離子交換樹脂分離純化天然橡膠乳清中麥角硫因

關(guān)鍵詞：天然橡膠乳清；麥角硫因；離子交換樹脂

中圖分類號：TQ332 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

麥角硫因（L-ergothioneine，EGT）是一種天然氨基酸類強(qiáng)抗氧化劑，化學(xué)式為C₉H₁₅N₃O₂S，具有抗氧化、維持DNA 的生物合成、細(xì)胞的正常生長和細(xì)胞免疫等多種生物活性[1]，也因其具有抗輻射、美白和抗衰老等功效而應(yīng)用于高端化妝品中[2]。自2005 年發(fā)現(xiàn)EGT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ETT/OCTN1）以后，EGT 逐漸成為研究的熱點(diǎn)，與之相應(yīng)的針對該化合物的報(bào)道也呈指數(shù)級增長[3]。自然界中，EGT 主要由微生物合成，植物和動(dòng)物自身不能合成，只能從外部攝取[4-5]。EGT 的制備方法有天然生物提取法、化學(xué)合成法和生物合成法。天然生物提取法所用原料主要是蘑菇類真菌，但因其含量低，原料成本高，不具備工業(yè)化提取價(jià)值?；瘜W(xué)合成法有溶劑殘留和合成成本高的問題，采用此方法的生產(chǎn)廠家較少。目前工業(yè)化生產(chǎn)EGT 主要采用生物合成法，隨著生物合成學(xué)的快速發(fā)展，大大加快了微生物發(fā)酵生產(chǎn)EGT 的研究[6]。目前公開報(bào)道制備EGT 的最高水平為發(fā)酵220 h產(chǎn)量達(dá)到（1.63±0.04）g/L[7]，但受發(fā)酵設(shè)備及發(fā)酵周期的制約，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的成本較高，至今EGT價(jià)格依然高達(dá)20 萬元/kg，生物合成法還有待更進(jìn)一步的技術(shù)突破。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）是熱帶地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)林木，所產(chǎn)天然膠乳是一種乳狀水分散體，由約35%的橡膠烴粒子和65%的乳清組成。1968 年TAN 等[8]首次在天然膠乳中發(fā)現(xiàn)有EGT，因其是由土壤中的微生物合成[9]，所以受季節(jié)、植膠環(huán)境的影響較大。筆者對多個(gè)樣品檢測發(fā)現(xiàn)，EGT 在西雙版納地區(qū)所取天然橡膠乳清（NRS）中的含量通常在10～15 mg/L，最高為113 mg/L，最低為2.7 mg/L?？赡芤?yàn)镹RS 中EGT 含量過低，至今未見工業(yè)化提取的報(bào)道，但相較于生物合成法，NRS 有著一項(xiàng)無可比擬的優(yōu)勢，我國天然橡膠種植面積為113.33 余萬hm²，干膠產(chǎn)量約為80 萬t[10]，由此產(chǎn)生巨量的NRS，且屬于零成本甚至負(fù)成本的EGT 提取原料，因?yàn)樵谥颇z廠，NRS 作為高濃有機(jī)廢水的處理成本高昂。

本研究通過對比9 種離子交換樹脂對EGT 的吸附-解吸效果，篩選出了效果較好的樹脂型號，并研究了該樹脂的最佳吸附和洗脫條件，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該樹脂能很好地對NRS 中的EGT 進(jìn)行分離純化，為從NRS 中工業(yè)化提取EGT 提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為：乳清（天然膠乳加酸凝固后擠壓獲得）；麥角硫因（上海麥角硫因生物科技集團(tuán)有限公司）；0017、S1100 離子交換樹脂（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）；SA-2 離子交換樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；D001、D61、D72、D81、JK008、001×10 離子交換樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司）；超濾膜、納濾膜（SUEZ 環(huán)境集團(tuán)）。

儀器設(shè)備：4040 型、2540 型膜分離設(shè)備（杭州道納膜科技有限公司）；UV-2700 型紫外分光光度計(jì)（日本島津制作所）；CHA-SAS 制冷氣浴恒溫振蕩器（常州市金壇區(qū)指前鎮(zhèn)旭日實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 上樣液制備 NRS 過2500 Da 超濾膜，濾過液過納濾膜，收集截留液繼續(xù)減壓蒸餾至原NRS 體積的1%～2%，濃縮液用1%活性炭70～80 ℃脫色30 min，得到無色乳清處理液，加入5倍體積的去離子水，并用EGT 純品調(diào)至所需濃度，備用。

