祁連山國家公園青海片區(qū)河流和濕地原生生物多樣性研究

摘要：探索祁連山國家公園河流與濕地的原生生物群落結(jié)構(gòu)特征及其對環(huán)境的響應(yīng)，為片區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用提供依據(jù)。2020年7-8月對祁連山國家公園青海片區(qū)河流和濕地的21個水環(huán)境樣點進(jìn)行了水樣采集和DNA分離，共獲得DNA樣品58份，利用宏基因組測序探究祁連山國家公園青海片區(qū)的原生生物種類組成和群落結(jié)構(gòu)，并分析了其與環(huán)境因子之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：（1）共鑒定和注釋到393個原生生物分類單元（operational taxonomic units，OTUs），分屬于24門40綱95目126科162屬，其中裸藻門、纖毛門種類最多，硅藻門、纖毛門豐度最高；（2）片區(qū)不同河流或濕地的原生生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，河流原生生物多樣性顯著高于濕地；（3）RDA分析顯示原生生物群落主要受水體總磷、水溫、pH、總有機碳、溶解氧、鹽度、總氮、硝酸鹽氮、氨氮和水流速度等環(huán)境因子的顯著影響；（4）物種共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示濕地原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)較河流更穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：原生生物；多樣性；宏基因組；河流；濕地；祁連山國家公園

中圖分類號：X171.1" " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2024）05-0009-11

原生生物（protists）是一大類單細(xì)胞真核微生物，廣泛分布于水環(huán)境中。原生生物包括原生動物和真核藻類，是水生生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，其不僅是水體食物網(wǎng)（鏈）中的初級生產(chǎn)者，也是消費者和分解者，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著極其重要的作用（Pokarzhevskii et al，2003；Jiao et al，2010）。因其生命周期短，繁殖快，且對水環(huán)境變化較為敏感，故對水環(huán)境變化具有較好的指示作用（沈韞芬，1999；熊杰等，2019）。由于該類生物個體小、種類多，在高原河流環(huán)境中密度低，因此形態(tài)學(xué)鑒定容易忽視這部分類群，導(dǎo)致原生生物多樣性被低估，從而對原生生物群落結(jié)構(gòu)特征的認(rèn)知存在誤區(qū)（Fenchel amp; J?rgensen，1977；Keeling amp; Campo，2017；Zhu et al，2021）。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基于高通量測序技術(shù)對原生生物群落進(jìn)行系統(tǒng)研究越來越普遍（黃平平，2017；Boscaro et al，2017；安瑞志，2021；羅帥等，2022），并且高通量測序具有數(shù)據(jù)量大，準(zhǔn)確度高，對物種識別靈敏等特點（Jiang et al，2021；Zhang et al，2022）?；诤昊蚪M測序，研究原生生物群落特征，有助于揭示原生生物之間的互作關(guān)系，對探究原生生物的環(huán)境適應(yīng)性機制及對水環(huán)境生物監(jiān)測等具有重要意義（王瑩瑩等，2005；胡明慧等，2022；翟萬營等，2022）。

河流是生命之源，是能量傳遞和物質(zhì)循環(huán)的重要載體，對維持水生生物多樣性發(fā)揮了重要作用；濕地作為淡水的重要來源，具有保護(hù)生物多樣性的重要功能，是重要的生態(tài)系統(tǒng)之一（王玲慧等，2015；王學(xué)福，2020；劉斌等，2022）。祁連山國家公園作為黃河最重要的水源地，是國家關(guān)鍵生態(tài)功能區(qū)中的“水源涵養(yǎng)重要區(qū)”，是我國西部地區(qū)的重要生態(tài)安全屏障，也是我國生物多樣性保護(hù)重點區(qū)域（李鐵，1998；王新源，2018），其特殊的高原氣候環(huán)境十分脆弱，人類活動和全球氣候變化對其環(huán)境影響均較大（安瑞志等，2021；蘭翔宇等，2021）。河流及相關(guān)濕地是祁連山國家公園重要的水生生態(tài)系統(tǒng)，其生態(tài)健康狀況不僅關(guān)系到祁連山河流本身的健康，也關(guān)系到河水滋養(yǎng)和補給的各種動植物資源的健康安全。因此河流生態(tài)系統(tǒng)的健康對整個祁連山國家公園的生態(tài)安全都有著重要的意義（張華等，2021）。探索祁連山國家公園河流與濕地的原生生物群落結(jié)構(gòu)特征及其對環(huán)境的響應(yīng)等，對保持祁連山國家公園生物資源和水環(huán)境保護(hù)有著長遠(yuǎn)意義。但受多種因素限制，目前關(guān)于祁連山國家公園原生生物群落結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)研究還未見報道。

