摘要:開發(fā)基于納米酶的重金屬離子比色傳感分析方法,進而克服納米酶在近中性pH環(huán)境催化活性較低的不足,仍然是當(dāng)前面臨的一項重要挑戰(zhàn).文中通過一步法制備了空心多孔金納米酶(HP Au NSs),采用TEM,XRD,EDS,XPS等對納米酶進行了表征,并將HP Au NSs用于Hg2+和Ag+的比色分析檢測.結(jié)果表明,Hg2+和Ag+的加入均顯著增強HP Au NSs在近中性條件下的類過氧化物酶(POX)活性,提高了H2O2的分解速率并加速底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的氧化反應(yīng).利用顯色底物TMB氧化后藍色溶液的顏色變化,成功實現(xiàn)了Hg2+和Ag+的特異性分析檢測,檢測限分別為7.43 nmol·L-1和0.89 μmol·L-1.構(gòu)建的納米酶傳感體系打破了納米酶活性的pH限制,以裸眼可見的溶液體系顏色變化為讀出信號,實現(xiàn)了兩種重金屬離子的檢測,為拓寬納米酶在分析傳感領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考.
關(guān)鍵詞:比色傳感;納米酶;汞離子;銀離子
中圖分類號:O 657.32"" "文獻標志碼:A"" "文章編號:1001-988Ⅹ(2024)06-0069-09
Preparation of hollow porous gold nanozymes and
its colorimetric detection for Hg2+ and Ag+
CHANG Wen-zhuo,SONG Li-jun,LUO Ming-yue,SUN Pan-pan,
LI Jian-ying,ZHANG Ke-xin,XUE Zhong-hua
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China)
Abstract:The development of nanozyme-based colorimetric sensing methods for heavy metal ions,especially to overcome the limitation of the low catalytic activity of nanozymes in near-neutral pH environments,is still an important challenge.In this study,hollow porous gold nanozymes(HP Au
NSs) were prepared by a one-step method,and successfully characterized by TEM,XRD,EDS and XPS.The HP Au NSs were used for colorimetric detection of Hg2+ and Ag+ ions.The results showed that the addition of Hg2+ and Ag+ significantly can enhances the peroxidase-like(POX) activity of the HP Au NSs under near-neutral conditions,increase the decomposition rate of H2O2,and accelerate the oxidation reaction of the substrate 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB).The specific analysis and detection of Hg2+ and Ag+ are successfully achieved by using the colour change of the blue solution after oxidation of the chromogenic substrate TMB,and the detection limits are 7.43 nmol·L-1 and 0.89 μmol·L-1,respectively.The constructed nanozyme sensing system breaks the pH limitation of nanozyme activity,and uses the colour change of the solution system visible to the naked eye as the readout signal to realize the detection of two heavy metal ion pollutants,which provides a reference for broadening the application of nanozyme in the field of analytical sensing.
Key words:colorimetric sensing;nanozymes;Hg2+;Ag+
重金屬污染近年來已成為一個備受關(guān)注的環(huán)境問題[1,2],汞離子(Hg2+)和銀離子(Ag+)作為普遍存在的重金屬離子污染物,易于通過食物鏈在人體內(nèi)富集,繼而對腎臟、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[3,4].因此,建立快速、準確的Hg2+和Ag+檢測方法至關(guān)重要.常見的重金屬離子分析檢測方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[5]、原子吸收光譜法(AAS)[6]、火焰原子吸收法(FAA)[7]以及溶出伏安法(ASV)[8]等,但這些方法操作相對復(fù)雜,不利于現(xiàn)場快速監(jiān)測.相比之下,比色可視化分析方法具有信號簡單、易于操作、適于現(xiàn)場實時檢測等諸多優(yōu)勢,目前已成為較為普遍的重金屬離子分析工具[9].
在重金屬離子的比色可視化分析檢測中,各種各樣的納米酶被廣泛使用[10-13].納米酶作為一種人工酶,具有成本低廉、穩(wěn)定性高、易于改性以及催化活性可控等獨特優(yōu)勢,在生物傳感和環(huán)境污染檢測領(lǐng)域顯示出替代天然酶的發(fā)展趨勢,許多基于納米酶的重金屬離子比色傳感分析方法已相繼被報道.例如,Dai等[14]制備了鉑(Pt)摻雜碳化泥炭苔蘚葉(CPM-Pt)納米酶,成功實現(xiàn)了Ag+的超靈敏比色可視化檢測,檢測限(LOD)低至1.1 pmol·L-1,并且在100 pmol·L-1時可用肉眼觀察到明顯的顏色變化.Feng等[15]合成了具有中空納米管結(jié)構(gòu)的C@MoS2納米酶,成功實現(xiàn)了Hg2+離子靈敏分析檢測.Gao等[16]使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)封端的Pt納米立方體酶,實現(xiàn)了室溫下水溶液中Ag+的比色可視化檢測(LOD為80 pmol·L-1),檢測全程僅需6 min.但是,已報道的絕大多數(shù)納米酶在生理pH環(huán)境下其類酶活性均相對較弱,通常只能在酸性條件下顯示出較高的催化活性,這在很大程度上限制了它們的實際分析應(yīng)用[17-20].因此,開發(fā)近中性pH條件下具有高催化活性的納米酶,以滿足生理條件下目標物快速靈敏檢測仍是一個值得研究的課題.