1.2.2 離子交換樹脂預(yù)處理 新購樹脂置于燒杯中，用飽和食鹽水浸泡樹脂24 h，然后用去離子水洗滌至上清液無色無異味。用4 倍樹脂體積的1 mol/L 的HCl 溶液浸泡4 h，去離子水洗滌至pH為5 左右，再用4 倍樹脂體積的1 mol/L 的NaOH溶液浸泡4 h，去離子水洗滌至中性，最后用4倍樹脂體積的1 mol/L HCl 溶液浸泡6 h，將樹脂轉(zhuǎn)換為H 型，用去離子水洗滌至pH 5～6 后備用。

1.2.3 裝柱 取預(yù)處理過的樹脂緩慢轉(zhuǎn)移至層析柱內(nèi)，柱床體積為50 mL，柱規(guī)格為200 mm25 mm，柱內(nèi)預(yù)先加入高度為4 cm 的去離子水，液面上升至距管口2 cm 處結(jié)束，待樹脂完全沉下后用去離子水以2 BV/h 速度平衡樹脂柱，去離子水用量為2～3 BV。

1.2.4 EGT 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密稱取EGT 純品10 mg，于100 mL 容量瓶中加純水配制成濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別吸取0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容于10 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在波長258 nm 條件下用紫外分光光度計(jì)測出標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 離子交換樹脂篩選 稱取2 g 經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂，置于150 mL 具塞三角瓶中，加入EGT濃度為1.5 mg/mL，pH 為4.0 的上樣液40 mL，在25 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min 的搖床中振蕩24 h，使樹脂吸附飽和，取上清液測定溶液中EGT 的濃度，并按公式計(jì)算各樹脂對EGT 的靜態(tài)吸附容量（Q）和吸附率（X）。

將吸附飽和的樹脂濾去殘液，用去離子水洗滌2 次，加入質(zhì)量濃度0.5%的氨水40 mL，在25 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min 的搖床中振蕩解吸12 h，取上清液測定EGT 含量，并計(jì)算解吸率（B）。

式中，Q 為樹脂對EGT 的靜態(tài)吸附容量，mg/g；X 為樹脂對EGT 的吸附率，%；B 為洗脫液對EGT的解吸率，%；C₀ 為EGT 的初始濃度，mg/mL；C₁ 為吸附結(jié)束后溶液中EGT 濃度，mg/mL；V₁為所加入的上樣液體積，mL；m 為樹脂的質(zhì)量，g；C₂ 為解吸液中EGT 濃度，mg/mL；V₂ 為所加入的解吸液體積，mL。

1.2.6 無機(jī)鹽濃度對樹脂吸附的影響 稱取2.00 g 預(yù)處理好的SA-2、D61 樹脂各4 份，依次加入50 mL、pH 4.0 濃度為2.5 mg/mL 的EGT 標(biāo)準(zhǔn)品配制液，其中NaCl 濃度分別為0、0.1、0.5、1 mol/L，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min持續(xù)振蕩6 h，測定上清液中的EGT 含量，通過靜態(tài)吸附容量考察無機(jī)鹽對吸附的影響。

1.2.7 SA-2 陽離子交換樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 稱取4 g 經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂，置于250 mL 具塞三角瓶中，加入EGT 濃度為2.5 mg/mL，pH 4.0的上樣液100 mL，分別于吸附0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)取0.5 mL 上清液，測定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液的EGT 含量和吸附量，繪制SA-2 樹脂靜態(tài)吸附曲線。

1.2.8 pH 對樹脂吸附的影響 稱取2.00 g 預(yù)處理好的SA-2 樹脂6 份，依次加入40 mL pH 分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，濃度為1.5 mg/mL的上樣液，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min持續(xù)振蕩24 h，測定上清液中的EGT 含量，通過靜態(tài)吸附容量確定最佳pH。

1.2.9 氨水濃度對解吸率的影響 稱取2.00 g 預(yù)處理好的SA-2 樹脂6 份，依次加入50 mL pH 4.0濃度為2.5 mg/mL 的上樣液，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min 持續(xù)振蕩24 h，抽濾洗滌樹脂，分別加入濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%和5%的氨水溶液50 mL 解吸12 h，測定上清液中的EGT 含量，通過解吸率確定最佳氨水濃度。

