原核Argonaute 的應用研究進展

摘要 原核生物Argonautes（ pAgos）是參與細胞防御外來DNA入侵的可編程核酸酶。在體外，pAgos可以結合小的單鏈核酸（ssDNA/ssRNA）向導來識別和切割互補DNA/RNA。在體內，pAgos 優(yōu)先靶向多拷貝遺傳元件、噬菌體和質粒，從而抑制入侵核酸的擴增和噬菌體感染。pAgos 作為一類新興的可編程核酸酶，比目前應用最為廣泛的CRISPR-Cas 系統(tǒng)更具靈活性，在生物技術方面展現(xiàn)出巨大的潛力。早期的研究聚焦于嗜熱的pAgo，目前基于嗜熱pAgos 的主要應用包括分子診斷和體外DNA 組裝。為了推進基于Ago 的體內生物技術，如基因編輯的應用，研究人員的焦點逐漸轉移到中溫生物來源的pAgos，雖然目前pAgos 還未實現(xiàn)基因組編輯，但是隨著越來越多的pAgo 被發(fā)掘以及研究人員對pAgos 催化機制的深入研究，有望開發(fā)基于pAgos 的下一代基因編輯技術。本文總結了已知代表性pAgos 和基于pAgos 發(fā)展的生物技術，并簡要分析了pAgos 在原核生物和真核生物體內應用面臨的挑戰(zhàn)和可能的應對策略。

關鍵詞 可編程核酸酶； 原核Argonaute； 基因編輯； 分子診斷； DNA 組裝

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0082-12

現(xiàn)代生物技術的核心是由多種DNA 內切酶推動的，這些酶使我們能夠操縱DNA 以實現(xiàn)各種應用，包括重組蛋白質的大規(guī)模生產［1-2］、動植物分子育種［3］和綠色能源的開發(fā)［4］。最早用于DNA 操作的酶是細菌用來防御外源入侵DNA 的限制性內切酶［5］。此類酶在特定DNA 序列（限制性位點）內或附近切割DNA，是基因工程的關鍵工具，在重組DNA 技術、基因組定位和DNA 測序等領域被廣泛應用［6］。限制性內切酶識別基因組中常見短序列（約6個核苷酸）的這種特性限制了它們在精確基因組編輯中的應用。之后的巨核酸酶和具有獨特靶點（約20 個核苷酸）的可編程核酸酶，可以精確地修飾目標基因，有助于我們理解基因功能，進行菌株改良，并治療遺傳疾?。?］。這些酶包括大范圍核酸內切酶（如PⅠ-SceⅠ）、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）和Cas 核酸酶，在識別和切割靶DNA 方面具有不同的特異性［8］。然而，這些酶有些具有固定的基序，限制了目標選擇；有些需要復雜的蛋白質工程來重新編程［9-12］。即使是可以通過RNA引導容易重新編程的Cas 核酸酶，也必須依賴原間隔序列臨近基序（PAM）序列（通常為2～7 個核苷酸）識別和切割雙鏈DNA（dsDNA）［12］。因此，尋找高度特異性的可編程DNA 內切酶，以更靈活地選擇DNA靶標，例如不依賴PAM 的Cas 核酸酶，成為亟需解決的問題［12-13］。

為此，人們對細菌和古細菌中的原核生物（pAgos）越來越關注，因為它們具有識別和切割靶RNA和/或DNA 的潛力［14-15］。類似于Cas 核酸酶，這些酶在短單鏈（ss）核酸引導下能夠靶向互補的核酸。由于沒有PAM 序列的限制，它們比Cas 核酸酶更加靈活，因此為處理沒有或稀少PAMs 的DNA 提供了新的選擇。在遞送方面，pAgos 還有一個額外優(yōu)勢：多數(shù)pAgos 使用ssDNA 作為向導，相比之下，Cas 核酸酶使用RNA 作為向導［14］。DNA 比RNA 更穩(wěn)定且成本更低，有可能提高蛋白-核酸復合物的遞送效率。此外，pAgos 的分子質量比Cas9 小，有助于突破病毒載體包裝能力的限制［16］。因此，pAgos 正在快速被研究和應用于生物技術。本文總結了已表征的典型pAgos 蛋白的特性以及基于pAgos 的合成生物學應用研究進展。

1 Argonaute 的結構特征及功能

1.1 Argonaute 的結構特征

Ago 蛋白根據(jù)其來源可分為2 類：真核生物中的Ago 蛋白（eAgos）和原核生物（包括細菌和古細菌）中的Ago 蛋白（pAgos）［17］。eAgos 分為2 個主要系統(tǒng)發(fā)育分支，廣泛存在于不同的真核生物譜系中：Ago（eAgo）和PIWI（ePIWI）分支（圖1）。相比之下，pAgos的序列和結構域保守性較低［14，17］，因此被分為3個主要支系：long A、long B 和short pAgos［14，18］。大多數(shù)Agos 都依賴于一種保守的機制：使用小的（14～35 個核苷酸）單鏈核酸作為向導，結合互補的核酸靶標［19-28］。不同進化支系的Agos 依賴不同類型的向導核酸（ssDNA 或ssRNA），并引導不同的生物學途徑。Ago 蛋白和向導與靶標的互補性決定了靶標被裂解或是招募和/或激活輔助蛋白［19，21-22，29-34］。eAgos 和long pAgos 具有保守的4 個功能域和2個連接器（L）：N-L1-PAZ-L2-MID-PIWI（ 圖1）［17，24，27-28，35］。N 端結構域的保守性最低，其功能尚未完全明確。在一些eAgos 中，N 結構域在向導加載過程中解開RNA 雙鏈［22］，而在某些pAgos 中，N 端結構域有助于穩(wěn)定向導/靶核酸雙鏈［23］。MID 和PAZ 結構域分別錨定向導核酸的5'-端和3'-端，PIWI結構域則負責靶核酸的結合或裂解。在大多數(shù)具有靶裂解功能的Agos 中，PIWI 結構域通常包含1 個“DEDX”催化四聯(lián)體（ 其中X 可以是D、H 或K）［12，19］。與eAgos 和long pAgos 相比，short pAgos僅由MID 和PIWI 結構域組成，缺乏完整的“DEDX”四聯(lián)體，通常需要與輔助蛋白形成復合物來發(fā)揮功能（圖1）。

