超高壓處理芝麻蛋白制備甘油二酯乳液及其消化和氧化特性研究

摘 要：植物油粕中所含蛋白的溶解性較差，難以直接作為乳化劑用于食品乳液體系.本文通過超高壓處理，改善芝麻蛋白的功能特性，用于以甘油二酯為油相的O/W乳液體系，研究其體外消化和氧化特性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同消化階段，300 MPa超高壓處理芝麻蛋白所得兩種乳液的粒徑均較小，脂肪酸釋放率較高.經(jīng)14 d儲存后，初級、次級油脂氧化產(chǎn)物的含量均升高，300 MPa處理芝麻蛋白制備的乳液較易氧化.同甘油三酯乳液相比，甘油二酯乳液體系呈現(xiàn)更高的消化和氧化特性.

關(guān)鍵詞：芝麻蛋白； 甘油二酯； 乳液； 消化性， 氧化性

中圖分類號：TS201.2

文獻標(biāo)志碼： A

Study on the digestion and oxidation of diacylglycerol emulsion preparedby sesame protein treated with high hydrostatic pressure

LIU Ning， XUE Xiao-ting， ZHANG Zhong-fang， NAN Jin， YAO Xiao-lin

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：The solubility of protein in vegetable oil meal is poor so that it is difficult to be directly used as an emulsifier in food emulsion system.In this paper，the functional properties of sesame protein were improved by high hydrostatic pressure treatment，and the digestion and oxidation properties of sesame protein were studied in the O/W emulsion using diacylglycerol as the oil phase.The results showed that in different digestion stages，the particle size of the two sesame protein emulsions treated with 300 MPa were smaller and the fatty acid release rates were higher.After 14 days of storage，the contents of primary and secondary lipid oxidation products increased，and the emulsions prepared by 300 MPa treated protein were easier to oxidize.Compared with triacylglycerol emulsion，the diacylglycerol emulsion system showed higher digestion and oxidation properties.

Key words：sesame protein; diacylglycerol; emulsion; digestion; oxidation

0 引言

芝麻是生長周期為一年的重要油料作物，在我國約有4/5以上的芝麻用來榨油，芝麻粕是芝麻提油后的副產(chǎn)物，其蛋白含量豐富，且含有多種氨基酸，是一種較好的植物蛋白來源，可用作食品中的功能蛋白［1］.經(jīng)熱榨后的芝麻粕，其蛋白質(zhì)發(fā)生變性，功能性質(zhì)較差，因此需對芝麻蛋白進行改性以提高其功能特性，以期為芝麻資源的深度利用提供理論依據(jù).目前，對植物蛋白改性的方法有超高壓處理、超聲處理、限制性酶解等.超高壓處理是利用水為傳壓介質(zhì)，通過高壓裝置，將壓力傳給物料，可對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、分子體積等產(chǎn)生影響，進而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的性質(zhì)改良.超高壓改性應(yīng)用較廣，Khan等［2］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超高壓處理，甘薯蛋白的乳化性以及乳化穩(wěn)定性均有所上升，以其制備的乳液具有較好的應(yīng)用效果.

甘油三酯（TAG）是脂質(zhì)的組成成分之一，研究顯示，甘油三酯是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要因素，其引起動脈粥樣硬化的可能性與其含量水平成正比［3］.甘油二酯（DAG）是由一個甘油骨架和兩個脂肪酸鏈組成的脂肪分子，是天然植物油脂的微量成分，也是脂肪代謝的中間產(chǎn)物，具有阻止體內(nèi)重新合成TAG的作用，因而可以起到使血脂降低、體重下降的功能［4］.

體外消化模型是通過模擬食物進入不同的消化階段（口腔、胃、小腸）的消化環(huán)境，來表征物質(zhì)在消化過程中的物理化學(xué)變化情況.油脂氧化是導(dǎo)致乳液腐敗變質(zhì)的主要原因，引起油脂氧化的主要因素有脂肪酸組成、溶液pH、離子濃度、氧氣濃度等.李騁［5］以DAG為油相，通過乳清蛋白穩(wěn)定O/W乳液并研究其消化特性.劉運［6］研究了經(jīng)超聲預(yù)處理的馬鈴薯蛋白水解物與傳統(tǒng)酶解馬鈴薯蛋白水解物在靜態(tài)模擬消化過程中，消化產(chǎn)物的抗氧化活性等的變化.