為探究祁連山國家公園青海片區(qū)河流與濕地原生生物群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，本研究于2020年7-8月在該區(qū)采集水體樣品，基于宏基因組測序，對該片區(qū)原生生物種類、組成、群落結(jié)構(gòu)及其與水環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行了分析，旨在為該片區(qū)生物資源保護(hù)及水環(huán)境保護(hù)提供第一手資料，進(jìn)而為該片區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用提供依據(jù)。

1" "材料與方法

1.1" "研究區(qū)概況及樣點設(shè)置

祁連山國家公園位于青海省東北部和甘肅省西南部，總面積5.02萬km2，分為甘肅片區(qū)和青海片區(qū)，其中甘肅片區(qū)3.44萬km2，占總面積的68.5%；青海片區(qū)1.58萬km2，占總面積的31.5%（金萬洲等，2022）。青海片區(qū)位于37°03′～39°12′ N，96°49′～102°41′ E，區(qū)域包括海北藏族自治州的祁連縣、門源縣和海西蒙古族藏族自治州的德令哈市和天峻縣部分區(qū)域，轄區(qū)共12個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）48個村（牧委會）（金萬洲等，2022）。祁連山國家公園青海片區(qū)為青藏高原東北部邊緣的祁連山山地，該地區(qū)河流密布，流域地表水資源總量豐富，主要河流有大通河、黑河和托勒河等，同時該流域內(nèi)濕地眾多，包括大通河濕地、黑河濕地和托勒河濕地等主要濕地（李新等，2019；馬芳，2020）。

2020年7-8月在祁連山國家公園青海片區(qū)共設(shè)置21個采樣點（圖1），其中3條河流設(shè)置樣點12個，分別為黑河3個（HH1～3）、托勒河3個（TLH1～3）和大通河6個（DTH1～6）；濕地共設(shè)置樣點9個，分別為大通河濕地3個（DTHSD1～3）、黑河濕地3個（HHSD1～3）和托勒河濕地3個（TLHSD1～3）。

1.2" "樣品采集

每個樣點采集3個水環(huán)境樣品，共獲得水體樣品63份，其中，環(huán)境DNA樣品采集步驟為：（1）采集采樣點表層（約10～20 cm水深）原位水約5 L，先用200 μm的濾網(wǎng)過濾以去除水體中不可溶性雜質(zhì)及其他大型生物個體及水生植物（組織）等，再將過濾后的原位水收集至5 L水袋。（2）采集的原位水于12 h內(nèi)進(jìn)行過濾處理，取1.2 L（4×300 mL）原位水，通過真空抽濾裝置，將水樣中DNA抽濾至4張0.22 μm PC膜（Millipore，USA）上，放置于錫箔紙中，并立即置于干燥劑中干燥保存，用于下一步的DNA提取。（3）DNA樣品濾膜冷鏈運輸至廣東深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行宏基因組測序分析，其中測序成功的DNA樣品58 份。

環(huán)境因子數(shù)據(jù)采集和檢測：本研究共測定了17個水環(huán)境參數(shù)，包括總磷（TP）、總氮（TN）、硝酸鹽氮（NO3-N）、氨氮（NH3-N）、亞硝酸鹽氮（NO2-N）、總有機碳（TOC）、高錳酸鹽指數(shù)（CODMn）、葉綠素（Chl-a）、濁度（TUR）、氯離子（Cl-）、水流速度（V）、鹽度（Salt）、溶解氧（DO）、水體酸堿度（pH）、水溫（T）、溶解性總固體（TDS）和電導(dǎo)率（EC）。pH、T、TDS、Salt、DO和EC用美國哈希HQ40D便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀現(xiàn)場測定；TUR用美國哈希2100Q便攜式濁度儀現(xiàn)場測定；V用便攜式流速測算儀（SLD300-A）現(xiàn)場測定；Chl-a濃度采用多波長分光光度法實驗室測定；TOC用TOC儀（Elementar，德國）實驗室測定；Cl-用離子色譜儀（930 Compact Ic Flex）；NO3-N、NH3-N、NO2-N、CODMn、TN和TP測定參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》（國家環(huán)境保護(hù)總局編委會，2002）于實驗室內(nèi)完成。