1.2 pAgos 蛋白質的功能

eAgo 通過結合小的單鏈RNA 分子形成RNA 誘導的沉默復合物，是RNA 干擾（RNAi）過程中的關鍵組分，參與轉錄調控和病毒防御［ 36］。pAgo蛋白可能在細胞防御病毒入侵中發(fā)揮重要作用，生物信息學分析結果顯示，Ago 基因通常與宿主防御相關蛋白的編碼基因（如限制性內切酶）位于相同的操縱子上［37］。還有一些pAgos 的編碼序列附近包含細菌抗噬菌體防御機制的元件，包括沉默信息調節(jié)器2（SIR2）或白細胞介素-1 受體（toll and interleukin-1receptor-like，TIR）結構域等［18，37-39］。最近的研究表明，long pAgos 參與細菌抵御噬菌體入侵，例如CbAgo（來自Clostridium butyricum）［32］；TtAgo（來自Thermus thermophilus）、PfAgo（來自Pyrococcus furi?osus）［31］和RsAgo（來自Rhodobacter sphaeroides）［23］能夠以不同的方式影響外源質粒的轉化效率。此外，pAgos 還可以執(zhí)行其他功能，例如，TtAgo 能夠與DNA 復制末端的DNA 片段結合，并招募DNA 復制相關蛋白，從而調控DNA 復制［24］。

TtAgo 和PfAgo 是目前研究得較為透徹的2 種嗜熱微生物來源的pAgos。TtAgo 通過DNA 引導的DNA 干擾機制，在體內通常與13～25 nt 的小干擾DNA（siDNA）向導分子結合，形成TtAgo-siDNA 復合物，能在DNA 水平實現(xiàn)外源核酸的切割［40］。在某些情況下，TtAgo 結合成對的單鏈DNA 向導可使雙鏈DNA 斷裂［22］。TtAgo 在體內能以此種方式降解入侵的DNA，降低外源核酸在宿主細胞中的含量。在體外實驗中，TtAgo 以5'-磷酸化的單鏈DNA（ss‐DNA）作為向導，不依賴于PAM 序列結合互補的靶DNA，從5'端的第10 和第11 個堿基之間切割靶核酸。除了靶向切割DNA，TtAgo 還表現(xiàn)出微弱的RNA 切割活性，在宿主體內可能參與降解入侵DNA轉錄產生的RNA，但這種功能仍需進一步驗證。

PfAgo 是目前體外應用研究最為廣泛的pAgo，比TtAgo 具有更高的反應溫度（87～99.9 °C）。與其他原核來源的Agos 類似，PfAgo 同樣能降低宿主菌的質粒轉化效率，這表明PfAgo 也參與抵御外源核酸入侵［31］。體外生化性質分析表明，PfAgo 在高溫下以大于14 nt 的5'-磷酸化gDNA 為向導，特異性裂解互補的單鏈DNA。Enghiad 等［41］在高溫條件下利用PfAgo 和成對的gDNA 實現(xiàn)對雙鏈DNA（dsDNA）靶的特異性切割，產生人工設計的黏性末端，因此可作為人工限制性內切酶使用，且具有極高的靈活性。

近年來，研究人員陸續(xù)報道了其他來源的longpAgos，包括Archaeoglobus fulgidus 來源的AfAgo、Aquifex aeolicus 來源的AaAgo、Kurthia massiliensis來源的KmAgo、Marinitoga piezophila 來源的MpAgo、Mucilaginibacter paludis 來源的MbpAgo、Marin?itoga hydrogenitolerans 來源的MhAgo 以及Thermo?toga profunda 來源的TpAgo。其中，AfAgo 傾向于以ssDNA 作為向導靶向DNA 切割，而AaAgo 以ssDNA 作為向導靶向RNA 切割［37］。編碼MpAgo 和TpAgo 的基因附近通常也存在CRISPR-Cas 酶的基因，表明它們在功能上可能關聯(lián)［42］。大多數(shù)pAgos使用5'- 磷酸化gDNA 切割ssDNA，而MpAgo 和TpAgo 在向導分子的生成和結合機制上與其他longpAgos 有所不同，偏愛使用5'-羥基化gRNA（5'-OHgRNA）切割互補的ssDNA 和ssRNA［42］。MhAgo 和KmAgo 是目前已知裂解活性最豐富的2 個pAgos，能夠利用gDNA 和/或gRNA 靶向裂解互補的DNA和/或RNA，可能是pAgos 向eAgos 進化的中間體［43-44］。MbpAgo 是第1 個從耐冷菌中發(fā)現(xiàn)的偏愛以gDNA 裂解RNA 的pAgo，在30～55 °C 范圍內具有活性，這提示耐冷或嗜冷菌也可作為中高溫生物活性酶的重要來源［45］。通過對pAgos 宿主的基因組進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，一些long pAgos 的編碼基因與Schlafen 樣ATP 酶的基因位于同一表達盒，也有一些pAgos 編碼基因附近伴隨著Cas4 樣、Mrr、Sir2 或磷脂酶D 核酸酶的基因［18］，這些酶可能在pAgos向導的形成、靶核酸的解鏈或降解等過程發(fā)揮功能。隨著對pAgos 研究的深入，越來越多不同類型的pAgos 的功能和性質被表征，為基于pAgos 的生物技術工具的發(fā)展奠定了基礎［22，31，38，42-49］（表1）。