目前，對芝麻蛋白超高壓處理，并制備乳液的消化和氧化特性研究報道較少.本課題組前期研究了限制性酶解-超高壓處理對植物蛋白乳化性的影響［7］，本文以不同壓力處理的芝麻蛋白為乳化劑制備O/W型乳液，對比研究了TAG和DAG為油相的乳液消化和氧化特性，以期為芝麻蛋白資源的高值應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

芝麻油（未添加抗氧化劑）、芝麻粕，三原徐楊食品有限公司；Novozym435脂肪酶，上海寶曼生物科技有限公司；胃蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；所有其他化學(xué)品和試劑均為分析級.

1.1.2 主要儀器

LE204E分析天平，奧豪斯儀器設(shè)備有限公司；MD-S80分子蒸餾，佛山漢維機電科技有限公司；Trace-Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國菲尼根質(zhì)譜公司；L-600/3型食品超高壓處理設(shè)備，天津市華泰森淼超高壓設(shè)備有限公司；FA25-D高速剪切分散乳化機，上海佛魯克科技發(fā)展有限公司；ATS-Basic I 高壓均質(zhì)機，加拿大奧維斯汀有限公司；Physica MCR 301流變儀，奧地利安東帕有限公司；MS2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZS40納米粒度表面電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；FS5熒光光譜儀，英國愛丁堡儀器有限公司；UV2900紫外可見光分光光度儀，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 DAG的制備及成分測定

以芝麻油為原料，采用Novozym435脂肪酶催化甘油解反應(yīng)制備DAG［8］，反應(yīng)參數(shù)如下：甘油/芝麻油的摩爾比7.5∶1，加酶量為1 000 U/g，溫度50 ℃，時間8 h，進行磁力攪拌，設(shè)定其轉(zhuǎn)速為300 rpm.反應(yīng)結(jié)束后將混合物于室溫下進行離心，收集上層油層，采用分子蒸餾法進行甘油二酯的純化［9］.參考Long等 ［10］的方法，通過液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測定了DAG的甘油酯組成和脂肪酸組成.

1.2.2 芝麻蛋白的超高壓處理及乳液制備

采用Liu等［11］的方法從芝麻粕中提取芝麻蛋白凍干粉，之后將其溶于10 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中，室溫下攪拌3 h，水化過夜，得到蛋白含量為1.0%（w/v）的蛋白分散液，進行超高壓處理，分別設(shè)定為0.1 MPa、100 MPa、300 MPa、500 MPa.向芝麻蛋白分散液加入5%（w/v）的芝麻油，在50 ℃下用磁力攪拌器攪拌30 min，轉(zhuǎn)速為600 rpm.用高速剪切分散乳化機剪切3 min，轉(zhuǎn)速為10 000 rpm，再用高壓均質(zhì)機于60 MPa下均質(zhì)兩次.另取0.1 MPa和300 MPa處理后芝麻蛋白所得的分散液，以5%（w/v）DAG作為油相，以同樣方法制備乳液.

1.2.3 芝麻蛋白乳液的粒徑測定

采用激光粒度分析儀進行測定，設(shè)置如下測定參數(shù)：通用模式（Default）；顆粒折射率設(shè)定為1.520，分散劑折射率為1.330；泵轉(zhuǎn)速：2 050 rpm，吸收參數(shù)0.001.

1.2.4 芝麻蛋白乳液的ζ-電位測定

采用納米粒度電位儀進行測定，首先將芝麻蛋白乳液樣品稀釋100倍，稀釋液選用10 mmol/L pH為中性的磷酸緩沖液.設(shè)置如下測定條件：測量溫度為室溫25 ℃，平衡時間1 min.

1.2.5 芝麻蛋白乳液的流變學(xué)參數(shù)測定

用流變儀測定芝麻蛋白乳液的流變特性，將其放置在流變儀平行板上（直徑為40 mm，間隙為1 mm），剪切速率范圍為 0.01～100 s-1靜態(tài)剪切掃描，并對數(shù)據(jù)進行冪律模型擬合［12］：

τ=κγn

（1）

式（1）中：τ為剪切應(yīng)力（Pa），γ為剪切速率（s-1），n為流動行為指數(shù)，κ為稠度系數(shù)（Pa·s）.

1.2.6 構(gòu)建體外消化模型

（1）口腔：模擬唾液（SSF）參照Ding等［13］的方法，取芝麻蛋白乳液樣品20 mL，加入20 mL的SSF，使混合物中的油含量為1.25 wt%，調(diào)節(jié)pH為6.8.混勻后放入搖床，在100 rpm、37 ℃條件下保溫10 min.

