高使得GSH合成受阻。各處理下E+布頓大麥葉片GR活性均顯著低于E-，推測可能是植株為了維持高比例的GSH／GSSG，內(nèi)生真菌調(diào)節(jié)了GPX活性，使E+植株的低于E-，進(jìn)而減少GSSG生成量，增加GSH的積累量，提高GSH/GSSG比例，促進(jìn)宿主抗堿脅迫逆境能力的提升。

4結(jié)論

與內(nèi)生真菌共生能夠提高布頓大麥抗氧化能力并改善其ASA-GSH循環(huán)：內(nèi)生真菌提高布頓大麥SOD、CAT、APX活性，增加葉片GSH含量，抑制POD、GR活性；低濃度（≤100mmol/L）堿脅迫下，內(nèi)生真菌侵染促進(jìn)宿主布頓大麥葉片GPX活性提升，高濃度（gt;100mmol/L）堿脅迫下則表現(xiàn)為抑制。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步開展內(nèi)生真菌共生對布頓大麥ASA-GSH循環(huán)和抗氧化能力影響的研究及抗逆新種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。