咖啡炭疽病菌致病性測(cè)定及其拮抗菌篩選1

關(guān)鍵詞：咖啡炭疽??；致病性；生物學(xué)特性；拮抗菌篩選

中圖分類號(hào)：S435.712 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

咖啡是茜草科咖啡屬多年生經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量及消費(fèi)量是世界三大飲料作物（咖啡、茶葉、可可）之首。我國(guó)咖啡種植主要集中于云南和海南，云南作為咖啡的主產(chǎn)區(qū)，種植面積達(dá)11.8 萬(wàn)hm²，98%的咖啡來(lái)自云南[1-2]。炭疽病是咖啡的一種常見(jiàn)病害，對(duì)咖啡果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p失。當(dāng)下咖啡炭疽病的防治一般多以百菌清、波爾多液等化學(xué)農(nóng)藥為主要手段，輔以修枝、清理病葉等手段，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留、水源污染、土壤產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題[3]。而生物防治具有無(wú)污染、無(wú)公害、高效等優(yōu)點(diǎn)，在各種病害的綜合防治中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[4]。因此，明確云南咖啡炭疽病病原菌的生物學(xué)特性以及找到適合的生防菌對(duì)其進(jìn)行生物防治，對(duì)云南咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，卡哈瓦炭疽菌（Colletotrichumkahawae）會(huì)引發(fā)咖啡漿果?。–BD），導(dǎo)致高達(dá)80%的產(chǎn)量損失。膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）也發(fā)生在咖啡上，并導(dǎo)致成熟漿果疾病[5]，而且膠孢炭疽菌還被證實(shí)是引起老撾小粒種咖啡炭疽病的病原[6] 。CRISTóBAL-MARTíNEZ 等[7]在墨西哥咖啡發(fā)病的葉片、枝條和漿果上分離鑒定得到C. gigasporum、C. gloeosporioides 、C. karstii 、C.siamense 和C. theobromicola 等5 種炭疽菌。CAO等[8]報(bào)道了C. endophytica、C. fructicola、C. ledongense、C. siamense、C. tropicale、C. karstii和C. gigasporum 等海南地區(qū)咖啡的8 種炭疽病病菌。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物病害研究室于2018—2019 年，在云南省和海南省9個(gè)咖啡種植基地通過(guò)采集具典型炭疽病病癥的咖啡葉片進(jìn)行病原菌分離，經(jīng)組織分離、純化，共獲得74個(gè)菌株，綜合相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，咖啡炭疽病在我國(guó)的發(fā)生情況比較嚴(yán)重[9]。

目前，咖啡炭疽病拮抗細(xì)菌以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，拮抗真菌以木霉屬（Trichoderma）為主，且多數(shù)拮抗菌來(lái)源于根際土壤或者植物體內(nèi)，少有分離篩選自昆蟲(chóng)的拮抗菌。ADEBANJO等[10]發(fā)現(xiàn)2 株綠色木霉菌（T. viride）對(duì)接種有炭疽病菌的種子具有良好的抗感染保護(hù)作用。汪遠(yuǎn)等[11]從紅樹(shù)植物秋茄植株內(nèi)分離得到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌Kc-38 菌株，開(kāi)展該菌株對(duì)芒果炭疽病的防治研究，其防治效果可達(dá)到65.12%。RODRíGUEZ 等[12]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，孢裂鏈霉菌（Ascochyta phaseoloru）對(duì)咖啡幼苗上的膠孢炭疽菌具有較高的抑制活性，對(duì)咖啡幼苗葉面施用孢裂鏈霉菌7 d 后，在咖啡幼苗葉片接種膠孢炭疽菌，可使咖啡炭疽病發(fā)病率降至32%～41%。陳梅春等[13]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌FJAT-2349 對(duì)枇杷炭疽病菌有抑制作用，其抑制率達(dá)87.8%，且該菌株的脂肽物質(zhì)也可有效抑制枇杷炭疽病菌。張曉勇等[14]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SB023 的發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽病病原菌有較好抑制活性。梁艷瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌JNC2 對(duì)柱花草炭疽病菌的抑制效果較好，其抑菌率可達(dá)66%以上。蔡甜星等[16]利用從土壤中分離得到的放線菌V17對(duì)膠孢炭疽菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株可以通過(guò)抑制菌絲和孢子生長(zhǎng)而抑制病原菌的生長(zhǎng)。任森等[17]從昆蟲(chóng)腸道中獲得10 株木霉菌，平板對(duì)峙顯示加納木霉（T. ghanense）HNDF-T-6 對(duì)芒果炭疽病菌的抑菌率可高達(dá)85.64%。張靜雅等[18]從木薯根際土中分離得到對(duì)木薯炭疽病菌具抑制效果的短密木霉（T. brevicompactum）、棘孢木霉（T. asperellum）和長(zhǎng)枝木霉（T. longibrachiatum），其中長(zhǎng)枝木霉ZJB3-12 對(duì)木薯炭疽病菌的抑制效果最好。炭疽病發(fā)生為害較廣，但對(duì)咖啡炭疽病的相關(guān)研究較少，并且鮮有對(duì)咖啡炭疽病進(jìn)行拮抗菌篩選的相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)室前期從景洪市大窩塘村采集感染炭疽病的新鮮咖啡病葉，并分離鑒定出4 株咖啡炭疽病菌，本研究對(duì)4 株病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，選用實(shí)驗(yàn)室已有不同來(lái)源的拮抗菌，采用平板對(duì)峙法篩選出對(duì)病原菌具有較好抑制作用的生防菌株，為咖啡炭疽病生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株病原菌：供試病原菌共4 株，暹羅炭疽菌（C. siamense）、果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、草莓炭疽病菌（C. theobromicola）各1 株。