基于此,文中通過研究發(fā)現(xiàn)空心多孔金納米酶(HP Au NSs)具有較大的比表面積、豐富的催化位點和高效的原子利用率[21],但在近中性條件下其類過氧化物酶(POX)活性并不理想[22].而Hg2+和Ag+可在帶負電荷的HP Au NSs表面被還原形成一層很薄的Au-Hg和Ag-Hg合金層,進而通過改變HP Au NSs的表面結(jié)構(gòu)而顯著增強其類POX活性,在H2O2參與下加速HP Au NSs對3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的氧化,并生成藍色氧化產(chǎn)物oxTMB.根據(jù)這一原理,文中成功構(gòu)建了一種Hg2+和Ag+的快速、靈敏比色可視化檢測方法(圖1),拓展了納米酶在環(huán)境分析領(lǐng)域的實際應(yīng)用.
1 實驗部分
1.1 化學(xué)試劑
3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、硝酸汞
(Hg(NO3)2)、四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)購
于阿拉丁試劑有限公司;過氧化氫(H2O2)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、氫氧化鈉(NaOH)、氨水(NH4OH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)購于國藥控股化學(xué)試劑有限公司;對苯二酚購于天津市大茂化學(xué)試劑廠;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)購于生工生物工程(上海)股份有限公司;疊氮化鈉(NaN3)購于上海中秦化學(xué)試劑有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)購于Sigma-Aldrich 公司.
1.2 實驗儀器
TECNAI G2 TF20型透射電子顯微鏡(TEM),美國 FEI 公司;JSM-5600LV型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM),日本電子光學(xué)公司;ESCALAB 250Xi 型X射線光電子能譜儀(XPS),美國Thero Fisher Scientific公司;Nano ZS ZEN 3600型Zeta電位和動態(tài)光散射儀,英國馬爾文儀器;Agilent-8453型紫外-可見分光光度計(UV-Vis),日本Agilent公司;UPT-II型超純水制備儀,西安優(yōu)譜儀器設(shè)備有限公司;PHS-3C型pH酸度計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;KQ-250DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;TGL-16C型高速臺式離心機,上海安亭儀器廠;電子天平,上海奧豪斯儀器有限公司.
1.3 實驗過程
1.3.1 HP Au NSs的制備 采用一步法制備HP Au NSs[23],具體步驟為:將0.18 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP,Mw=40000)溶解在18 mL超純水中,在室溫條件下溫和攪拌,隨后加入640 μL對苯二酚(28 mmol·L-1),40 μL硝酸銀(60 mmol·L-1)和640 μL HAuCl4·4H2O(25 mmol·L-1).持續(xù)攪拌5 min,混合物由深藍色變?yōu)榧t棕色,繼續(xù)攪拌1 h;接著加入200 μL NH4OH(10 mol·L-1)并攪拌2 h.將得到的HP Au NSs 以10 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)洗滌3次.最后,將合成的HP Au NSs儲存在4 ℃冰箱內(nèi)備用.
1.3.2 Hg2+和Ag+比色可視化檢測 在1770 μL Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=6.5)中依次加入30 μL HP Au NSs,50 μL不同濃度的Hg2+和Ag+溶液,50 μL 8 mmol·L-1的H2O2和100 μL 10 mmol·L-1的TMB,隨后將上述混合液在室溫下反應(yīng)25 min.隨著Hg2+和Ag+加入濃度的不同,藍色oxTMB的產(chǎn)量會隨之發(fā)生改變,反應(yīng)體系顏色變化可通過裸眼直接觀察到,提高了檢測的便捷性.為了精確測量目標物濃度,在實驗過程中,同時利用紫外-可見分光光度計(UV-Vis)測量反應(yīng)混合液的吸光度值,即可定量檢測Hg2+和Ag+的濃度.
