新型冷凍筆制作大鼠局部凍傷模型的研究

[摘" "要]" "目的：研究新型冷凍筆制作不同程度皮膚凍傷動物模型的可行性。方法：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級大鼠10只，分別標(biāo)記A、B、C、D、E、F、G、H、I、J。將冷凍筆從-60 ℃低溫冰箱取出后緊貼大鼠尾巴近根部皮膚。A、B、C、D大鼠分別以-50 ℃、-30 ℃、-50 ℃、-30 ℃為起始溫度，A、B大鼠每個部位冷凍2次，共6次，每次40 s，C、D大鼠每個部位冷凍2次，共6次，每次25 s，造成皮膚局部凍傷，24小時后處死大鼠，取凍傷皮膚組織作病理觀察。E、G、I大鼠以-50 ℃為起始溫度，F(xiàn)、H、J大鼠以-30 ℃為起始溫度，均冷凍40 s間隔20 s，重復(fù)3次。在冷凍后24 h處死E、F大鼠，48 h處死G、H大鼠，120 h處死I、J大鼠，取凍傷皮膚組織作病理觀察。結(jié)果：冷凍起始溫度越低，作用時間越長，頻次越多，凍傷程度越嚴(yán)重。凍傷后24 h組織細(xì)胞變性、水腫較明顯，炎癥反應(yīng)較輕。凍傷后48 h、120 h炎癥反應(yīng)較嚴(yán)重，大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。凍傷后120 h組織細(xì)胞變性、水腫減輕，凍傷開始逐步修復(fù)。結(jié)論：新型冷凍筆通過控制冷凍起始溫度、作用時間、作用面積、作用頻次，可制作各種凍傷程度的凍傷動物模型，為研究凍傷機(jī)制和冷凍治療提供合適的工具。

[關(guān)鍵詞]" "冷凍筆；凍傷模型；大鼠；皮膚；病理學(xué)觀察

[中圖分類號]" "Q95.33 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.05.001

Study on making local frostbite model of rats with a novel freezer pen

LUO Yonghua1， GU Mingsheng2， LIU Zhan3， CHEN Yun4， WANG Jiaying5， ZHU Gaoceng1， CHEN Lingyun1

（1Department of Laboratory Medicine， 2Department of Dermatological， 5Department of Pathology， Nantong Fourth People’s Hospital， Jiangsu 226005; 3Physiology Teaching and Research Section， Medical School of Nangtong University;

4Nantong City Disease Prevention and Control Center）

[Abstract]" "Objective： To study the feasibility of making different degrees of skin frostbite model with a novel freezer pen. Methods： Ten rats with specific pathogen free were labeled A， B， C， D， E， F， G， H， I， J， respectively. The novel freezer pen was taken out from the -60 ℃ freezer and pressed close to the skin near the root of the rat tail. Rats A， B， C and D were frozen at -50℃， -30℃， -50℃， and -30℃ separately. Rats A and B were frozen twice in each part for 6 times， 40 seconds each time; rats C and D were frozen twice in each part for 6 times， 25 seconds each time， resulting in local skin frostbite. The rats were killed 24 hours later， and the frostbitten skin tissues were taken for pathological observation. E， G， I rats were frozen at -50°C， and F， H， and J rats were frozen at -30°C at the starting temperature， all of which were frozen for 40 seconds at an interval of 20 seconds， and repeated 3 times. Rats E and F were killed 24 hours after freezing， rats G and H were killed 48 hours after freezing， and rats I and J were killed 120 hours after freezing. The skin tissue of frostbite was taken for pathological observation. Results： The lower the initial freezing temperature， the longer the duration and frequency of freezing， the more serious the degree of frostbite. After frostbite for 24 h， the tissue cell degeneration and edema were obvious， and the inflammatory reaction was light. After frostbite for 48 h and 120 h， the inflammatory reaction was se-rious， and a large number of lymphocytes and neutrophils were infiltrated. After frostbite for 120 h， histiocytic degeneration and edema were relieved. The frostbite began to heal gradually. Conclusion： By manipulating the initial freezing temperature， duration of acting， area of application and frequency of application， the novel freezer pen is capable of make different degrees of skin frostbite animal models， which provides a suitable tool for studying the mechanism of frostbite and cryotherapy.