1.3" "宏基因組測序及生物信息分析

采用CTAB方法進(jìn)行DNA提取。環(huán)境DNA純度和濃度用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，將檢測合格的DNA使用M220聚焦超聲儀（Covaris Inc，Woburn，MA，USA）破碎成大約300 bp的片段，構(gòu)建文庫，并基于Illumina Hiseq 4000進(jìn)行宏基因組測序。

對采集到的58份水體樣品進(jìn)行宏基因組測序，共獲得數(shù)據(jù)量1.5 Tb。然后用fast QC （v0.11.9）對測序所得的原始序列進(jìn)行質(zhì)量評估，對于低質(zhì)量堿基使用Fastx trimmer（v0.0.14）移除，通過BLASTN（BLAST Version 2.10.1+，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將經(jīng)過質(zhì)控的序列比對至SILVA數(shù)據(jù)庫，設(shè)置e值閾值為1[×]10-5，將得到符合要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。然后使用MEGAHIT（v1.1.3）進(jìn)行組裝，得到潛在的rDNA contigs。使用nhmmer從組裝得到的rDNA contigs中提取16S或18S rDNA序列，經(jīng)97%相似度聚類后，用于物種鑒定。使用Bwa（0.7.17-r1188）將reads比對至16S和18S rDNA，使用featurecounts（v1.6.0）進(jìn)行reads數(shù)目統(tǒng)計，并用RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到OTUs（operational taxonomic units）豐度表。

1.4" "統(tǒng)計分析

利用R軟件（4.0.3）vegan包計算均勻度指數(shù)（Pielou）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、豐富度指數(shù)（Richness）、辛普森指數(shù)（Simpson），并進(jìn)行非度量多維尺度分析。利用R軟件的vegan、psych和pheatmap等軟件包進(jìn)行冗余分析和相關(guān)性分析。使用R進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，使用Gephi軟件進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖繪制。利用R軟件的rdacca.hp包分析不同水環(huán)境因子對原生生物群落的貢獻(xiàn)度，并利用ggplot2包進(jìn)行排序圖可視化。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "水環(huán)境因子

對測定的水環(huán)境因子進(jìn)行共線性分析，去除共線性高于0.6即相關(guān)性高的3個水環(huán)境因子（TDS、EC和CODMn）后，保留14個環(huán)境因子進(jìn)行下一步分析。對大通河、大通河濕地、黑河、黑河濕地、托勒河和托勒河濕地的水環(huán)境因子進(jìn)行差異分析，結(jié)果見圖2。TP在大通河顯著高于大通河濕地、黑河濕地、托勒河、托勒河濕地（Plt;0.05），NO3-N在大通河顯著高于大通河濕地和托勒河，TOC和Cl-在大通河濕地顯著高于其他區(qū)域，Chl-a在大通河濕地顯著高于大通河和托勒河，TN在大通河顯著高于其他區(qū)域，TUR在黑河顯著高于其他區(qū)域，NO2-N在大通河顯著高于大通河濕地、黑河濕地、托勒河和托勒河濕地，V在河流區(qū)域顯著高于濕地區(qū)域，Cl-和TN在大通河濕地顯著高于其他區(qū)域，NO3-N在大通河顯著高于其他區(qū)域，Salt、DO、pH、NH3-N和T在各個區(qū)域均沒有顯著差異。

2.2" "原生生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)

對21個樣點的水環(huán)境樣品進(jìn)行宏基因組測序，經(jīng)組裝分析共提取到2 832條rDNA contigs，經(jīng)過97%相似性聚類后，共獲得538個真核生物OTUs，其中原生生物393個OTUs，其他真核145個OTUs。鑒定到的393個原生生物OTUs隸屬18門，其中OTUs個數(shù)占比gt;2%的優(yōu)勢門類有13個（圖3），依次為裸藻門（Euglenozoa）占21%，纖毛門（Ciliophora）占18%，硅藻門（Bacillariophyta）占11%，綠藻門（Chlorophyta）占9%，Discosea占7%，管涌足蟲門（Tubulinea）占5%，透色門（Heterolobosea）占4%，頂復(fù)門（Apicomplexa）占3%，絲足蟲門（Cercozoa）占3%，隱藻門（Cryptophyta）、Haptista、Perkinsozoa和紅藻門（Rhodophyta）各占2%。鑒定的393個原生生物OUTs中有140個可以鑒定到種水平，其中18個為優(yōu)勢種（相對豐度大于1%）（表1）。