2 pAgos 的體外應用研究

pAgos 能夠利用短的單鏈DNA（ssDNA）或RNA 作為向導，靶向并在特定位點裂解互補的靶核酸，這一特性為基于pAgos 的生物技術發(fā)展奠定了基礎。近年來，研究人員以pAgos 為核心開發(fā)了多種新型核酸檢測技術和DNA 組裝技術。

2.1 基于pAgos 的核酸檢測技術

目前，基于pAgos 的核酸檢測技術主要是基于極端嗜熱的PfAgo 和嗜熱的TtAgo。本文對基于這2種long pAgos 的核酸檢測技術進行了總結與分析（表2）。

1）基于TtAgo 的核酸檢測技術。TtAgo 是目前催化機制與結構信息最為清晰的pAgo［22］，Song等［50］利用TtAgo 的單堿基專一性發(fā)展了名為NIVIGATER（nucleic acid enrichment via DNA guided Argonautefrom Thermus thermophilus）的低豐度核酸富集/檢測技術（圖2A）。用TtAgo 特異性切割檢測體系中野生型核酸，從而對突變型起到富集作用，該技術可將癌癥標志物KRAS G12D 富集60 倍，將肽核酸（PNA）和異核酸（XNA）檢測靈敏度提高約100倍，能夠從胰腺癌患者的血液樣本中實現(xiàn)低頻（lt;0.01%，突變等位基因約1 拷貝）的檢測。

分析microRNA（miRNA）的表達水平不僅能為癌癥的生理和病理研究提供重要的生物學信息，而且能夠應用于腫瘤的早期篩查、監(jiān)測和預后，Lin等［51］開發(fā)了基于TtAgo 的腫瘤多重miRNA 檢測平臺——TEAM（Thermus thermophilus Argonaute-assistedexponential isothermal amplification for multiplexdetection）。TEAM 方法利用EXPAR 產生的大量擴增子作為gDNA，指導TtAgo 高效、精準地剪切分子信標，從而實現(xiàn)雙重信號放大檢測miRNA（圖2B）。該方法在10?1 ～10?8 mol/L 濃度范圍內具良好的線性關系，雙重信號放大策略使其檢測靈敏度達到1.0×10?18 mol/L。通過設計不同通道的分子信標，TEAM 可實現(xiàn)四重miRNA 的同步檢測和高度同源性的miRNA 家族成員的精準分型。

Jang 等［52］通過引入人工核酸電路和連續(xù)的Ago自催化反應實現(xiàn)一步式、非擴增的等溫DNA 檢測ANCA（artificial nucleic acid circuit with Ago protein，ANCA），利用該技術成功檢測了產碳青酶烯酶類肺炎克雷伯桿菌（carbapenemase-producing Klebsiellapneumoniae， CPKP），該方法可實現(xiàn)CPKP 的簡單、快速、準確診斷，有助于預防感染（圖2C）。

2）基于 PfAgo 的核酸檢測方法。PfAgo 是另外一種生化性質和結構研究較為明確且被廣泛使用的pAgo。He 等［53］發(fā)現(xiàn)，PfAgo 能夠在大于14 nt 的gDNA 介導下特異性切割dsDNA 中的1 條鏈，釋放出新的5′-磷酸末端ssDNA，這些新生5′-磷酸末端ssDNA 與反應體系中空的PfAgo 蛋白結合靶向互補的DNA，啟動第二輪切割，裂解體系中互補的熒光探針，產生熒光信號，通過熒光信號指示目標核酸的存在。基于這一“傳遞切割”原理，結合PCR 擴增技術，He 等［53］首次將pAgo 蛋白應用于核酸檢測領域，開發(fā)了PAND（PfAgo mediated nucleic acid detection，PAND）檢測技術（圖3A）。該技術可實現(xiàn)HPV 多亞型檢測，并區(qū)分單堿基突變。在新冠疫情暴發(fā)后，Wang 等［54］優(yōu)化了PAND 技術，只需1 條gDNA 即可檢測目標核酸，并建立了能夠高靈敏度、高準確度、快速多通道檢測SARS-COV2 的方法——SARSCOV2-PAND（圖3B）。Ye 等［55］將環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）與PfAgo 聯(lián)用，建立了新型多重快速核酸檢測平臺——MULAN（multiplex argonaute-based nucleic acid detection，MULAN），實現(xiàn)了對新冠及流感病毒樣本的高靈敏度、高特異性和快速便攜式檢測。