[Key words]" "freezer pen; frostbite model; rat; skin; pathological observation

凍傷是指機(jī)體暴露在寒冷環(huán)境中導(dǎo)致局部組織或全身溫度下降而發(fā)生的損傷，建立合適的動物模型有助于研究凍傷發(fā)生機(jī)制和防治。以往多采用95%乙醇、-25 ℃環(huán)境或液氮降溫建立凍傷模型[1-2]，但這些方法步驟復(fù)雜，所需材料較多，費(fèi)用高，且難以掌控凍傷程度和面積。不同濃度乙醇具有不同冰點(diǎn)[3-4]，通過預(yù)冷凝固后轉(zhuǎn)化為液體，能吸收大量能量產(chǎn)生制冷作用，而金屬銅具有良好的熱傳導(dǎo)性能[5]。本課題組根據(jù)此原理申請了新型冷凍筆的國家專利，并將其用于制作大鼠局部凍傷模型，為研究局部凍傷組織的病理改變、修復(fù)過程及機(jī)制提供合適的工具。

1" "材料與方法

1.1" "實(shí)驗(yàn)動物" "無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級大鼠10只，雌雄各5只，1.5～2月齡，體質(zhì)量200～250 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0001；使用許可證號：SCXK（蘇）2022-0046］。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理的相關(guān)要求（動物倫理編號：S20220507-003）。

1.2" "動物凍傷模型制備" "將SPF級大鼠10只分別標(biāo)記A、B、C、D、E、F、G、H、I、J。固定大鼠，以30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。緊貼皮膚剪去鼠尾近根部被毛，用100 g/L硫化鈉溶液快速蘸洗，待被毛溶解成糊狀后用濕紗布擦洗干凈，溫水徹底洗凈，裸露實(shí)驗(yàn)部位皮膚。冷凍筆筆尖作用點(diǎn)直徑為8 mm，事先置于-60 ℃低溫冰箱中預(yù)冷。制模前即刻取出，測量筆尖作用點(diǎn)溫度，確認(rèn)達(dá)到所需溫度。常規(guī)麻醉固定大鼠，用冷凍筆筆尖緊貼鼠尾近根部，造成皮膚局部凍傷。A、C大鼠以-50 ℃為冷凍起始溫度，B、D大鼠以-30 ℃為冷凍起始溫度，在尾巴近根部緊貼皮膚用冷凍筆按圖1中1至6順序進(jìn)行冷凍，A、B大鼠每個部位冷凍2次，共6次，每次40 s，C、D大鼠每個部位冷凍2次，共6次，每次冷凍25 s。完成冷凍后大鼠放回鼠籠正常喂養(yǎng)，24 h后處死，立即取凍傷部位皮膚福爾馬林固定，供病理檢查。

E、G、I大鼠以-50 ℃為起始溫度，F(xiàn)、H、J大鼠以-30 ℃為起始溫度，冷凍40 s間隔20 s，在相對固定部位重復(fù)3次。冷凍后放回鼠籠正常喂養(yǎng)。在冷凍后24 h處死E、F大鼠，48 h處死G、H大鼠，120 h處死I、J大鼠。立即取凍傷部位皮膚福爾馬林固定，供病理檢查。

1.3" "病理學(xué)觀察" "在大鼠凍傷部位中心區(qū)域切取約5 mm2皮膚組織，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm厚度連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色10 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化5 s，自來水沖洗，95%乙醇10 s，伊紅染色液染色2 min，常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封固。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠凍傷皮膚病理學(xué)改變。

2" "結(jié)" " " 果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冷凍筆在-60 ℃冰箱完全預(yù)冷，取出后在室溫下筆尖作用點(diǎn)復(fù)溫緩慢，復(fù)溫至-20 ℃，持續(xù)時間超過10分鐘，能完全滿足實(shí)驗(yàn)及冷凍治療的需要。起始溫度為-50 ℃及-30 ℃的冷凍筆制作出程度不同的局部凍傷模型，局部都會形成持續(xù)時間不等、大小不等白色冰球，隨后局部紅斑腫脹。24小時后，局部呈暗紅色至暗灰色不一的凍傷區(qū)。