研究區(qū)域各個河流和濕地原生生物α多樣性指數(shù)見表2，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）為4.13～4.94，豐富度指數(shù)（Richness）為236～380，辛普森多樣指數(shù)（Simpson）為0.965～0.987。香農(nóng)指數(shù)在大通河濕地平均值最低，為4.38，在托勒河平均值最高，為4.80；豐富度指數(shù)在大通河濕地平均值最低，為312，在黑河平均值最高，為354；辛普森多樣性指數(shù)在黑河濕地平均值最低，為0.9747，在托勒河平均值最高，為0.9846。

研究區(qū)域原生生物多樣性指數(shù)差異分析如圖4所示，香農(nóng)指數(shù)在各個河流間和各個濕地間均沒有顯著差異，但是在河流與濕地之間存在顯著差異，且河流顯著高于濕地。在河流中，豐富度指數(shù)僅在托勒河顯著高于大通河，其他河流間均沒有顯著差異。在各個濕地中，豐富度指數(shù)表現(xiàn)為黑河濕地顯著高于大通河濕地，托勒河濕地顯著高于大通河濕地，黑河濕地和托勒河濕地間沒有顯著差異；河流與濕地之間的豐富度指數(shù)沒有顯著差異。

對祁連山國家公園21個采樣點原生生物群落基于bray-curtis距離進(jìn)行的非度量多維標(biāo)度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析如圖5所示，Stress值低于0.1，表明降維效果越好，能較準(zhǔn)確反映數(shù)據(jù)排序的真實分布。排序圖結(jié)果顯示，濕地和河流之間、各個河流流域之間及各濕地之間的原生生物群落均存在較明顯的分組，表明在不同河流流域間、不同濕地間以及不同的水環(huán)境類型間，原生生物群落存在較大差異。

原生生物各個類群在各樣點的相對豐度如圖6所示，硅藻門在黑河（HH1～3）樣點和黑河濕地（HHSD1～3）樣點的相對豐度均超過25%。隱藻門在大通河相對豐度最高，且在大通河（DTH2～4）樣點的相對豐度超過20%。纖毛門在大通河、黑河、黑河濕地各樣點的相對豐度差異較小，而在大通河濕地、托勒河、托勒河濕地各樣點的相對豐度差異較大。除大通河區(qū)域外，硅藻門在其他各個區(qū)域相對豐度均相對較高，且在黑河濕地超過25%。纖毛門、裸藻門、金藻門、絲足蟲門等在不同區(qū)域的相對豐度變化較小。

2.3" "原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

為探究區(qū)域內(nèi)河流與濕地原生生物OTUs之間的互作關(guān)系，分別對河流及濕地的原生生物群落進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析（圖7），其中節(jié)點代表OTUs，邊代表OTUs之間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)，即OTUs之間相互關(guān)系。河流中原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)主要的模塊有6個（M1～M6），分別占總OTUs的22.80%、18.91%、14.51%、17.62%、25.91%和0.26%；濕地中原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)主要的模塊有5個（M1～M5），分別占總OTUs的17.88%、23.58%、19.43%、22.02%和17.10%。河流及濕地原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點間的連接均以正相關(guān)為主，表明原生生物OTUs間多為互利關(guān)系。

研究區(qū)域河流與濕地環(huán)境中原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表3所示，河流原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由386個節(jié)點和5 616條邊構(gòu)成，其平均度（節(jié)點連接性）為29.098，圖密度為0.076，模塊化指數(shù)為0.384，平均聚類系數(shù)0.365，平均路徑長度為2.410；濕地原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由386個節(jié)點和9 353 條邊構(gòu)成，其平均度為48.461，圖密度為0.126，模塊化指數(shù)為0.336，平均聚類系數(shù)0.481，平均路徑長度為2.222。通過對比河流與濕地中原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)，結(jié)果顯示濕地原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)連接數(shù)、平均度、圖密度和平均聚類系數(shù)均遠(yuǎn)高于河流，表明濕地原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中各個OTUs之間的聯(lián)系更為緊密，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系更復(fù)雜。而河流原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的模塊化指數(shù)和平均路徑長度均高于濕地，表明河流原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模塊化特性更強，OTUs之間的聚集更為明顯。

