術(shù)中快速與術(shù)后常規(guī)免疫組織化學(xué)染色效果比較

[摘" "要]" "目的：探討術(shù)中冷凍切片快速免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）技術(shù)在術(shù)中快速病理診斷中的應(yīng)用效果。方法：對(duì)17例術(shù)中常見送檢的乳腺、肺、甲狀腺病變標(biāo)本應(yīng)用術(shù)中冷凍切片快速免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)廣譜細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin Pan，CKpan）、細(xì)胞角蛋白5/6（Cytokeratin 5/6，CK5/6）、細(xì)胞角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyriod transcription factor-1，TTF-1）和P63蛋白的表達(dá)，并與術(shù)后常規(guī)免疫組織化學(xué)染色效果進(jìn)行比較。結(jié)果：術(shù)中冷凍切片快速IHC與術(shù)后常規(guī)IHC對(duì)CKpan、CK5/6、CK19和TTF-1蛋白的染色部位一致，染色強(qiáng)度相似。結(jié)論：術(shù)中快速免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)常見陽(yáng)性標(biāo)志物的染色效果與常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)接近。

[關(guān)鍵詞]" "術(shù)中標(biāo)本；病理診斷；快速免疫組織化學(xué)；染色效果

[中圖分類號(hào)]" "Q816 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.05.003

Comparison of the staining effect of intraoperative rapid immunohistochemistry and postoperative routine immunohistochemistry

WANG Wei， HE Xin， ZHANG Shu

（Department of Pathology， the Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001）

[Abstract]" "Objective： To investigate the effect of intraoperative frozen section rapid immunohistochemistry in rapid pathological diagnosis during surgery. Methods： The expression of Cytokeratin Pan（CKpan）， Cytokeratin 5/6（CK5/6）， Cytokeratin 19（CK19）， thyriod transcription factor-1（TTF-1） and P63 protein in 17 cases of breast， lung and thyroid specimens was detected by intraoperative frozen section rapid immunohistochemistry， and the results were compared with postoperative routine immunohistochemistry staining. Results： Through comprehensive comparative analysis， it was found that the staining sites of CKpan， CK5/6， CK19， and TTF-1 were consistent during and after surgery， and the staining intensity was also similar. Conclusion： The staining effect of intraoperative rapid immunohistochemistry on common positive expression markers is similar to that of routine immunohistochemistry staining.

[Key words]" "intraoperative specimen; pathological diagnosis; rapid immunohistochemistry; dyeing effect

術(shù)中冷凍切片快速免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）技術(shù)是新的檢測(cè)手段，國(guó)內(nèi)已開始逐漸普及，其特點(diǎn)為檢測(cè)準(zhǔn)確、方便、快捷，可以輔助術(shù)中快速鑒別腫瘤的良惡性以及是否轉(zhuǎn)移等，提高病理診斷準(zhǔn)確率。本研究選取我院2024年2月—5月術(shù)中常見送檢的乳腺、肺及甲狀腺病變標(biāo)本17例，探討術(shù)中冷凍切片快速IHC在術(shù)中病理診斷的應(yīng)用效果。

１" "材料與方法

1.1" "標(biāo)本" "術(shù)中常見送檢的病變標(biāo)本17例，其中乳腺病變8例、肺病變6例、甲狀腺病變3例，均行術(shù)中冷凍切片快速IHC及術(shù)后常規(guī)IHC染色。

1.2" "試劑" "術(shù)中冷凍切片快速IHC染色兩步法專用一抗CKpan（AE1/AE3）、CK5/6（C6H1/C1C8）、P63（C2C10）、CK19（A53-B/A2.26）、TTF-1（SPT24），快速IHC染色配套固定液，專用酶標(biāo)聚合物二抗，均購(gòu)自河南賽諾特生物公司。石蠟包埋組織切片使用IHC一抗CKpan（AE1/AE3）、CK5/6（RM341）、CK19（UMAB2）、TTF-1（SPT24），高敏型酶標(biāo)抗鼠/兔IgG聚合物二抗，intellip ATH Plus DAB染色液（批號(hào)249022），均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3" "方法

1.3.1" "術(shù)中冷凍切片快速IHC染色：冷凍組織使用冷凍切片機(jī)連續(xù)4 μm厚切片，專用固定液固定30 s，清洗液洗２次，通用免疫組化封閉液封閉20 s，專用一抗孵育4 min，清洗液洗２次，二抗３ min；清洗液洗２次，DAB工作液90 s（DAB底物：緩沖液＝1∶20），清洗液洗２次，蘇木精復(fù)染10 s，水洗后脫水、透明、中性樹脂封固（操作時(shí)室溫控制在20～25 ℃）。