1.2.10 上樣液濃度對樹脂吸附的影響 配制pH為4.0，EGT 濃度分別為2.5、5.0 和10 mg/mL 的上樣液，以2 BV/h 的流速進(jìn)行上樣吸附，當(dāng)流出液中EGT 濃度達(dá)到上樣液濃度的10%時(shí)為EGT的穿透點(diǎn)，停止上樣。用2 BV 去離子水洗滌樹脂，收集流出液和洗滌液，測量其體積和EGT 濃度，計(jì)算樹脂的吸附量，考察不同上樣液濃度下樹脂對EGT 的吸附效果。

1.2.11 上樣液流速對樹脂吸附的影響 取3 份處理好的SA-2 樹脂各50 mL 裝柱，將EGT 濃度為5 mg/mL、pH 4.0 的上樣液上柱，分別控制上樣液以1、2、3 BV/h 的流速通過層析柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，當(dāng)流出液中EGT 濃度達(dá)到上樣液濃度的10%時(shí)，停止上樣，測定流出液中EGT 含量，通過吸附量確定最佳上樣液流速。

1.2.12 洗脫流速對洗脫效果的影響 SA-2 樹脂吸附完成后，用2 BV 的去離子水洗柱，用濃度0.5%的氨水溶液分別以1、2、3 BV/h 的流速對樹脂柱進(jìn)行洗脫，0.5 BV 每管收集洗脫液，測定EGT濃度，繪制洗脫曲線，確定最佳洗脫流速。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.1.1 離子交換樹脂的篩選 試驗(yàn)選用了9 個(gè)型號的離子交換樹脂，不同離子交換樹脂對EGT 的吸附量、吸附率和解吸率如表1 所示，SA-2 陽離子交換樹脂對EGT 具有最高的吸附率，D001 和D61 樹脂吸附率相當(dāng)，但D61 比D001 有著更高的解吸率，綜合考慮，初步選定凝膠型的SA-2和大孔型的D61 兩種樹脂作為后續(xù)試驗(yàn)用樹脂。

2.1.2 無機(jī)鹽濃度對樹脂吸附效果的影響 NRS中含有各種無機(jī)鹽，能夠被陽離子交換樹脂吸附，對樹脂吸附EGT 具有較大影響。在EGT 純品配制的上樣液中添加不同比例的NaCl，考察無機(jī)鹽濃度對樹脂吸附效果的影響，結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出，0.5 mol/L 及以下的NaCl 濃度對SA-2 樹脂吸附EGT幾乎無影響，甚至0.1 mol/L的低濃度NaCl 會(huì)提升SA-2 樹脂對EGT 的吸附。當(dāng)NaCl 濃度繼續(xù)增大時(shí)，樹脂對EGT 的吸附量呈下降趨勢，NaCl 濃度達(dá)到1 mol/L 時(shí)，樹脂對EGT 的吸附量降至39.48 mg/g。而D61 樹脂則受NaCl 的影響較大，當(dāng)NaCl 濃度由0 增加至0.1 mol/L 時(shí)，其對EGT 的吸附量由28.70 mg/g陡降至16.13 mg/g，并隨著NaCl 濃度升高而逐步降低。試驗(yàn)最終確定SA-2 陽離子交換樹脂作為后續(xù)試驗(yàn)用樹脂。

2.1.3 SA-2 陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 SA-2 陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附過程如圖2 所示，在吸附開始的0.5 h 內(nèi)EGT 快速吸附至SA-2 樹脂內(nèi)部，吸附量達(dá)到31.63 mg/g，吸附率為56.39%，隨后吸附速度明顯降低。這是因?yàn)橐环矫骐S著吸附的進(jìn)行，溶液中EGT 濃度逐漸降低，其與樹脂上的H+交換效率逐漸降低，吸附速度隨之下降；而另一方面，在吸附初期，吸附過程處于液膜擴(kuò)散階段，溶液中的EGT 被快速吸附至樹脂表面，隨著吸附時(shí)間的延長，吸附進(jìn)入膜擴(kuò)散和粒內(nèi)擴(kuò)散階段，溶液中的EGT 受到樹脂表面以及樹脂孔隙產(chǎn)生的阻力增加，擴(kuò)散速度逐漸降低[11]，24 h 后吸附量最終達(dá)到54.88 mg/g，吸附率達(dá)到97.96%。