研究表明，當向導核酸的長度低于14 nt 時，無法介導PfAgo 對靶核酸進行有效切割，Wang 等［56］基于這一特性，結合連接酶鏈式反應，開發(fā)了PLCR 核酸檢測技術（pfago coupled with modified ligase chain reactionfor nucleic acid detection， PLCR）。在該方法中，利用連接酶以待測靶核酸為模板，將2 條短于14nt 的ssDNA（其中1 條具有5'-P 修飾）連接起來，作為PfAgo 的gDNA，靶向裂解體系中的分子信標（圖3C）［56］。He 等［57］利用PfAgo 對gDNA 長度的限制，將極短PCR（ultrashort PCR， usPCR）擴增與PfAgo結合，開發(fā)了USPCRP 檢測技術（nucleic acid detectionvia combination of ultrashort PCR and pyrococcusfuriosus Argonaute， USPCRP）。該方法將2 條短于14 nt 的ssDNA（其中1 條具有5'-P 修飾）通過極短PCR 進行延伸和擴增，其中帶有5'-P 修飾的DNA 產物作為gDNA，靶向裂解熒光探針（圖3D）［57］。USPCRP的檢測靈敏度為10 amol/L 并能區(qū)分單堿基的差異，He 等［57］利用該技術實現(xiàn)了對SARS-CoV-2、MERS-CoV 和SARS-CoV 的準確檢測。

PfAgo 的切割活性受到gDNA 與靶核酸配對的影響，gDNA 與靶核酸某些位點的錯配會導致PfAgo無法對靶核酸進行切割。Liu 等［58］基于此特性發(fā)展了“ 一管式”多重核酸富集和檢測的技術：A-Star（ago-directed specific target enrichment and detection），實現(xiàn)了血液等樣本中低豐度突變基因的高效、多重富集和檢測（圖3E）。A-Star 能夠檢測和定量0.01% 的稀有突變，富集效率高達5 500 倍。與傳統(tǒng)方法相比，A-Star 大大提高了稀有變異等位基因的檢測靈敏度，在基因診斷及遺傳疾病治療等領域具有廣闊的應用前景。與基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的檢測技術相比，基于pAgo 的檢測技術具有不依賴PAM序列，可以檢測任意靶標、以DNA 為向導，更高穩(wěn)定、成本更低，以及僅用1 種Ago 就能實現(xiàn)多重檢測的優(yōu)點，具有發(fā)展為“下一代”檢測技術的潛力［59］。

3）基于Short Ago 的核酸檢測方法。目前核酸檢測領域應用的TtAgo 和PfAgo 都屬于long pAgo，short Ago 也有發(fā)展為核酸檢測工具的潛力。Koopal等［21］發(fā)現(xiàn)了1 種新的short pAgo -TIR-APAZ（SPARTA）。SPARTA 由不具有催化活性的短pAgo和TIR-APAZ 蛋白共同形成異二聚體復合物，其中短的pAgo 作為“傳感器”，在gRNA 的引導下結合互補的ssDNA 靶，在與靶DNA 結合后，激活TIRAPAZ“效應體”的NAD（P）酶活性。在體內，SPARTA靶向入侵的質粒DNA，導致細胞NAD+ 和NADP+的耗竭，進而導致細胞死亡。研究人員利用這一特性開發(fā)了新的檢測方法，在SPARTA 檢測ss‐DNA 的體系中，通過引入與靶ssDNA 互補的gRNA，以及ε-NAD（NAD+的類似物），當靶ssDNA存在時，SPARTA 被激活，隨后將ε-NAD 轉化為熒光ε-ADPR。SPARTA 也可以改造成檢測dsDNA，可以通過靶擴增提高靈敏度（圖4A）［21］。Lu 等［60］也發(fā)展了基于另外一種來源于Thermocrispum munici?pal 的short Ago（TmuREAgo）及其相關蛋白DUF4365-APAZ 的核酸檢測技術（圖4B）。雖然short Ago 的檢測方法仍處于概念階段，但它們也有發(fā)展為新型即時檢測（POCT）技術的潛力。

2.2 基于pAgos 的DNA裝配技術

DNA 組裝是基礎研究、基因工程和合成生物學的基礎技術［61］。通常需要對多個DNA 模塊進行精確切割和組裝，用以在宿主細胞中構建新的代謝途徑。傳統(tǒng)的限制性內切酶切割和連接酶連接方法依賴于DNA 片段中的特定序列，既費時又昂貴。而且，在處理大DNA 片段或高通量DNA 組裝時，難以找到獨特的限制性內切酶識別位點。pAgos 通過目標DNA 與向導RNA 或DNA 的堿基配對來切割DNA 鏈，因此能夠識別和切割任意感興趣的DNA 序列。2017 年，Enghiad 等［41］開發(fā)了基于PfAgo 的人工限制性內切酶（AREs），利用5'P-gDNA 將PfAgo 引導到目標位點，并在高溫下（gt;87 ℃）進行精確切割。這些AREs 能夠識別和切割任意序列的DNA，并產生確定長度的黏性末端，從而更容易組裝和克隆大分子DNA。2022 年，Enghiad 等［62］進一步開發(fā)了PlasmidMaker 平臺用于大片段DNA 的組裝。該平臺包括：基于PfAgo 或其變體的人工限制性內切酶的DNA 組裝方法、用于質粒設計的用戶友好界面，以及簡化工作流程并與機器人系統(tǒng)集成的終端（圖5）。利用該平臺，研究人員構建了6 個不同模式生物的101 個質粒，大小為5～18 kb。