（2）胃：參照Golding等［14］的方法配制模擬胃液（SGF）.分別取20 mL口腔消化后的產(chǎn)物和SGF混合，使反應(yīng)液中油濃度為0.625 wt%，調(diào)節(jié)其pH 為2.5后，放入搖床中，在100 rpm、37 ℃的條件下保溫2 h.

（3）小腸：模擬小腸液（SIF）參照Qiu等［15］的方法配制.將配制好的SIF與30 mL芝麻蛋白乳液混合，并調(diào)節(jié)體系pH為中性，加入24 mg/mL的脂肪酶2.5 mL，充分反應(yīng).

1.2.7 芝麻蛋白乳液在消化過程中游離脂肪酸（FFA）釋放的測定

在小腸模擬階段采用以下公式計算FFA釋放率［16］：

FFA釋放率=VNaOH×M1×mNaOHW1×2×100%

（2）

式（2）中：VNaOH為滴定消耗的NaOH體積，mL；Ml表示油的分子量；Wl表示油相占消化體系中的重量，g.

1.2.8 芝麻蛋白乳液初級氧化產(chǎn)物（POV）的測定

乳液體系中脂質(zhì)氫過氧化物的測定，參考Meng等［17］的方法：取0.3 mL乳液樣品置于離心管中，加入體積比為3∶1的異辛烷與異丙醇混合液1.5 mL，充分震蕩后離心2 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為1 000 rpm，吸取200 μL的上層有機層物質(zhì)于離心管中，加入甲醇和丁醇的混合液2.8 mL（體積比為2∶1），再分別加入15 μL濃度為3.94 mol/L的硫氰酸銨以及15 μL二價鐵離子溶液（0.132 mol/L氯化鋇和0.144 mol/L硫酸亞鐵等體積混合，過0.22 μm濾膜），進行20 min避光反應(yīng)，在510 nm波長下測定吸光度值，通過過氧化氫異丙苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算過氧化物含量.

1.2.9 芝麻蛋白乳液次級氧化產(chǎn)物（TBARS）的測定

取1 mL乳液于離心管中，加入硫代巴比妥酸（TBA）溶液2 mL（15%三氯乙酸和0.375%的TBA溶于濃度為0.25 mmol/L HCl），對混合物進行15 min的沸水浴，結(jié)束后立即冷卻至室溫，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，測定濾液在532 nm下的吸光值.通過丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線對乳液中TBARS的含量進行測定［18］.

1.2.10 芝麻蛋白乳液儲存過程中蛋白氧化的測定

乳液儲存期間，通過測定色氨酸的熒光光譜來反映蛋白的氧化.取100 μL的樣品，用5 mL磷酸緩沖液稀釋后置于4 mL的石英比色皿中.掃描范圍設(shè)定300～400 nm，激發(fā)波長設(shè)定為283 nm，狹縫寬度設(shè)定為10 nm.

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)取3次測量的平均值，采用Excel處理數(shù)據(jù)，SPSS16.1軟件比較結(jié)果平均值之間的顯著性差異，利用Origin 8.5進行繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 高純度DAG的制備及成分測定

通過脂肪酶催化芝麻油，利用甘油解反應(yīng)和分子蒸餾純化法制備的DAG油純度較高，經(jīng)檢測，DAG含量達到94.3%，TAG含量為4.8%，單甘酯（MAG）含量為0.9%.由表1可以看出，芝麻油和DAG都有較高比例的長鏈不飽和脂肪酸，分別達到85.39%和81.29%，其中亞油酸和油酸含量較高.DAG中飽和脂肪酸的含量比芝麻油中多3.09%.可以推測，酶解和分子蒸餾過程中，雙鍵可能被氫化成了單鍵，這與以大豆油為底物制備DAG的研究結(jié)果相似［19］.