2.1.4 pH 對吸附效果的影響 pH 對離子交換平衡有著重要影響，其通過影響溶液中物質(zhì)的帶電性從而影響離子交換樹脂的交換容量[12]。工廠內(nèi)天然膠乳加酸凝固后獲得的乳清pH 一般在4～5之間，試驗(yàn)選定pH 測試范圍為2.5～5.0。如圖3所示，SA-2 樹脂對EGT 的吸附隨pH 的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)pH 在3.0～4.0 之間時(shí)，SA-2 樹脂對EGT 的吸附量較大，吸附量范圍為19.77～20.00 mg/g，pH 2.5 或4.8 時(shí)吸附量相當(dāng)，分別為18.60 mg/g 和18.64 mg/g，整體而言，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，pH 對吸附效果有一定影響，但影響較小。

2.1.5 洗脫液濃度對解吸率的影響 試驗(yàn)采用易于蒸餾去除的氨水作為洗脫劑，氨水濃度對解吸率的影響如圖4 所示。由圖4 可知，0.1%質(zhì)量濃度的氨水溶液對EGT 的解吸率較低， 只有35.52%，當(dāng)氨水質(zhì)量濃度達(dá)到0.5%時(shí)，解吸率達(dá)到最高72.92%，隨著氨水濃度的繼續(xù)升高，解吸率呈逐漸下降趨勢，這是因?yàn)橄疵撘褐械腘H4+對離子交換樹脂表面的雙電層不僅有交換作用，還有壓縮作用，隨著洗脫液濃度的增大，樹脂反離子的擴(kuò)散層被壓縮，擴(kuò)散層中部分反離子變成固定層中的反離子，擴(kuò)散層的活動(dòng)范圍變小，從而影響了洗脫效果。當(dāng)氨水質(zhì)量濃度達(dá)到5%時(shí)，解吸率降至63.27%，試驗(yàn)最終確定最佳洗脫液的氨水質(zhì)量濃度為0.5%。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

2.2.1 上樣液濃度對樹脂動(dòng)態(tài)吸附效果的影響NRS 中的EGT 非由橡膠樹合成，不同季節(jié)、不同植膠環(huán)境都有可能導(dǎo)致EGT 含量的差別，這也導(dǎo)致制備的乳清處理液中EGT 的濃度會(huì)有較大差異。試驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制備的乳清處理液中EGT濃度僅為1.5 mg/mL 左右，后提高到2.5 mg/mL，目前可以達(dá)到5 mg/mL，隨著技術(shù)成熟，會(huì)進(jìn)一步提高乳清處理液中的EGT 濃度，所以，本試驗(yàn)配制的上樣液最高濃度到10 mg/mL，考察EGT濃度對吸附效果的影響。

以流出液中EGT質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液質(zhì)量濃度的10%時(shí)，為停止上樣點(diǎn)[13-14]。EGT 濃度分別為2.5、5.0、10 mg/mL 的上樣液的上樣體積分別為32.5、20.5、19.5 BV。濃度為10 mg/mL 的上樣液上樣體積大大低于濃度為2.5 mg/mL 的上樣液，可大幅縮減上樣時(shí)間。由圖5 可知，上樣液濃度為10 mg/mL 時(shí)，SA-2 樹脂對EGT 的吸附量高達(dá)214.51 mg/g，遠(yuǎn)大于上樣液濃度為2.5 mg/mL 的68.49 mg/g 和濃度為5.0 mg/mL 的83.84 mg/g 的吸附量，這可能是因?yàn)檩^高濃度的上樣液變相降低了溶液中無機(jī)鹽、氨基酸類物質(zhì)的相對濃度，高濃度上樣液10%停止上樣點(diǎn)的濃度較高也是一個(gè)重要原因。綜上可知，在制備乳清上樣液時(shí)，應(yīng)盡量提高EGT 濃度。

2.2.2 上樣液流速對樹脂動(dòng)態(tài)吸附效果的影響上樣液流速對樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響如圖6 所示，從圖6 可以看出，上樣流速越快，流出液濃度上升越快，越早達(dá)到上樣液濃度的10%，即停止上樣點(diǎn)，這就意味著樹脂對EGT 的吸附量也越少，上樣液流速為1、2、3 BV/h 對應(yīng)的上樣體積分別為10、9.5、8.5 BV，對應(yīng)的上樣時(shí)間分別為10、4.75、2.83 h，兼顧吸附量和生產(chǎn)效率，確定2 BV/h為最佳上樣流速。