拮抗菌：供試拮抗菌共26 株，包括10 株芽孢桿菌（Bacillus sp.）、1 株迪茨氏菌（Dietzia sp.）、6 株泛菌（ Pantoea sp. ） 、3 株類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）、1 株微桿菌（Microbacteriumsp.）、1 株腸桿菌（Enterobacter sp.）、1 株莫拉菌（Moraxella sp.）、1 株紅球菌（Rhodococcus sp.）、1 株不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）、1 株克呂沃爾氏菌（Kluyvera sp.）。其中，21 株分離自澤蘭實(shí)蠅（Procecidochares utilis）幼蟲(chóng)、3 株分離自美洲大蠊（Periplaneta americana）、2 株分離自土壤。均保存于本實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬 鈴 薯 蔗 糖 瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：馬鈴薯20 g/L，蔗糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）：燕麥3 g/L，瓊脂1.8 g/L，121 ℃滅菌30 min。

察氏培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.1 g/L，氯化鉀0.05 g/L，硫酸鎂0.05 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，蔗糖3 g/L，瓊脂2 g/L，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖CAM 培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，酵母提取物0.5 g/L，氯化鈉1 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑和儀器蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉和氯化鈉等分析純?cè)噭┚?gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司，冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司，高壓滅菌鍋購(gòu)自ZEALWAY GR85DA，–80 ℃超低溫冰箱購(gòu)自THErmo 906，SPX-300B-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，普通天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，人工氣候箱購(gòu)自寧波東南儀器有限公司，電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱購(gòu)自上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 致病性測(cè)定參考徐丹丹等[19]的方法，略有改動(dòng)。將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，在28 ℃的條件下培養(yǎng)7 d，備用。選擇新鮮、健康、大小均一的咖啡嫩葉作為接種材料，在接種前，先用3%～5%的次氯酸鈉水溶液浸泡10 min，然后于70%酒精浸泡30 s，再用滅菌水沖洗3 次，用無(wú)菌濾紙吸干組織表面殘留的水分，置于接種盤(pán)中。取菌株生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的橘紅色分生孢子團(tuán)于無(wú)菌水中，將其配成濃度為105 個(gè)/mL 的孢子懸浮液。各取50 μL 孢子懸浮液于葉片穿刺部位進(jìn)行涂抹接種，每個(gè)處理重復(fù)3 次，并以穿刺不接種的咖啡葉片作為對(duì)照（CK）。處理后的咖啡葉片置于培養(yǎng)皿中保持濕潤(rùn)處理，于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察葉片產(chǎn)生的病斑情況，選擇病斑最大即致病性最強(qiáng)的病原菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 病原菌株生物學(xué)特性研究（1）不同培養(yǎng)基對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 的病原菌在無(wú)菌環(huán)境下打成直徑為6 mm的菌餅，分別接種到PDA、PSA、OA、Czapek、葡萄糖CAM 培養(yǎng)基上。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h 通過(guò)十字交叉法測(cè)定并記錄菌絲直徑。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。比較不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲體生長(zhǎng)速率的影響。