2.3 基于pAgos 的基因編輯技術

過去10 年，基因組編輯已經成為一種變革性的生物技術，廣泛應用于包括基因治療、動植物育種、工業(yè)菌株構建等領域，推動了合成生物學的快速發(fā)展［63］。pAgo 做為一種核酸引導的可編程核酸酶，具有發(fā)展為新型基因編輯工具的潛力。2016 年，Gao等（韓春雨團隊）報道了1 種基于NgAgo-gDNA 的基因組編輯技術［64］。他們證明來自N. gregoryi 的NgAgo 是一種DNA 引導的可編程核酸酶，可用于編輯哺乳動物細胞的基因組DNA。NgAgo 用于基因組編輯的優(yōu)點在于該系統(tǒng)不受PAM（protospacer adjacentmotif）序列的限制，理論上可對基因組任意位點進行編輯。此外，NgAgo 對向導和靶核酸之間的錯配具有低耐受性，且能高效編輯富含GC 的基因組區(qū)域。該技術報道后受到國內外研究人員的廣泛關注，然而許多實驗室無法再現(xiàn)該研究的結果，韓春雨團隊也因此撤回相關論文。隨后，Qi 等［65］發(fā)現(xiàn)NgAgo 能通過gDNA 介導斑馬魚的特定基因表達水平的下調，由于無催化活性的NgAgo 突變體（DEDX四聯(lián)體突變）也能引起基因表達水平的下調，研究人員推測這種下調是NgAgo-gDNA 復合物結合靶DNA 誘導轉錄沉默的結果，同時該研究也沒有發(fā)現(xiàn)NgAgo 具有基因編輯的能力。此外，Wu 等［66］證明NgAgo-gDNA 能誘導前基因組RNA（pregenomicRNA）的加速降解，從而在細胞水平上抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的復制。2019 年，F(xiàn)u等［67］發(fā)現(xiàn)pAgos（包括NgAgo、TtAgo、PfAgo 和AaAgo）能夠增強巴斯德氏菌和大腸桿菌中依賴于同源重組的基因插入或缺失的效率，并且這種增強不依賴于pAgos 的核酸切割活性，該機制的發(fā)現(xiàn)揭示了1 種用于增強細菌同源序列引導基因編輯的新系統(tǒng)。2021 年，Qu 等［68］報道了NgAgo-gDNA 在體內的基因編輯效應，并探究了其切割RNA 的位點。Esyunina 等［69］發(fā)現(xiàn)CbAgo 能結合質粒衍生的gDNA，靶向宿主的染色體，并能增強質粒與染色體DNA 的重組，并且這種增強依賴于CbAgo 的催化活性。這些研究表明pAgos 蛋白質具備基因編輯方面的潛力，然而將其發(fā)展為成熟的基因組編輯工具仍然需要對pAgos 蛋白質的催化機制進行深入的研究。

3 展望

相比于CRISPR/Cas 系統(tǒng)，pAgos 在生物技術方面具有巨大的潛力，尤其在目標選擇的靈活性、細胞傳遞效率和知識產權方面具有潛在的競爭優(yōu)勢。這些優(yōu)勢使得嗜熱pAgos 廣泛應用于體外分子診斷和DNA 組裝領域［63，70-71］。為了充分發(fā)揮pAgos 的潛力，特別是在細胞內的應用，需要發(fā)掘在中溫條件下具有高活性的pAgos，并闡明其功能關鍵細節(jié)，如底物拓撲偏好、DNA/RNA 序列偏好以及最佳操作溫度等。真核生物中缺乏pAgos 活性的報道，可能是因為體內難以形成有效的pAgo-guide 復合物。通過對pAgo 或guide 進行工程化設計可能解決這一問題。此外，該領域的另一個關鍵挑戰(zhàn)是如何有效遞送或生成pAgo 靶向的ssDNA 向導，這對于將pAgo 技術擴展到基因組規(guī)模的文庫至關重要。一旦克服這些障礙，pAgos 將不僅用于簡單的DNA 體外切割，還可以發(fā)展出豐富的體內應用技術。與基于Cas 的干擾和激活一樣，失去切割活性的pAgos 也可以用于基因表達調控、表觀基因組編輯和體內成像等［72-74］。與CRISPR-Cas 不同，pAgos 不受PAM 序列限制，能夠更靈活、精確地結合靶核酸，從而更有效地調控細胞表型。通過pAgo 切割事件介導的基因編輯將為這一領域提供一個強大的替代方案，可能在癌癥研究、疾病治療、動物模型構建和動植物育種等多個領域產生重大科學影響。

參考文獻 References

［1］ DINGERMANN T.Recombinant therapeutic proteins：production

platforms and challenges［J］.Biotechnology journal，2008，

3（1）：90-97.

［2］ REICHERT J M，ROSENSWEIG C J，F(xiàn)ADEN L B，et al.

Monoclonal antibody successes in the clinic［J］.Nature biotechnology，

2005，23（9）：1073-1078.

［3］ TOENNIESSEN G H，O’TOOLE J C，DEVRIES J. Advances

in plant biotechnology and its adoption in developing

countries［J］. Current opinion in plant biology，2003，6（2）：

191-198.