2 結(jié)果與討論
2.1 材料表征
采用多種手段對制備的HP Au NSs進行表征.如圖2(a)所示, SEM顯示HP Au NSs整體呈球形,表面粗糙且有多處凸起,這與之前的文獻報道一致[24].TEM(圖2(b))分析發(fā)現(xiàn),合成的HP Au NSs邊緣呈波浪狀,且材料去除AgCl模板后有亮點出現(xiàn),表明材料以空心多空結(jié)構(gòu)存在.從EDS元素線掃描剖面圖(圖2(c))可以看出,Au元素集中分布在納米球的邊緣,進一步證明制備的材料具有一定的空心結(jié)構(gòu).此外,從XRD(圖2(d))可以看出,得到的HP Au NSs在38.2°,44.3°,64.7°,77.6°和81.8°顯示5個主要的衍射峰,分別對應(yīng)于Au的(111),(200),(220),(311)和(222)晶面(JCPDS編號04-0784)[25].其中(111)平面對應(yīng)的峰最強,(200)和(111)峰的強度之比(0.31)遠低于常規(guī)值0.52[26],表明(111)晶格平面是HP Au NSs的主要方向.這與(111)面和(200)面之間的競爭生長有關(guān)[27],說明所制備的HP Au NSs是Au0面心立方體晶格面[28].HP Au NSs的XPS光譜分析表明(圖2(e)),材料在83.6和87.3 eV處出現(xiàn)典型Au 4f雙峰,進一步證明HP Au NSs中Au0的存在.此外,UV-Vis(圖2(f))顯示HP Au NSs在550 nm處有明顯的吸收峰,表明其具有顯著的表面等離子共振特性.得到的HP Au NSs表現(xiàn)出良好的水溶性,進一步表明其在液相傳感體系中具有優(yōu)異的應(yīng)用前景.
2.2 Hg2+和Ag+比色檢測可行性
以TMB為顯色底物考察了HP Au NSs的類過氧化物酶活性.研究發(fā)現(xiàn),在近生理pH值下,不同類型的緩沖體系對HP Au NSs過氧化物酶類酶活性有較大影響.在H2O2存在下,隨著Hg2+
的引入,HP Au NSs納米酶可不同程度的催化氧化無色底物TMB生成藍色氧化產(chǎn)物,并在652 nm處產(chǎn)生最大吸收.其中,Hepes緩沖溶液中測得吸光度值最大且保持穩(wěn)定,而Tris-HCl緩沖溶液最小(圖3(a)).因此,選擇Hepes緩沖溶液作為Hg2+檢測的最佳溶液.類似地,研究也發(fā)現(xiàn),隨著Ag+的引入,HP Au NSs納米酶也可不同程度的催化氧化無色底物TMB生成藍色的氧化產(chǎn)物,同樣在652 nm處產(chǎn)生最大吸收.其中,PBS緩沖溶液中測得吸光度值最大且保持穩(wěn)定,BR緩沖溶液次之,而Tris-HCl緩沖溶液最小(圖3(b)).因此,后續(xù)研究中選擇PBS作為Ag+檢測的最佳緩沖溶液.
眾所周知,絕大多數(shù)納米酶活性與所在溶液體系的pH密切關(guān)系[29].一般而言,在酸性條件下納米酶的類酶活性較強,而在近中性pH環(huán)境中其類酶活性普遍較弱.為此,探討了緩沖溶液pH值對HP Au NSs類酶活性的影響.對于HP Au NSs~Hg2+體系而言,當(dāng)Hepes緩沖溶液pH從5.5~8.0變化時,體系在652 nm處的吸光度呈先增大后減小的趨勢,在pH 6.5時達到最大值(圖3(c)).說明HP Au NSs在pH 6.5的Hepes緩沖溶液中類酶活性最高.因此,后續(xù)研究選擇pH 6.5的Hepes緩沖溶液進行Hg2+比色可視化分析檢測.研究發(fā)現(xiàn),對于HP Au NSs~Ag+體系,在652 nm處的吸光度也隨著PBS緩沖溶液pH的增加而不斷改變,在pH 5.5~8.2的范圍內(nèi)先增大后減小,當(dāng)pH為7.4時達到最大值(圖3(d)),證明HP Au NSs~Ag+在pH 7.4的PBS緩沖溶液體系中類酶活性最高.因此,后續(xù)研究選擇pH 7.4的PBS緩沖溶液對Ag+進行比色可視化分析檢測.上述結(jié)果表明,Hg2+和Ag+在近中性條件下能有效激活HP Au NSs的類POX活性,說明HP Au NSs在近中性條件下可對Hg2+和Ag+進行比色可視化分析檢測.