2.2 芝麻蛋白乳液儲存過程中體積平均粒徑（d4，3）、ζ-電位和流變學(xué)參數(shù)變化

表2顯示，0.1 MPa（未超高壓處理）芝麻蛋白所制備乳液的d4，3較大，對TAG（即芝麻油）乳液樣品，芝麻蛋白經(jīng)100～300 MPa超高壓處理后，原有的二級結(jié)構(gòu)被破壞并形成更靈活的結(jié)構(gòu)，乳液粒徑減小.但更高的超高壓500 MPa處理，會致使蛋白聚集程度增加，導(dǎo)致粒徑稍增大，同時破壞了疏水相互作用，并將更多的疏水基團暴露在蛋白質(zhì)表面 ［15］.因此，對DAG乳液，實驗對比研究了0.1 MPa和300 MPa兩個樣品的特性.可以發(fā)現(xiàn)，14 d儲存后，乳液的ζ-電位絕對值降低，d4，3增大，κ增大，n減小，這是由于在乳液的儲存過程中，靜電斥力減小，導(dǎo)致蛋白發(fā)生了絮凝，使得粒徑增大，乳液的穩(wěn)定性降低，乳液變得粘稠.DAG乳液的d4，3小于TAG乳液，這是由于DAG的結(jié)構(gòu)中含羥基，具有一定的乳化性，油相中含一定量MAG，增加了體系中液滴的表面活性［10］.DAG乳液的ζ-電位絕對值、κ和n值均大于TAG乳液，這說明DAG乳液更加穩(wěn)定，且DAG的加入可能會提高乳液的粘稠度.

2.3 芝麻蛋白乳液在不同消化階段的d4，3分析

圖1顯示，0.1 MPa（未超高壓處理）芝麻蛋白所制備乳液的d4，3較小.在模擬口腔消化中，乳液的d4，3有所上升，這是由于口腔消化液中有粘蛋白，具有黏性，形成凝膠的能力較強，可能與乳液中的芝麻蛋白發(fā)生絮凝，導(dǎo)致d4，3增大.在模擬胃消化階段，由于酸性環(huán)境下pH較低，低于蛋白質(zhì)的等電點，使蛋白質(zhì)發(fā)生絮凝，并在胃蛋白酶的作用下，使蛋白質(zhì)水解為小的肽鏈，增加了與外部環(huán)境的接觸，加大了絮凝程度.加之，胃蛋白酶具有凝乳作用，使得乳液聚集成較大的顆粒.在小腸環(huán)境下，d4，3整體下降，一方面是由于小腸環(huán)境的pH較高為7.0，大于蛋白質(zhì)的等電點；另一方面，小腸是分解蛋白質(zhì)的主要場所，含有大量的膽汁鹽，其為一種很好的表面活性劑，可以降低液體表面的界面張力，減少絮凝.綜合分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同消化階段消化后，DAG-300 MPa乳液的d4，3仍然較小，這說明油相為DAG的體系，更易消化.對兩種乳液來說，在不同消化階段，300 MPa下的乳液d4，3均最小，表明其更易被消化.芝麻蛋白乳液在不同消化階段粒徑的變化趨勢與Qiu等［15］研究的小麥醇溶蛋白乳液模擬體外消化的變化趨勢一致.

2.4 芝麻蛋白乳液在不同消化階段的ζ-電位測定

在不同消化階段，乳液的ζ-電位絕對值均有不同程度的減小，如圖2所示.口腔消化階段的pH為6.8，與乳液中的pH 7.0相比有所降低，使得離子間的靜電斥力發(fā)生改變，ζ-電位的絕對值也有所降低.在模擬胃消化階段，由于體系酸性較強，低于蛋白質(zhì)的等電點，使得部分多肽發(fā)生絮凝，靜電斥力減小，ζ-電位絕對值減小.而在模擬小腸消化階段，作為蛋白質(zhì)消化的主要場所，蛋白質(zhì)被分解為氨基酸，使得氨基和羧基暴露，增加了負電荷的數(shù)量，ζ-電位的絕對值增大.另外，在TAG和DAG乳液中，300 MPa壓力下的乳液電位的絕對值均最大，這說明超高壓處理增加了芝麻蛋白乳液的穩(wěn)定性，且DAG乳液的穩(wěn)定性大于TAG乳液，這可能是由于DAG中的一個脂肪酸被羥基取代，而羥基是極性基團，易與水形成氫鍵，使得自身結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定.