［4］ LYND L R，LASER M S，BRANSBY D，et al.How biotech

can transform biofuels［J］.Nature biotechnology，2008，26（2）：

169-172.

［5］ DANNA K，NATHANS D.Specific cleavage of simian virus

40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae

［J］.PNAS，1971，68（12）：2913-2917.

［6］ ROBERTS R J. How restriction enzymes became the workhorses

of molecular biology［J］.PNAS，2005，102（17）：5905-

5908.

［7］ LI H Y，YANG Y，HONG W Q，et al.Applications of genome

editing technology in the targeted therapy of human diseases：

mechanisms，advances and prospects［J/OL］.Signal transduction

and targeted therapy，2020，5（1）：1［2024-06-05］ .

https：//doi.org/10.1038/s41392-019-0089-y.

［8］ GUHA T K，WAI A，HAUSNER G.Programmable genome

editing tools and their regulation for efficient genome engineering

［J］. Computational and structural biotechnology journal，

2017，15：146-160.

［9］ CARROLL D.Genome engineering with zinc-finger nucleases

［J］.Genetics，2011，188（4）：773-782.

［10］ NEMUDRYI A A，VALETDINOVA K R，MEDVEDEV S

P，et al.TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems：

tools of discovery［J］.Acta naturae，2014，6（3）：19-40.

［11］ GIMBLE F S，WANG J. Substrate recognition and induced

DNA distortion by the PI-SceI endonuclease，an enzyme generated

by protein splicing［J］. Journal of molecular biology，

1996，263（2）：163-180.

［12］ COLLIAS D，BEISEL C L. CRISPR technologies and the

search for the PAM-free nuclease［J/OL］.Nature communications，

2021，12（1）：555［2024-06-05］. https：//doi. org/

10.1038/s41467-020-20755-1.

［13］ LI Y R，LIAO D，KOU J，et al.Comparison of CRISPR/Cas

and Argonaute for nucleic acid tests［J］.Trends in biotechnology，

2023，41（5）：595-599.

［14］ RYAZANSKY S，KULBACHINSKIY A，ARAVIN A A.

The expanded universe of prokaryotic argonaute proteins［J/

OL］. mBio，2018，9（6）：e01935-18［2024-06-05］. https：//

doi.org/10.1128/mBio.01935-18.

［15］ HEGGE J W，SWARTS D C，VAN DER OOST J.Prokaryotic

Argonaute proteins：novel genome-editing tools？［J］. Nature

reviews microbiology，2018，16（1）：5-11.

［16］ CHEW W L，TABEBORDBAR M，CHENG J K W，et al.A

multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response［J］.

Nature methods，2016，13（10）：868-874.

［17］ SWARTS D C，MAKAROVA K，WANG Y L，et al. The

evolutionary journey of Argonaute proteins［J］.Nature structural

amp; molecular biology，2014，21（9）：743-753.

［18］ MAKAROVA K S，WOLF Y I，VAN DER OOST J，et al.

Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to

function as key components of a novel system of defense

against mobile genetic elements［J/OL］.Biology direct，2009，

4：29 ［2024-06-05］. https：//doi. org/10.1186/1745-6150-

4-29.

［19］ OZATA D M，GAINETDINOV I，ZOCH A，et al.PIWI-interacting

RNAs：small RNAs with big functions［J］.Nature reviews

genetics，2019，20：89-108.

［20］ PARK M S，SIM G，KEHLING A C，et al.Human Argonaute

2 and Argonaute 3 are catalytically activated by different

lengths of guide RNA［J］. PNAS，2020，117（46）：28576-

28578.

［21］ KOOPAL B，POTOCNIK A，MUTTE S K，et al.Short prokaryotic

Argonaute systems trigger cell death upon detection

of invading DNA［J］.Cell，2022，185（9）：1471-1486.

［22］ SWARTS D C，JORE M M，WESTRA E R，et al. DNAguided

DNA interference by a prokaryotic Argonaute［J］.Nature，

2014，507（7491）：258-261.

［23］ OLOVNIKOV I，CHAN K，SACHIDANANDAM R，et al.

Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign

DNA［J］.Molecular cell，2013，51（5）：594-605.

［24］ WANG Y L，SHENG G，JURANEK S，et al.Structure of the

guide-strand-containing argonaute silencing complex［J］. Nature，

2008，456（7219）：209-213.

［25］ WANG Y L，JURANEK S，LI H T，et al.Nucleation，propagation

and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes

［J］.Nature，2009，461（7265）：754-761.

［26］ WANG Y L，JURANEK S，LI H T，et al.Structure of an argonaute

silencing complex with a seed-containing guide DNA

and target RNA duplex［J］.Nature，2008，456（7224）：921-926.

［27］ NAKANISHI K，WEINBERG D E，BARTEL D P，et al.

Structure of yeast Argonaute with guide RNA［J］. Nature，

2012，486（7403）：368-374.

［28］ SCHIRLE N T，MACRAE I J.The crystal structure of human

Argonaute 2［J］.Science，2012，336（6084）：1037-1040.

［29］ ZAREMBA M，DAKINEVICIENE D，GOLOVINAS E，et

al. Short prokaryotic Argonautes provide defence against incoming

mobile genetic elements through NAD+ depletion［J］.

Nature microbiology，2022，7：1857-1869.

［30］ ZENG Z F，CHEN Y，PINILLA-REDONDO R，et al. A

short prokaryotic Argonaute activates membrane effector to

confer antiviral defense［J］.Cell host amp; microbe，2022，30（7）：

930-943.