選擇性是評估分析檢測方法的一個重要參數(shù).為了評價HP Au NSs納米酶對Hg2+和Ag+分析檢測的選擇性,考察了幾種常見的金屬陽離子(Cu2+,Mn2+,Cd2+,Co2+,F(xiàn)e3+,Ni+,Zn2+,Ce3+,Mg2+,Ca2+,K+,Al3+,Cr3+和Pb2+等)對目標離子分析檢測的影響.如圖3(e)所示,在pH 6.5的Hepes緩沖溶液中,Hg2+可使體系在652 nm處的吸光度顯著升高,除Ag+之外濃度20倍于Hg2+的其他干擾陽離子未有明顯變化.為了消除Ag+對Hg2+分析檢測所帶來的干擾,可在檢測體系中加入適量KCl掩蔽劑以消除干擾.實驗表明,通過掩蔽劑的加入,構(gòu)建的比色傳感平臺在近中性條件下能夠?qū)崿F(xiàn)Hg2+的特異性檢測.同樣地,如圖3(f)所示,在pH 7.4的PBS緩沖體系中加入Ag+和上述干擾離子后,Ag+可使體系吸光度值最高,除Hg2+之外濃度20倍于Ag+的其他干擾陽離子未有明顯變化.而Hg2+對Ag+分析檢測的干擾可通過加入6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶掩蔽劑,借助形成的T-Hg2+-T復(fù)合物成功屏蔽,最終使得信號干擾明顯降低.上述實驗結(jié)果表明,構(gòu)建的比色傳感平臺在近中性條件下可成功用于Hg2+和Ag+的特異性檢測.
2.3 HP Au NSs 類酶催化活性機理
研究表明,一定條件下Hg2+可在金納米顆粒(Au NPs)表面發(fā)生還原并形成Au-Hg合金,進而改變Au NPs的表面性質(zhì),從而增強Au NPs納米酶類POX活性[30].基于此,推測Hg0的沉積是HP Au NSs在近中性條件下類POX活性提高的主要原因.為了證實這一猜想,借助XPS進一步研究了HP Au NSs在加入Hg2+后的表面性質(zhì)和化學(xué)價態(tài).如圖4(a)所示,Au的4f結(jié)合能在加入Hg2+后保持不變,證明HP Au NSs未發(fā)生價態(tài)變化.同時,Hg 4f譜圖顯示兩個明顯的特征峰,分別對應(yīng)于Hg 4f7/2和Hg 4f5/2(圖4(b)),將其分峰后可知,104.6和100.6 eV的峰歸屬于Hg04f,說明反應(yīng)體系中有Hg0生成,且Hg0和Hg2+共存于HP Au NSs表面.由此推斷,Hg2+開啟HP Au NSs催化活性可能歸因于Hg2+吸附到HP Au NSs表面并被還原為Hg0,形成Au-Hg合金后改變了HP Au NSs的表面性質(zhì),從而增強了HP Au NSs在近中性條件下的類POX活性.
同理,為探究Ag+誘導(dǎo)的HP Au NSs類酶活性的增強機理,利用XPS光譜分析了HP Au NSs加入Ag+后的元素價態(tài)變化.如圖4(c)所示,Au的4f結(jié)合能在Ag+
加入后保持不變,證明HP Au NSs未發(fā)生價態(tài)變化.Ag的XPS光譜分峰后(圖4(d)),結(jié)合能位于374.2和368.2 eV的峰歸屬于Ag03d,說明有Ag0生成.基于此,推斷Ag+增強 HP Au NSs 催化活性原因與Hg2+非常相似,可歸結(jié)為Ag+吸附到 HP Au NSs被還原為Ag0,通過形成Au-Ag合金沉積在Au表面,進而改變了HP Au NSs的表面性質(zhì),最終增強HP Au NSs在中性條件下的類酶活性.