1.3.2" "常規(guī)IHC染色：利用Ultra PATH 60全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。手術(shù)切除的組織標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)石蠟切片。脫蠟，PBS水洗，抗原修復(fù)緩沖液（pＨ9.0）進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，使用H2O2除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫下孵育300 s，PBS水洗。切片上滴加一抗，室溫下孵育30 min，PBS水洗，滴加增強(qiáng)劑900 s，PBS水洗。滴加高敏型酶標(biāo)抗鼠/兔IgG聚合物二抗試劑，室溫下孵育1 000 s，PBS水洗。滴加新鮮配制的DAB顯色試劑，水洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，PBS返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4" "結(jié)果判讀" "比較術(shù)中冷凍切片快速IHC和術(shù)后常規(guī)IHC的染色效果。CKpan表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)、CK5/6表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)、P63表達(dá)定位于細(xì)胞核、CK19表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)、TTF-1表達(dá)定位于細(xì)胞核，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色黃色為陽(yáng)性。

２" "結(jié)" " " 果

2.1" "術(shù)中冷凍切片快速IHC有效性的初步驗(yàn)證" "在乳腺組織冷凍切片中（圖1A），相較于95%乙醇固定標(biāo)本（圖1B），使用術(shù)中冷凍切片快速IHC染色配套固定液染色效果有所改善（圖1C），導(dǎo)管周邊肌上皮細(xì)胞P63核染色效果增強(qiáng)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒顯色更深，更易于病理醫(yī)生的觀察。

2.2" "使用快速染色配套固定液的術(shù)中快速IHC與術(shù)后常規(guī)IHC結(jié)果比較

2.2.1" "乳腺病變標(biāo)本：8例手術(shù)切除的乳腺病變標(biāo)本經(jīng)常規(guī)IHC染色，其中1例病理診斷為少見的腺病伴大汗腺化生，1例診斷為惡性病變。1例腺病伴大汗腺化生在術(shù)中行快速冰凍切片HE染色，鏡下見乳腺上皮增生（圖2A），加做CK5/6 IHC后，顯示導(dǎo)管周圍肌上皮細(xì)胞CK5/6陽(yáng)性，導(dǎo)管上皮CK5/6陰性，符合乳腺腺病伴導(dǎo)管上皮及肌上皮增生，診斷為腺肌上皮瘤可能，伴部分導(dǎo)管上皮大汗腺化生。術(shù)中冷凍切片快速IHC鏡下能更好觀察侵及范圍（圖2B），且與術(shù)后IHC結(jié)果一致（圖2C）。

另1例惡性病變，術(shù)中快速冰凍切片HE染色鏡下見乳腺上皮實(shí)性、篩狀增生，細(xì)胞異型，與巢團(tuán)狀浸潤(rùn)性癌無(wú)法鑒別（圖3A），加做CK5/6 IHC，顯示巢周肌上皮細(xì)胞存在，巢內(nèi)無(wú)肌上皮細(xì)胞（圖 3B），提示病變?yōu)樵话c術(shù)后常規(guī)IHC結(jié)果一致（圖3C）。

2.2.2" "肺病變標(biāo)本：6例手術(shù)切除的肺病變標(biāo)本經(jīng)常規(guī)IHC染色，其中1例病理診斷為惡性病變。該例術(shù)中快速冰凍切片HE染色，鏡下可見病灶內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的高度異型細(xì)胞，無(wú)法鑒別低分化癌或惡性間皮瘤（圖4A、D），加做TTF-1、CKpan IHC，提示為低分化腺癌（圖4B、E），與術(shù)后常規(guī)IHC的結(jié)果一致（圖4C、F）。

2.2.3" "甲狀腺病變標(biāo)本：3例手術(shù)切除的甲狀腺病變標(biāo)本經(jīng)常規(guī)IHC染色，其中1例診斷為惡性病變。該例術(shù)中快速冰凍切片HE染色，鏡下表現(xiàn)為濾泡上皮乳頭狀結(jié)構(gòu)（圖5A）。加做CK19 IHC，顯示CK19強(qiáng)陽(yáng)性，提示乳頭狀癌可能（圖5B），與術(shù)后常規(guī)IHC結(jié)果一致（圖5C）。