為了進(jìn)一步探究原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中不同類群的相互關(guān)系，對各個類群在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的連通度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各個類群在不同環(huán)境中的連通度存在差異（表4）。在河流中，連通度高于200的類群有10個，按連通度排序依次為裸藻門、纖毛門、硅藻門、綠藻門、Discosea、管涌足蟲門、隱藻門、透色藻門、頂復(fù)門和絲足蟲門。在濕地中，連通度高于200的類群有16個，按連通度排序依次為纖毛門、裸藻門、硅藻門、Discosea、綠藻門、管涌足蟲門、頂復(fù)門、絲足蟲門、Perkinsozoa、定鞭藻門、變形蟲門、隱藻門、Microsporidia和Imbricatea。河流中硅藻門和隱藻門的連通度高于濕地，其他類群在濕地中連通度均高于河流，這表明濕地中原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定，原生生物除硅藻門和隱藻門類群外，其他類群OTUs之間的共現(xiàn)關(guān)系在濕地中的聯(lián)系更為緊密。

2.4" "原生生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

對原生生物與環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析，結(jié)果見圖8，排序圖中僅顯示對RDA分析模型貢獻(xiàn)度大于0的環(huán)境因子。在河流和濕地中對RDA分析模型貢獻(xiàn)度大于0的環(huán)境因子有10個，為TP、T、pH、TOC、DO、Salt、TN、NO3-N、NH3-N和V。對于濕地而言，對RDA分析模型貢獻(xiàn)度大于0的環(huán)境因子有6個，為TP、T、Chl-a、Salt、Cl-和NH3-N。對于河流而言，對RDA分析模型貢獻(xiàn)度大于0的環(huán)境因子有10個，為TP、T、DO、Salt、Cl-、TUR、TN、NO2-N、TOC和NO3-N。

對各個環(huán)境因子的貢獻(xiàn)度進(jìn)行分析（表5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在河流和濕地中，TP、TN、NH3-N、NO3-N和TOC對原生生物群落的解釋率高于10%；在濕地環(huán)境中，TP和NH3-N對原生生物群落的解釋率高于10%；在河流TP、TN和NO3-N對原生生物群落的解釋率高于10%。

基于Spearman相關(guān)性分析，對研究區(qū)域河流和濕地原生生物主要門類與環(huán)境因子相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖9。河流與濕地的Parabasalia、硅藻門和裸藻門與COD和TOC呈顯著負(fù)相關(guān)，Imbricatea與NO3-N、TN和Salt呈顯著負(fù)相關(guān)；纖毛蟲門與Chl-a和COD呈顯著正相關(guān)，Amoebozoa與COD呈顯著正相關(guān)，Discosea與Chl-a、T和DO呈顯著正相關(guān)，隱藻門與COD、TP和TOC呈顯著正相關(guān)。