［31］ SWARTS D C，HEGGE J W，HINOJO I，et al.Argonaute of

the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease

that targets cognate DNA［J］.Nucleic acids research，2015，43

（10）：5120-5129.

［32］ KUZMENKO A，OGUIENKO A，ESYUNINA D，et al.

DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease

［J］.Nature，2020，587（7835）：632-637.

［33］ WILSON R C，DOUDNA J A. Molecular mechanisms of

RNA interference［J］.Annual review of biophysics，2013，42：

217-239.

［34］ SHENG G，ZHAO H T，WANG J Y，et al. Structure-based

cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute

DNA guide strand-mediated DNA target cleavage［J］.PNAS，

2014，111（2）：652-657.

［35］ KOOPAL B，MUTTE S K，SWARTS D C. A long look at

short prokaryotic Argonautes［J］.Trends in cell biology，2023，

33（7）：605-618.

［36］ WU J E，YANG J，CHO W C，et al.Argonaute proteins：structural

features，functions and emerging roles［J］. Journal of advanced

research，2020，24：317-324.

［37］ YUAN Y R，PEI Y，MA J B，et al.Crystal structure of A.aeolicus

argonaute，a site-specific DNA-guided endoribonuclease，

provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage［J］.

Molecular cell，2005，19（3）：405-419.

［38］ KUZMENKO A，YUDIN D，RYAZANSKY S，et al. Programmable

DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic

bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea［J］.Nucleic

acids research，2019，47（11）：5822-5836.

［39］ HEGGE J W，SWARTS D C，CHANDRADOSS S D，et al.

DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by

Clostridium butyricum Argonaute［J］.Nucleic acids research，

2019，47（11）：5809-5821.

［40］ SWARTS D C，KOEHORST J J，WESTRA E R，et al.Effects

of argonaute on gene expression in Thermus thermophilus

［J/OL］. PLoS One，2015，10（4）：e0124880［2024-06-05］.

https：//doi.org/10.1371/journal.pone. 0124880.

［41］ ENGHIAD B，ZHAO H M.Programmable DNA-guided artificial

restriction enzymes［J］. ACS synthetic biology，2017，6

（5）：752-757.

［42］ KAYA E，DOXZEN K W，KNOLL K R，et al.A bacterial Argonaute

with noncanonical guide RNA specificity［J］.PNAS，

2016，113（15）：4057-4062.

［43］ WANG L Y，XIE X C，LV B，et al. A bacterial Argonaute

with efficient DNA and RNA cleavage activity guided by

small DNA and RNA［J/OL］. Cell reports，2022，41（4）：

111533 ［2024-06-05］. https：//doi. org/ 10.1016/j. celrep.

2022.111533.

［44］ LIU Y，LI W Q，JIANG X M，et al.A programmable omnipotent

Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia mas?

siliensis［J］.Nucleic acids research，2021，49（3）：1597-1608.

［45］ LI W Q，LIU Y，HE R Y，et al.A programmable pAgo nuclease

with RNA target preference from the psychrotolerant bacterium

Mucilaginibacter paludis［J］. Nucleic acids research，

2022，50（9）：5226-5238.

［46］ CAO Y W，SUN W，WANG J F，et al. Argonaute proteins

from human gastrointestinal bacteria catalyze DNA-guided

cleavage of single- and double-stranded DNA at 37 ℃［J/OL］.

Cell discovery，2019，5：38［2024-06-05］. https：//doi. org/

10.1038/s41421-019-0117-1.

［47］ CHONG Y S，LIU Q，HUANG F，et al.Characterization of a

recombinant thermotolerant argonaute protein as an endonuclease

by broad guide utilization［J/OL］.Bioresources and bioprocessing，

2019，6（1）：21［2024-06-05］. https：//doi. org/

10.1186/s40643-019-0242-1.

［48］ WILLKOMM S，OELLIG C A，ZANDER A，et al.Structural

and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute

protein［J/OL］. Nature microbiology，2017，2：17035

［2024-06-05］. https：//doi.org/10.1038/ nmicrobiol.2017.35.

［49］ PANTELEEV V，KROPOCHEVA E，ESYUNINA D，et al.

Strong temperature effects on the fidelity of target DNA recognition

by a thermophilic PAgo nuclease［J］. Biochimie，2023，

209：142-149.

［50］ SONG J Z，HEGGE J W，MAUK M G，et al.Highly specific

enrichment of rare nucleic acid fractions using Thermus

thermophilus argonaute with applications in cancer diagnostics

［J/OL］. Nucleic acids research，2020，48（4）：e19［2024-06-

05］.https：//doi.org/10.1093/nar/gkaa127.

［51］ LIN Q Y，HAN G B，F(xiàn)ANG X E，et al.Programmable analysis

of microRNAs by Thermus thermophilus argonaute-assisted

exponential isothermal amplification for multiplex detection

（TEAM）［J］. Analytical chemistry，2022，94（32）：11290-

11297.

［52］ JANG H，SONG J，KIM S，et al.ANCA：artificial nucleic acid

circuit with argonaute protein for one-step isothermal detection

of antibiotic-resistant bacteria［J/OL］. Nature communications，

2023，14（1）：8033［2024-06-05］. https：//doi. org/

10.1038/s41467-023-08456-1.