病理檢查結(jié)果見圖2，A鼠：病理切片可見灶性表皮細(xì)胞變性壞死，表皮下裂隙形成，真皮內(nèi)膠原、皮下脂肪及肌肉水腫變性，血管內(nèi)血栓形成。B鼠：灶性表皮細(xì)胞變性壞死，表皮下裂隙形成，周邊表皮基底細(xì)胞空泡變性，真皮全層及皮下脂肪內(nèi)散在淋巴細(xì)胞和少許中性粒細(xì)胞浸潤，血管內(nèi)血栓形成。C鼠：灶性表皮細(xì)胞變性壞死，表皮下裂隙形成，周邊表皮下真皮及皮下脂肪內(nèi)散在淋巴細(xì)胞和少許中性粒細(xì)胞浸潤，皮下脂肪水腫變性，伴血栓形成。D鼠：灶性表皮細(xì)胞變性壞死，殘留細(xì)胞核，表皮下裂隙形成，周邊真皮及皮下脂肪散在淋巴細(xì)胞少許中性粒細(xì)胞浸潤，伴血管內(nèi)血栓形成。E鼠：全層灶性表皮細(xì)胞變性壞死，表皮下裂隙形成，周邊表皮基底層棘層灶性角化不良細(xì)胞散在，真皮全層少許淋巴細(xì)胞，散在中性粒細(xì)胞浸潤伴少許紅細(xì)胞外滲，肌纖維束間中性粒細(xì)胞浸潤，肌纖維水腫變性，真皮膠原變性不明顯。F鼠：表皮淺層變性壞死，表皮下裂隙形成，真皮全層散在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，膠原變性不明顯。G鼠：灶性表皮細(xì)胞變性壞死，表皮下裂隙形成，以中性粒細(xì)胞為主大量炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤，毛囊壁上皮細(xì)胞變性壞死，皮下脂肪及肌肉水腫變性，伴散在中性粒細(xì)胞及少許淋巴細(xì)胞浸潤，灶性血栓形成，肌肉皮下組織炎癥明顯。H鼠：全層灶性表皮細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞核殘留，周邊表皮下裂隙形成，真皮淺層輕微水腫變性，中下部較明顯水腫變性，散在中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，真皮血管內(nèi)血栓形成，皮脂腺周圍密集中性粒細(xì)胞浸潤。I鼠：表皮淺層全層壞死，壞死表皮下微膿瘍形成，真皮全層彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤，散在中性粒細(xì)胞及少許組織細(xì)胞浸潤，膠原水腫變性，皮下脂肪及真皮全層炎癥細(xì)胞浸潤。J鼠：表皮灶性變性，角化不全，炎癥細(xì)胞浸潤，真皮乳頭灶性水腫，彌漫性淋巴細(xì)胞和少許中性粒細(xì)胞浸潤，真皮中下部及肌肉組織無明顯變化。

3" "討" " " 論

凍傷是中國北方地區(qū)冬季常見病，主要表現(xiàn)為人體遭受低溫侵襲所引起的全身或局部損傷，患者皮膚蒼白、冰冷、疼痛和麻木[5]。動物模型對凍傷研究發(fā)揮重要作用，但實(shí)際凍傷程度的掌握難以標(biāo)準(zhǔn)化。本研究采用自制的冷凍筆建立大鼠皮膚凍傷模型，為研究局部凍傷組織的病理改變、修復(fù)過程及機(jī)制提供合適工具。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠局部經(jīng)-50 ℃或-30 ℃冷凍低溫作用后，局部組織細(xì)胞發(fā)生變性壞死，冷凍起始溫度越低，作用時間越長，頻次越多，凍傷程度越嚴(yán)重。表明本研究自制的冷凍筆可以控制冷凍起始溫度、作用時間和頻次，制作不同程度的局部凍傷模型。病理檢查顯示，組織細(xì)胞變性壞死多為小面積灶性分布，間隔在正常組織中，深層損傷較淺層嚴(yán)重。分析原因：（1）冷凍筆作用面積較小，而且是多頻次冷凍，每次冷凍部位也不完全重疊，由低溫導(dǎo)致的損傷區(qū)域小且不規(guī)則。（2）由于不同組織細(xì)胞對低溫的耐受性不同，處于相同低溫區(qū)的組織細(xì)胞損傷程度也不同。雖然脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、毛囊細(xì)胞位于深層，但發(fā)生變性壞死較周圍其它組織嚴(yán)重。（3）凍結(jié)解凍過程對組織細(xì)胞產(chǎn)生更嚴(yán)重的損傷。由于本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多頻次冷凍，間隔時間較短，淺層及鄰近冷凍源中心的組織細(xì)胞在較短的間隔時間內(nèi)不能完成解凍，而持續(xù)處于凍結(jié)狀態(tài)，因此受凍融損傷較小。病理切片可見，凍傷后24 h組織細(xì)胞變性、水腫較嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)較輕。凍傷后48 h、120 h炎癥反應(yīng)較嚴(yán)重，大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。凍傷后120 h組織細(xì)胞變性、水腫減輕，表明凍傷開始逐步修復(fù)。

（致謝：南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心、江蘇溯源病理中心及南通四院沈?qū)幉┦繉φn題實(shí)驗(yàn)和論文撰寫給予的支持和幫助。）

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[收稿日期] 2024-07-18

（本文編輯" "趙喜）