2.5 芝麻蛋白乳液消化過程中FFA釋放分析

脂肪在代謝過程中，經(jīng)各種酶的酶解以及膽汁鹽乳化，被水解為甘油和脂肪酸等，可用FFA的釋放率表征其消化的程度.由圖3可知，在0～20 min，芝麻蛋白乳液的FFA釋放速率較快.隨著消化時間延長，F(xiàn)FA釋放繼續(xù)增加，20 min后逐步減緩.對照樣品（未經(jīng)超高壓處理）芝麻蛋白制備的乳液中，F(xiàn)FA釋放率均低于經(jīng)超高壓處理蛋白所得乳液樣品，由此可知，超高壓改性有助于蛋白乳液的脂質(zhì)消化.通過FFA釋放率的大小可以發(fā)現(xiàn)，DAG-300 MPa乳液的FFA釋放率大于TAG-300 MPa乳液.有研究表明［14］，在消化吸收特性實驗中，DAG組產(chǎn)生的乳糜微粒更容易被脂蛋白脂肪酶水解，釋放更多的脂肪酸.而DAG產(chǎn)生的脂肪酸主要用于氧化供能，而不是用于合成脂質(zhì)儲存起來，這說明DAG乳液更易被消化.

2.6 芝麻蛋白乳液POV的測定

POV值是油脂初級氧化的產(chǎn)物，極其不穩(wěn)定，氧化能力較強，其值的大小可以用來表征乳液的氧化程度.由圖4可以看出，所有樣品的POV值都逐漸上升，這說明在14 d內(nèi)，芝麻蛋白乳液均發(fā)生一定程度氧化.在0～4 d內(nèi)，乳液POV含量增長趨勢較緩，4 d后增長速度加快.其中，300 MPa壓力處理芝麻蛋白的乳液POV含量最高，0.1 MPa壓力處理下的含量最低，表明經(jīng)300 MPa壓力處理的芝麻蛋白乳液更易氧化，這可能是由于在該壓力下芝麻蛋白乳液的粒徑較小，比表面積較大，因而更容易發(fā)生氧化.

2.7 芝麻蛋白乳液TBARS的測定

油脂的次級氧化是在初級氧化的基礎(chǔ)上進行的，主要是經(jīng)初次氧化生成的不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，氫過氧化物繼續(xù)氧化而成的醛、酮、醇類物質(zhì)，這也是造成食品產(chǎn)生腐敗味的原因之一［15］.由圖5可以看出，所有乳液中，在0～14 d內(nèi)，TBARS含量均逐步上升.其中，TBARS含量最高的是300 MPa處理蛋白所得的乳液，最低為0.1 MPa處理蛋白所制的乳液（對照樣），且DAG乳液的TBARS含量高于TAG乳液，這與POV的測定結(jié)果相一致.這說明芝麻蛋白經(jīng)超高壓作用后，所得乳液更易發(fā)生氧化.DAG乳液比TAG乳液更易被氧化.

2.8 芝麻蛋白乳液的蛋白氧化測定

利用色氨酸的熒光光譜和最大吸收波長位移，可以表征蛋白的氧化.實驗對比研究了0.1 MPa和300 MPa壓力處理芝麻蛋白制備的乳液在儲存14 d后的蛋白氧化情況，結(jié)果如圖6所示.所有乳液樣品的熒光強度均有不同程度的降低.其中，經(jīng)300 MPa的壓力處理的芝麻蛋白乳液其熒光強度的下降幅度均大于0.1 MPa下的芝麻蛋白乳液，并發(fā)生了明顯的紅移.DAG-300 MPa的芝麻蛋白乳液紅移最大，為6 nm，這表明該處理條件下所得乳液的芝麻蛋白氧化程度最高，這也與油脂的氧化測定結(jié)果相一致.此外，TAG-0.1 MPa、DAG-0.1 MPa以及TAG-300 MPa的乳液樣品紅移分別為3 nm、4 nm、5 nm，表明超高壓處理蛋白一定程度上促進了其所得乳液的氧化.這一結(jié)果與李騁［5］研究的乳清分離蛋白乳液在儲存14 d后蛋白氧化情況一致，熒光強度均下降，且發(fā)生了紅移.

3 結(jié)論

通過超高壓處理芝麻蛋白，作為乳化劑，以DAG為油相，制備了O/W乳液.經(jīng)14 d儲存，乳液的ζ-電位絕對值、n值減小，乳液穩(wěn)定性降低，變得粘稠.在不同消化階段，300 MPa處理蛋白所得乳液的粒徑最小，F(xiàn)FA釋放含量最高，乳液更易被消化.相較于TAG乳液，DAG乳液中消化所得粒徑較小，初級和次級油脂氧化產(chǎn)物含量較高，蛋白氧化也較明顯，表明DAG乳液更易被消化和氧化.本實驗研究可對芝麻蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】