（2）不同碳源對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。參考王漢榮等[20]和張春霞等[21]的方法，并略作修改。以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入等量的葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、淀粉、乳糖替換Czapek 培養(yǎng)基中的蔗糖，配置對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，以蔗糖為碳源作對(duì)照。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，比較不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)速率的影響。

（3）不同氮源對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。與1.2.2-（1）相同，以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入等量的賴氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、胰蛋白胨、氯化銨替換Czapek 培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配置對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，以硝酸鈉為氮源作對(duì)照。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，比較不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)速率的影響。

（4）不同溫度對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。以上述試驗(yàn)獲得的最適培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置15、20、25、28、30、37 ℃ 6 個(gè)不同的溫度梯度。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，測(cè)定不同溫度條件下菌絲體的生長(zhǎng)速率。

（5）不同pH 對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。以最適PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1%鹽酸或0.1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，設(shè)置5、6、7、8、9、10 等6 個(gè)pH 梯度。根據(jù)1.2.2-（1）的方法，測(cè)定不同pH 條件下菌絲體的生長(zhǎng)速率。

（6）光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響。以最適PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置3 個(gè)不同光照條件，L∶D 分別為24∶0、12∶12、0∶24。根據(jù) 1.2.2-（1）的方法，測(cè)定不同光照條件下菌絲體的生長(zhǎng)速率。

1.2.3 室內(nèi)拮抗菌的篩選參照何明川等[22]的方法。供試拮抗菌提前在LB 液體培養(yǎng)基中活化，然后將發(fā)酵液稀釋涂布，得到相應(yīng)的菌株，再接種至LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用無(wú)菌牙簽在距菌餅約2 cm 處以“十”字線對(duì)稱接種拮抗菌，開(kāi)展平板對(duì)峙試驗(yàn)，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 20.0 、GraphPad Prism 8.0 和Microsoft Excel 2010 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和制作圖表[23]；采用Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

相關(guān)計(jì)算公式：菌落直徑（cm）=（橫徑+縱徑）/2；抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%，其中處理菌落直徑為對(duì)稱拮抗菌兩點(diǎn)間的距離減去拮抗菌的抑菌圈半徑[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性測(cè)定

致病性結(jié)果如圖1 所示，Wyq1、Yyq1、Xbd1、Hb1 菌株均能侵染新鮮健康的咖啡葉片并引發(fā)癥狀。用橘色粘團(tuán)配置的孢子液侵染4 d 后，葉片發(fā)病癥狀為：Wyq1 菌株侵染后的病斑直徑為6.8～9.2 mm；Yyq1 菌株侵染后的病斑直徑為4.5～6.4 mm；Hb1 菌株侵染后的病斑直徑為7.2～10.1 mm ； Xbd1 菌株侵染后的病斑直徑為19.0～23.0 mm；而CK 葉片僅有穿刺后氧化留下的孔洞。結(jié)果表明Xbd1 菌株的致病性最強(qiáng)。

2.2 咖啡炭疽病病原真菌生物學(xué)特性

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖2 所示，在不同培養(yǎng)基上，Xbd1 菌株的菌絲生長(zhǎng)有差異?？梢钥闯雠囵B(yǎng)132 h 后適合Xbd1 菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基有PDA、PSA、Czapek 培養(yǎng)基，菌落直徑分別達(dá)53.1、52.8、52.4 mm，但在葡萄糖CAM 培養(yǎng)基（CPA）上，其菌落直徑僅42.4 mm，表明葡萄糖CAM 培養(yǎng)基不適宜菌株Xbd1 生長(zhǎng)，PDA 培養(yǎng)基是其最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

2.2.2 不同碳源對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖3 所示，培養(yǎng)132 h 后，Xbd1 菌株菌絲體在葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑無(wú)顯著差異，菌落直徑分別為53.4、53.2、52.7、52.4 mm，而以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中其菌落直徑最小，僅為39.1 mm，生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢。因此，Xbd1 菌株生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖。

2.2.3 不同氮源對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖4 所示，培養(yǎng)132 h 后，Xbd1 菌株在不同氮源中對(duì)有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源的利用差異顯著。以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中，其菌落直徑最大為52.6 mm，其次是硝酸鈉和酵母浸膏，菌落直徑分別為52.4、46.0 mm，牛肉浸膏和賴氨酸培養(yǎng)基中的菌落直徑較小，分別為41.3、37.2 mm，以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基中其菌落直徑最小，僅21.0 mm，氯化銨是最不適合該菌株生長(zhǎng)的氮源。因此，Xbd1 菌株的最適氮源為胰蛋白胨。