2.2.3 洗脫流速對樹脂洗脫性能的影響 不同洗脫流速下的洗脫曲線如圖7 所示，從圖7 可以看出，洗脫流速越低，峰型越集中，峰寬也更窄，當(dāng)洗脫流出液中EGT 濃度降至5 mg/L 左右時(shí)，1、2、3 BV/h 的洗脫流速分別需要6、9.5、16 BV 的洗脫液，對應(yīng)的洗脫時(shí)間分別為6、4.75、5.3 h。3 個(gè)流速下所需洗脫時(shí)間差別不大但洗脫液用量差異較大，這是因?yàn)橄疵摿魉僭娇?，洗脫液在樹脂?nèi)的停留時(shí)間越短，洗脫液還未充分交換樹脂吸附的EGT 就已經(jīng)穿透流出，洗脫流速越快所需洗脫液的量也就越大。綜合考慮洗脫時(shí)間以及洗脫液用量，確定最佳洗脫流速為1 BV/h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證試驗(yàn)不僅是對篩選出的SA-2 樹脂進(jìn)行驗(yàn)證，其目的也包括利用所選樹脂對乳清處理方法進(jìn)行調(diào)整、優(yōu)化。前4 次驗(yàn)證試驗(yàn)中，采用完全由NRS 制備的上樣液，上樣體積在1 BV 時(shí)流出液中EGT 濃度即超過了上樣液濃度的10%，甚至達(dá)到30%的濃度，樹脂對EGT 的吸附量最低僅為4 mg/g，經(jīng)過不斷調(diào)整乳清處理方法，最終得到吸附洗脫效果都較好的乳清處理液。

采用完全由NRS 制備的上樣液，充分去除無機(jī)鹽等雜質(zhì)，測得上樣液中EGT 濃度為2780.12 mg/L，pH 為2.5，考慮到無機(jī)鹽比pH 對SA-2 樹脂吸附EGT 的影響更大，驗(yàn)證試驗(yàn)未調(diào)節(jié)上樣液pH，以免引入更多的無機(jī)鹽。由圖8 可以看出，當(dāng)上樣體積達(dá)到14.5 BV 時(shí)，流出液的EGT 濃度達(dá)到280.01 mg/L，達(dá)到上樣液濃度的10%，用2 BV的去離子水洗滌樹脂，計(jì)算得到樹脂對EGT 的吸附量為40.18 mg/g，吸附情況良好。

用0.5%質(zhì)量濃度的氨水溶液以1 BV/h 流速對樹脂柱進(jìn)行洗脫，由圖9 可以看出，當(dāng)洗脫體積達(dá)到5.5 BV 時(shí)，EGT 濃度達(dá)到最高，為16.93 mg/mL，洗脫至流出液中EGT 含量約5 mg/L時(shí)需要10 BV 的洗脫液，計(jì)算得到EGT 洗脫率為95.83%，洗脫情況良好，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾除氨后能順利結(jié)晶，經(jīng)高效液相色譜檢測，結(jié)晶樣品純度達(dá)到99.98%。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，SA-2 陽離子交換樹脂對NRS 中EGT 分離純化性能較好。

3 討論

NRS 中含有各種無機(jī)鹽、氨基酸等成分[15]，這些離子成分能夠被陽離子交換樹脂交換吸附，對樹脂吸附目標(biāo)產(chǎn)物EGT 具有較大影響。試驗(yàn)中，采用完全由NRS 制備的上樣液，9 種離子交換樹脂吸附效果都極差，無法區(qū)分出優(yōu)劣，所以，本實(shí)驗(yàn)將NRS 處理液用5 倍去離子水進(jìn)行稀釋，降低各種干擾成分的濃度，再添加EGT 純品配制所需濃度，在此條件下篩選出吸附效果較好的樹脂，最后用完全由NRS 制備的上樣液進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該方法合理、可行，篩選出的樹脂可以用于NRS 中EGT 的分離純化。

自天然橡膠產(chǎn)業(yè)形成以來，國內(nèi)外學(xué)者對NRS 開展了多種用途的利用研究，但結(jié)果都停留于實(shí)驗(yàn)室階段，目前沒有一個(gè)產(chǎn)業(yè)真正建立起來，NRS 在制膠廠依然是高濃有機(jī)廢水的角色，在實(shí)現(xiàn)NRS 的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用之前還需更廣泛深入的研究并建立應(yīng)用示范[16]，本研究的目的即為NRS的資源化、高值化利用開發(fā)一條可行的技術(shù)途徑。