3" "討論

3.1" "原生生物群落分布特征

本研究通過宏基因組測序，在祁連山國家公園青海片區(qū)共鑒定出393個原生生物OTUs，隸屬于24門40綱95目126科162屬。在原生生物多樣性研究中，由于原生生物個體較小，傳統(tǒng)方法很難鑒定到種，顯微鑒定過程費時費力，且難以標(biāo)準(zhǔn)化，對鑒定人員的專業(yè)程度存在較高要求；傳統(tǒng)鑒定方法能夠做到絕對定量，并且方便與之前的數(shù)據(jù)做對比。而宏基因組測序技術(shù)在原生生物多樣性研究中，能夠更全面獲得原生生物多樣性信息，也可以對原生生物與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果更加準(zhǔn)確，且效率也相對較高，更容易標(biāo)準(zhǔn)化；但宏基因組測序技術(shù)難以做到絕對定量，同時易受干擾，物種注釋依賴于數(shù)據(jù)庫的完整性，可能對分類的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響（羅帥等，2022）。根據(jù)鑒定結(jié)果，其中OTUs相對豐度最高的類群為硅藻門，其次為纖毛門和綠藻門，在高海拔低溫水環(huán)境中，硅藻門的占比較高，這與前人的研究結(jié)果一致（楊菲，2014）。祁連山國家公園青海片區(qū)原生生物多樣性存在區(qū)域差異，在河流中為托勒河gt;黑河gt;大通河，在濕地中為托勒河濕地gt;黑河濕地gt;大通河濕地，且河流多樣性指數(shù)顯著高于濕地；根據(jù)沈韞芬等（1990）提出的水環(huán)境質(zhì)量越高，原生生物多樣性越高的理論，表明祁連山國家公園的水環(huán)境質(zhì)量為河流高于濕地，且在各個河流樣點水質(zhì)狀況為托勒河gt;黑河gt;大通河，各個濕地樣點水質(zhì)狀況為托勒河濕地gt;黑河濕地gt;大通河濕地，這也與水環(huán)境因子差異分析結(jié)果相一致，表明祁連山國家公園青海片區(qū)各個河流濕地的環(huán)境分化明顯，環(huán)境差異較大（Zhou et al，2021）。祁連山國家公園青海片區(qū)的原生生物種類占比最高的類群為裸藻門占21%，纖毛門占18%，硅藻門占11%，表明裸藻門、纖毛門和硅藻門是該區(qū)域最常見的3種原生生物類群；其中硅藻門的相對豐度較高，這一結(jié)果可能與祁連山地區(qū)的高海拔和低水溫的環(huán)境條件有關(guān)，根據(jù)以往研究，硅藻為適應(yīng)低溫環(huán)境的生物類群，因此它們能夠在祁連山國家公園青海片區(qū)的高海拔低溫環(huán)境下生存和繁殖，所以硅藻門在祁連山地區(qū)的占比較高（鄧建明等，2010；Hattori-Saito et al，2010）。同時比較大通河、托勒河和黑河硅藻門的相對豐度，發(fā)現(xiàn)大通河硅藻門相對豐度遠(yuǎn)低于黑河和托勒河（圖6），這與大通河地處祁連山山系東段，海拔相對較低，流經(jīng)城鎮(zhèn)村落較多，而托勒河與黑河地處祁連山腹地，海拔相對較高，且流域內(nèi)環(huán)境干擾較低，水環(huán)境較為原始有一定關(guān)系。

3.2" "影響原生生物群落的水環(huán)境因子存在差異

已有研究表明，T、Salt、pH、TP、TN、NH3-N、NO3-N、TOC等多種因素會對原生生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響（王鑫，2014；楊漸，2015；胡菊香等，2019）。通過分析原生生物與水環(huán)境因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)總磷（TP）、總氮（TN）和總有機碳（TOC）是對原生生物群落影響較強的水環(huán)境因子，這與研究區(qū)域地處祁連山山系的高海拔地區(qū)、水環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)較低有關(guān)，因此原生生物對水環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的依賴較高。從不同河流來看，大通河及大通河濕地采樣點位于天峻縣木里礦區(qū)附近，總氮總磷可能來源于地表徑流輸送或其他天然源；黑河樣點位于城鎮(zhèn)周圍城鎮(zhèn)牧場下游，總氮總磷可能來源于城鎮(zhèn)人為排入和草地系統(tǒng)的淋溶。大通河是人類活動最多的區(qū)域，人類放牧、農(nóng)耕及旅游等活動帶來的各種人為干擾，可能是導(dǎo)致其總磷總氮濃度較高的原因，并且由此導(dǎo)致大通河流域的硅藻門類群相比于其他區(qū)域較低，而隱藻門類群相比于其他區(qū)域較高。托勒河及托勒河濕地總磷的含量相比于其他區(qū)域相對較低，這可能與托勒河及托勒河濕地所處地區(qū)相對封閉、人為干擾較少、環(huán)境較為原始有關(guān)。整體濕地區(qū)域相較河流區(qū)域，人為活動較少，因此減少了外源營養(yǎng)物質(zhì)的輸入，從而導(dǎo)致其營養(yǎng)物質(zhì)較為缺乏，因而使得該地區(qū)原生生物多樣性較低（楊建新等，2008；王蕓，2017；支珞昀，2020）?？傮w而言，祁連山國家公園青海片區(qū)大通河，黑河和托勒河的水環(huán)境中影響原生生物群落的水環(huán)境因子存在差異，且在濕地中主要的環(huán)境因子為TP和NH3-N，對原生生物群落的影響高于70%（表5），而在河流中影響原生生物的水環(huán)境因子則更加多元化。