3" "討" " " 論

本研究選取術(shù)中常見送檢的乳腺、肺、甲狀腺病變標(biāo)本，比較術(shù)中冷凍切片快速IHC與術(shù)后常規(guī)IHC對(duì)CKpan、CK5/6、P63、CK19和TTF-1的染色情況。結(jié)果顯示，兩者染色強(qiáng)度相似，標(biāo)記部位一致，非特異性背景著色弱。術(shù)中快速IHC染色方法簡(jiǎn)單實(shí)用，流程總耗時(shí)10～12 min，可操作性強(qiáng)。由于使用改良的固定液、清洗液和特異性高、靈敏性強(qiáng)的一抗，使得抗原抗體親和力高，背景干凈，且新鮮組織抗原完整無(wú)破壞，切片中靶蛋白更易顯色，可在術(shù)中高效精準(zhǔn)識(shí)別病灶和病理分型，發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶、浸潤(rùn)灶，降低假陰性率，降低僅靠HE染色發(fā)生誤診的風(fēng)險(xiǎn)。

術(shù)中快速病理檢查對(duì)手術(shù)方案的決策具有關(guān)鍵性作用，通常要求病理醫(yī)師在30分鐘內(nèi)提供正確的病理診斷信息，但組織在冷凍時(shí)不可避免形成冰晶，對(duì)細(xì)胞和組織形態(tài)產(chǎn)生破壞。對(duì)于形態(tài)學(xué)不典型、術(shù)前檢查與術(shù)中良惡性指征不符的患者以及微小轉(zhuǎn)移灶，病理醫(yī)師難以在短時(shí)間內(nèi)根據(jù)HE染色作出準(zhǔn)確診斷。IHC技術(shù)在臨床病理診斷中不可或缺，廣泛用于疑難腫瘤的診斷和鑒別診斷、腫瘤組織來(lái)源的判斷、預(yù)后評(píng)估以及靶向藥物適用病例的篩選等。然而常規(guī)IHC操作過(guò)程大多需要3小時(shí)以上，耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足術(shù)中快速病理診斷需要。近年來(lái)，術(shù)中快速IHC技術(shù)的臨床應(yīng)用逐漸增多，由于操作簡(jiǎn)單、快捷，可提高術(shù)中病理診斷的準(zhǔn)確性，降低誤診風(fēng)險(xiǎn)[1]。

CK蛋白及其家族成員蛋白表達(dá)水平在乳腺腫瘤來(lái)源、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的識(shí)別中具有重要意義，可通過(guò)肌上皮細(xì)胞標(biāo)記CK5/6判斷有無(wú)浸潤(rùn)。術(shù)中前哨淋巴結(jié)憑HE染色無(wú)法鑒別淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移，CKpan可標(biāo)識(shí)單個(gè)或成團(tuán)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞，更準(zhǔn)確判斷淋巴結(jié)是否被癌細(xì)胞浸潤(rùn)?？焖買HC技術(shù)檢測(cè)CKpan、CK5/6和P63在判斷乳腺腫瘤原位癌或浸潤(rùn)性癌及前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移中已取得較好效果[2-3]。CK19在甲狀腺腫瘤原位癌或浸潤(rùn)性癌中表達(dá)明顯升高，可鑒別乳頭狀增生和乳頭狀癌，CK19陽(yáng)性表達(dá)聯(lián)合鏡下組織學(xué)特點(diǎn)有助于甲狀腺病變的手術(shù)決策[4]。TTF-1蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在肺腺癌、小細(xì)胞肺癌和大多數(shù)甲狀腺癌中表達(dá)[5]，是術(shù)中診斷肺腺癌最常用的標(biāo)志物。

然而，關(guān)于術(shù)中快速IHC技術(shù)還有一些值得思考的問題：（1）不同組織標(biāo)本如何精準(zhǔn)選用合適的抗體指標(biāo)。（2）需要建立術(shù)中快速IHC染色操作流程，有效控制病理診斷時(shí)長(zhǎng)。（3）需要標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控，如冷凍切片厚度、冷凍時(shí)間長(zhǎng)短、如何避免組織中冰晶等影響因素[6]。

綜上所述，術(shù)中冷凍切片快速IHC與術(shù)后常規(guī)IHC的染色效果相似，在常規(guī)術(shù)中冷凍切片HE染色不能診斷時(shí)，建議作快速IHC染色以提高術(shù)中病理診斷的準(zhǔn)確性，降低延遲診斷率。

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[收稿日期] 2024-08-20

（本文編輯" "繆宏建）