［53］ HE R Y，WANG L Y，WANG F，et al. Pyrococcus furiosus

Argonaute-mediated nucleic acid detection［J］.Chemical communications，

2019，55（88）：13219-13222.

［54］ WANG F，YANG J，HE R Y，et al.PfAgo-based detection of

SARS-CoV-2［J/OL］. Biosensors and bioelectronics，2021，

177：112932［2024-06-05］. https：//doi. org/10.1016/j. bios.

2021.112932.

［55］ YE X Y，ZHOU H W，GUO X，et al. Argonaute-integrated

isothermal amplification for rapid，portable，multiplex detection

of SARS-CoV-2 and influenza viruses［J/OL］.Biosensors and

bioelectronics，2022，207：114169［2024-06-05］. https：//doi.

org/10.1016/j.bios.2022.114169.

［56］ WANG L Y，HE R Y，LV B，et al.Pyrococcus furiosus Argonaute

coupled with modified ligase chain reaction for detection

of SARS-CoV-2 and HPV［J/OL］. Talanta，2021，227：

122154 ［2024-06-05］. https：// doi. org/10.1016/j. talanta.

2021.122154.

［57］ HE R Y，WANG L Y，WANG F，et al.Combination of ultrashort

PCR and Pyrococcus furiosus Argonaute for DNA detection

［J］.The analyst，2021，147（1）：35-39.

［58］ LIU Q，GUO X，XUN G H，et al.Argonaute integrated singletube

PCR system enables supersensitive detection of rare mutations

［J/OL］. Nucleic acids research，2021，49（13）：e75

［2024-06-05］.https：//doi. org/10.1093/nar/gkab400.

［59］ YIN L J，MAN S L，YE S Y，et al.CRISPR-Cas based virus

detection：recent advances and perspectives［J/OL］. Biosensors

and bioelectronics，2021，193：113541［2024-06-05］.

https：//doi.org/10.1016/j.bios.2021. 113541.

［60］ LU X L，XIAO J，WANG L F，et al.The nuclease-associated

short prokaryotic Argonaute system nonspecifically degrades

DNA upon activation by target recognition［J］. Nucleic acids

research，2024，52（2）：844-855.

［61］ KEASLING J D. Synthetic biology and the development of

tools for metabolic engineering［J］. Metabolic engineering，

2012，14（3）：189-195.

［62］ ENGHIAD B，XUE P，SINGH N，et al. PlasmidMaker is a

versatile，automated，and high throughput end-to-end platform

for plasmid construction［J/OL］. Nature communications，

2022，13（1）：2697［2024-06-05］. https：//doi. org/10.1038/

s41467-022-22892-3.

［63］ PACESA M，PELEA O，JINEK M.Past，present，and future

of CRISPR genome editing technologies［J］. Cell，2024，187

（5）：1076-1100.

［64］ GAO F，SHEN X Z，JIANG F，et al.DNA-guided genome editing

using the Natronobacterium gregoryi Argonaute［J］.Nature

biotechnology，2016，34（7）：768-773.

［65］ QI J L，DONG Z J，SHI Y W，et al. NgAgo-based fabp11a

gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish

［J］.Cell research，2016，26（12）：1349-1352.

［66］ WU Z C，TAN S Y，XU L Q，et al.NgAgo-gDNA system efficiently

suppresses hepatitis B virus replication through accelerating

decay of pregenomic RNA［J］. Antiviral research，

2017，145：20-23.

［67］ FU L，XIE C Y，JIN Z H，et al. The prokaryotic Argonaute

proteins enhance homology sequence-directed recombination

in bacteria［J］.Nucleic acids research，2019，47（7）：3568-3579.

［68］ QU J Y，XIE Y L，GUO Z Y，et al. Identification of a novel

cleavage site and confirmation of the effectiveness of NgAgo

gene editing on RNA targets［J］. Molecular biotechnology，

2021，63（12）：1183-1191.

［69］ ESYUNINA D，OKHTIENKO A，OLINA A，et al.Specific

targeting of plasmids with Argonaute enables genome editing

［J］.Nucleic acids research，2023，51（8）：4086-4099.

［70］ 劉妍，孫凱，田春雨，等. 基于Argonaute 的病毒核酸檢測技術

研究進展［J］. 病毒學報，2023，39（5）：1414-1424.LIU Y，

SUN K，TIAN C Y，et al. Research progress on argonautebased

virus nucleic acid detection technology［J］.Chinese journal

of virology，2023，39（5）：1414-1424（ in Chinese with English

abstract）.

［71］ QIN Y Q，LI Y J，HU Y G.Emerging Argonaute-based nucleic

acid biosensors［J］.Trends in biotechnology，2022，40（8）：

910-914.

［72］ LARSON M H，GILBERT L A，WANG X W，et al.CRISPR

interference （CRISPRi） for sequence-specific control of

gene expression［J］.Nature protocols，2013，8（11）：2180-2196.

［73］ SCHULTENK?MPER K，BRITO L F，WENDISCH V F.

Impact of CRISPR interference on strain development in biotechnology

［J］.Biotechnology and applied biochemistry，2020，

67（1）：7-21.

［74］ WU Y K，LI Y，JIN K，et al.CRISPR-dCas12a-mediated genetic

circuit cascades for multiplexed pathway optimization［J］.

Nature chemical biology，2023，19（3）：367-377.

（責任編輯：張志鈺）