3.3" "河流和濕地原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)存在差異

生物間的相互作用是維持生物群落穩(wěn)定及保持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的重要因素之一（Chaffron et al，2010）。群落中各種生物之間存在著共生、合作、競爭、掠奪等互作關(guān)系（Liu et al，2019；Morris et al，2019），這些互作關(guān)系在原生生物群落中決定了各個類群間的共現(xiàn)關(guān)系，因此我們利用原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)來揭示原生生物之間潛在的相互作用，以此來揭示各個類群之間的共存模式（Proulx et al，2005）。本研究中祁連山國家公園青海片區(qū)河流和濕地2大類水體原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)存在差異。相較于河流，濕地環(huán)境的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜，表明其原生動物群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，所以濕地共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系較為緊密結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，相比之下河流環(huán)境中原生生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對簡單和碎片化。這表明河流環(huán)境中共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性較低，生物群落更容易受到外部環(huán)境壓力的影響，其穩(wěn)定性也越低。祁連山國家公園青海片區(qū)的各個河流海拔高，水源補給多為冰川融水，水溫較低，原生生物類群相對單一，這些環(huán)境條件的限制使得生物的生長和繁殖相對較為困難，從而導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性降低，因此在河流中原生生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度較低。而濕地環(huán)境對生物群落的限制更加嚴(yán)格，因此在濕地中生存的物種更傾向于形成更加穩(wěn)定的群落，濕地中的一些藻類如硅藻和綠藻比例較高，這與水體溫度和光照條件有關(guān)，這些藻類可以提供大量的有機物和能量，為水生動物提供養(yǎng)分和食物來源，構(gòu)建起一個相對完整的食物鏈或食物網(wǎng)。此外濕地中的水體更接近于靜態(tài)，沒有大的水流影響，也有利于提高原生生物群落的穩(wěn)定性。因此濕地中原生生物群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜，原生生物群落更為穩(wěn)定。

志謝：本研究得到中國科學(xué)院超級計算武漢分中心支持。

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（責(zé)任編輯" "熊美華）

Protist Diversity of Rivers and Wetlands in Qilian Mountain National Park

（Qinghai Region） Based on Metagenomics

WANG Hao‐hua1，2， ZHANG Peng2， LUO Shuai2， GU Si‐yu2， XIONG Xiong2，

YU Yao3， LI Lun3， MIAO Wei2， XIONG Jie2

（1. Dalian Ocean University， Dalian" "116023， P.R. China;

2. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan" "430072， P.R. China;

3. Qinghai Service Guarantee Center of Qilian Mountain National Park， Xining" "810000， P.R. China）

Abstract： Qilian Mountain National Park （Qinghai region） is located at the northeastern edge of the Qinghai-Tibet Plateau， an important ecological security barrier in western China and the most important water source region of the Yellow River. In this study， we explored the protist community structure and its relationship with environmental factors in the rivers and wetlands of Qilian Mountain National Park， aiming to accumulate a baseline to support conservation of biological resources and the water environment in the area. In July and August of 2020， water samples were collected at 21 sites at rivers and wetlands in Qilian Mountain National Park for the analysis of water environmental factors and DNA. A total of 58 DNA samples were obtained， and then metagenomic sequencing was used to investigate species composition and the community structure of protists. Results show that： （1） A total of 393 protist OTUs （Operational Taxonomic Units， OTUs） were identified and annotated， including 162 genera， 126 families， 95 orders， 40 classes， and 24 phyla. Euglenozoa and Ciliophora had the largest number of OTUs， while Bacillariophyta and Ciliophora were the most abundant. （2） There were significant differences in the community structure of protists from different rivers and wetlands， and the diversity of protists in rivers was significantly higher than in wetlands. The highest average Shannon （4.80） and Simpson （0.9846） diversity indices were both in Tuole River， and the highest average Margalef richness index （354） was in the Heihe River. The lowest average Shannon diversity index （4.38） and Margalef richness index （312） were both in the Datong River wetland， and the lowest average Simpson diversity index （0.9747） was in the wetland of the Heihe River. （3） Redundancy analysis shows that the protist community was primarily affected by the environmental factors TP， water temperature， PH， TOC， DO， salinity， TN， NO3--N， NH3-N and velocity. （4） The co-occurrence network in wetlands was more stable than that in rivers. This work provides basic data for the ecological assessment and monitoring of water environments in the region.

Key words：protist; diversity; metagenome; river; wetland; Qilian Mountain National Park