2.2.4 溫度對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖 5 所示，在15～28 ℃時(shí)，隨溫度的升高，Xbd1 菌株的菌落直徑逐漸增大，30 ℃時(shí)菌落直徑逐漸減小，37 ℃時(shí)菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，菌絲無(wú)法在PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)展。從菌落直徑來(lái)看，Xbd1 菌株生長(zhǎng)的最適溫度為28 ℃，其菌落直徑為53.9 mm。

2.2.5 pH 對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖 6 所示，在不同pH 條件下，Xbd1 菌株菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)差異不顯著，在pH 為5～10范圍內(nèi)該菌株均可以較好生長(zhǎng)，pH 為7時(shí)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最快，其菌落直徑為52.1 mm。

2.2.6 光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)的影響如圖7 所示，Xbd1 菌株在不同光照時(shí)長(zhǎng)下的生長(zhǎng)存在顯著差異。該菌株在24 h 光照條件下生長(zhǎng)最好，其菌落直徑為54.0 mm；其次是12 h 光照；0 h 光照條件下菌株生長(zhǎng)情況最差，其菌落直徑僅36.4 mm。

2.3 拮抗菌的篩選

通過(guò)拮抗菌的室內(nèi)平板對(duì)峙試驗(yàn)，由表1可知，26株供試拮抗菌中（表中未體現(xiàn)抑制率為0的菌株），僅有5 株芽孢桿菌具有拮抗效果，其抑菌活性均較好，分別為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）MC4-2、特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）D5-8、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）MC2-1、彎曲芽孢桿菌（B. flexus）ZLSY3 和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliticus）GJ7，其中枯草芽孢桿菌MC4-2 的抑菌效果最好，抑菌率為57.8%；其次是貝萊斯芽孢桿菌MC2-1，抑菌率為55.8%；特基拉芽孢桿菌D5-8 抑制率較低，僅為47.0%。

3 討論

膠孢炭疽菌屬子囊菌亞門腔孢綱黑盤(pán)孢目黑盤(pán)孢科炭疽菌屬真菌，病原菌分生孢子長(zhǎng)圓形、圓柱形或橢圓形，單細(xì)胞，無(wú)色[24]，是一種咖啡的弱病原體，感染成熟漿果，導(dǎo)致壞死病變。該病原菌也可以引起辣椒、芒果、檸檬、橡膠[25]、大豆等其他作物的炭疽病。徐丹丹等[19]采用孢子懸浮液對(duì)咖啡葉片進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離到的咖啡炭疽菌中，與膠孢炭疽菌復(fù)合種相似的CA-16、CA-6 兩株病原菌的致病性較強(qiáng)，其病斑直徑可以達(dá)到19.2～25.5 mm。陸英等[26]通過(guò)菌餅接種法接種咖啡葉片，并以病斑占葉片的面積來(lái)判斷其致病力強(qiáng)弱，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鑒定的3種炭疽菌中，草莓炭疽菌（C. theobromicola）的致病力最強(qiáng)。本研究在進(jìn)行致病性探究時(shí)采用孢子懸浮液涂抹接種咖啡葉片，發(fā)現(xiàn)菌株Xbd1 的病斑直徑可達(dá)19.0～23.0 mm，與菌株Yyq1、Wyq1、Hb1 相比，菌株Xbd1 的致病性最強(qiáng)。

光照、pH、溫度、培養(yǎng)基類型、氮源、碳源等因素對(duì)炭疽病病原菌的生長(zhǎng)有較大影響[27]。本研究結(jié)果表明：適合菌株Xbd1 生長(zhǎng)的培養(yǎng)基有PDA、Czapek、PSA 培養(yǎng)基，而PDA 培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)基。肖文斐等[28]在研究膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性時(shí)也發(fā)現(xiàn)PDA 培養(yǎng)基是最適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，其次是PSA 培養(yǎng)基。適合Xbd1 菌株生長(zhǎng)的最佳氮源是胰蛋白胨，最佳碳源為葡萄糖。Xbd1 菌株在15～30 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，30 ℃以上生長(zhǎng)減緩，37 ℃時(shí)嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)，Xbd1 菌株適宜生長(zhǎng)的溫度范圍與黃思良等[27]的研究結(jié)果相比，Xbd1 菌株的溫度范圍稍窄。與姚錦愛(ài)等[29]研究的適宜溫度范圍一致。最適生長(zhǎng)溫度與李菲菲[30]的研究結(jié)果一致，均為28 ℃。Xbd1 菌株對(duì)酸堿的耐受性很強(qiáng)，生長(zhǎng)范圍較廣，pH 在5～11之間均可生長(zhǎng)。Xbd1 菌株在不同的酸堿和溫度條件下均可較好生長(zhǎng)，說(shuō)明其適應(yīng)性很強(qiáng)。李延浩[31]研究發(fā)現(xiàn)不同光照條件對(duì)菌株生長(zhǎng)并無(wú)影響，而本研究中全光照和全黑暗條件下Xbd1 菌株長(zhǎng)勢(shì)較好，而12 h 光照條件下菌株長(zhǎng)勢(shì)較差，其可能與光照交替有關(guān)，說(shuō)明同一病原菌在不同寄主植物上的發(fā)病情況以及生物學(xué)特性均存在一定差異。

目前炭疽菌的拮抗菌多以芽孢桿菌屬為主，芽孢桿菌具有特殊的性質(zhì)，可以產(chǎn)生抗生素，對(duì)真菌和一些細(xì)菌病原體具有拮抗活性，其代謝物可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并且通過(guò)影響根際微生物，觸發(fā)宿主的防御反應(yīng)提高植物的抗逆性，使芽孢桿菌成為很好的生物防治劑[32]。本研究開(kāi)展炭疽病拮抗菌的篩選，拮抗細(xì)菌來(lái)源于土壤、美洲大蠊腸道以及澤蘭實(shí)蠅幼蟲(chóng)。本研究篩選到5 株抑制效果較好的拮抗菌，分別是枯草芽孢桿菌（B.subtilis）MC4-2、特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）D5-8、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）MC2-1、彎曲芽孢桿菌（B. flexus）ZLSY3、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）GJ7，其中拮抗效果最好的是來(lái)自美洲大蠊腸道的枯草芽孢桿菌MC4-2，但楊苑等[33]的研究結(jié)果表明，分離自土壤的枯草芽孢桿菌對(duì)炭疽菌的抑制率最弱，僅為34%，抑菌效果的差異可能是拮抗菌不同來(lái)源導(dǎo)致。徐睿等[34]利用油茶內(nèi)生菌誘變獲得枯草芽孢桿菌YL13，研究表明，該菌株對(duì)5 種油茶炭疽菌[膠孢炭疽菌、暹羅炭疽菌（C. siamense）、果生炭疽菌（C. fructicola）、哈銳炭疽菌（C. horii）、山茶炭疽菌（C. camelliae）]均有拮抗效果，該菌株的發(fā)酵濾液對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率高達(dá)83.46%。呂倩等[35]從南海深海沉積樣品中分離篩選得到一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（ B. methy lotrophicus），該芽孢桿菌產(chǎn)生的抗真菌脂肽對(duì)黃瓜炭疽病有一定的抑制作用。韓長(zhǎng)志等[36]在核桃根際土壤中分離出芽孢桿菌，并通過(guò)平板對(duì)峙獲得其對(duì)核桃炭疽病的抑制率可達(dá)到80%以上。真菌對(duì)膠孢炭疽菌也有較好的抑制作用，胡麗杰等[37]在枸杞中分離得到4 株內(nèi)生真菌，其中鐮刀屬菌株NQ8GII4 對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率高達(dá)93.43%。

高云慨[38]從海南芒果表面和傷口處篩選得到4 株有較好生防活性的酵母菌，其中一株蒙畢赤氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）LZ5 對(duì)芒果炭疽病菌有明顯的抑制作用。本研究?jī)H探究拮抗菌對(duì)膠孢炭疽菌的室內(nèi)抑制作用，還應(yīng)展開(kāi)拮抗機(jī)制和田間防治效果方面的研究。

4 結(jié)論

通過(guò)咖啡炭疽病病原菌致病性測(cè)定及其拮抗菌篩選，明確4 株病原真菌Wyq1（C. siamense）、Yyq1（C. fructicola）、Xbd1（C. gloeosporioides）、Hb1（C. theobromicola）中Xbd1 菌株的致病性最強(qiáng)，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并通過(guò)平板對(duì)峙篩選到對(duì)Xbd1 菌株具有抑菌效果較好的5 株拮抗菌，為咖啡炭疽病的防治及其生防菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。