2.4 自由基驗證
大多數(shù)報道的納米酶可視化傳感分析體系,其主要原理是納米酶催化溶解氧產(chǎn)生活性氧(ROS)自由基,進而氧化TMB發(fā)生顯著的顯色反應(yīng)[31].為了進一步探究HP Au NSs的催化機理,通過選擇不同類型的自由基清除劑,驗證了催化過程中可能產(chǎn)生的ROS自由基.其中,疊氮化鈉(NaN3)是
單線態(tài)氧(1O2)的清除劑,超氧化物歧化酶(SOD)是超氧陰離子(O2·-)的清除劑,碳酸氫鈉(NaHCO3)可作為羥基自由基(·OH)的清除劑.如圖5(a)和5(b)所示,在最佳反應(yīng)條件下,Hg2+和Ag+存在的反應(yīng)體系中,加入SOD和NaN3并在室溫下孵育25 min后,體系的特征吸光度均未發(fā)生明顯變化,說明反應(yīng)體系催化過程中無O2·-和1O2自由基的產(chǎn)生.而當(dāng)加入NaHCO3時,體系
的特征吸光度尤其是652 nm處吸光度值大幅下降,說明反應(yīng)體系催化過程中產(chǎn)生了·OH并被
NaHCO3清除,進而影響了HP Au NSs的類酶催化活性.如圖5(c)和5(d)所示,隨著加入的NaHCO3濃度不斷升高,兩個體系的吸光度隨之下降,這是因為NaHCO3濃度越大,對·OH的抑
制效果越明顯,因此進一步證明了HP Au NSs~Hg2+/Ag+產(chǎn)生的絕大多數(shù)ROS自由基為·OH.綜上所述,HP Au NSs檢測體系在催化氧化TMB的過程中,產(chǎn)生的ROS自由基主要是·OH,其利用·OH的強氧化性,加速了酶底物TMB的氧化反應(yīng).
2.5 HP Au NSs比色可視化檢測Hg2+和Ag+
借助Hg2+和Ag+在近中性條件下對HP Au NSs類POX活性的增強作用,構(gòu)建了一種HP Au NSs比色可視化檢測Hg2+和Ag+的新方法.該方法以TMB為顯色底物,在最佳反應(yīng)條件下,通過整個體系的顏色變化與652 nm處的吸光度值,實現(xiàn)Hg2+和Ag+濃度的半定量與定量分析檢測.如圖6(a)所示,隨著Hg2+濃度的增大,反應(yīng)體系的顏色由淡藍色逐漸變?yōu)樯钏{色,并呈現(xiàn)明顯的梯度變化趨勢,通過裸眼可觀測的顏色變化可以對Hg2+含量進行半定量分析.結(jié)合UV-Vis的測量,可進一步對Hg2+進行定量分析檢測,圖6(b)為檢測Hg2+的UV-Vis吸收光譜,其中位于652和894 nm處的特征吸收峰強度隨著Hg2+濃度的增加逐漸增強,其吸光度值A(chǔ)與Hg2+濃度呈現(xiàn)良好的響應(yīng)關(guān)系.如圖6(c)所示,隨著Hg2+濃度在50~1000 nmol·L-1范圍內(nèi)逐漸增加,A隨之呈梯度變化;在50~550 nmol·L-1之間,Hg2+濃度與A線性關(guān)系良好,線性回歸方程為A=0.0028CHg2++0.0339,R2=0.9969,其檢測限LOD為7.43 nmol·L-1(3δ/k).
類似地,隨著Ag+濃度的不斷增加,反應(yīng)體系的顏色也由淡藍色逐漸變?yōu)樯钏{色(圖6(d)),通過裸眼可觀測的顏色變化可以對Ag+含量進行半定量分析.如圖6(e)所示,位于652和894 nm處的特征吸收峰強度隨著Ag+濃度的增加逐漸增強,反應(yīng)體系吸光度值A(chǔ)與Ag+濃度具有良好的響應(yīng)關(guān)系.在1~40 μmol·L-1范圍內(nèi),隨著Ag+濃度增大,A逐漸增強;當(dāng)Ag+在1~30 μmol·L-1之間時,A與Ag+濃度的對數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=0.7434logCHg2++0.1711,R2=0.9989,LOD為0.89 μmol·L-1(3δ/k)(圖6(f)).上述實驗結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的傳傳感平臺可成功實現(xiàn)Hg2+和Ag+的可視化半定量和高靈敏定量比色檢測.
3 結(jié)論
成功制備了具有形貌均一且能良好分散于水中的空心多孔金(HP Au NSs)納米酶,探討了影響納米酶催化活性的各種因素,發(fā)現(xiàn)Hg2+和Ag+在近中性條件下可顯著提升HP Au NSs納米酶的類過氧化物酶(POX)活性,并通過提升H2O2的分解速率而加速底物TMB的氧化反應(yīng).這種增強的類過氧化物酶活性可引起溶液體系產(chǎn)生一種顯著的顏色變化,從而實現(xiàn)對Hg2+和Ag+的快速、靈敏地比色可視化檢測,檢測限分別為7.43 nmol·L-1和0.89 μmol·L-1.此外,構(gòu)建的納米酶傳感體系打破了納米酶活性的pH限制,以裸眼可見的溶液體系顏色變化為讀出信號,實現(xiàn)了兩種重金屬離子的快速檢測,且操作簡便,成本低廉,無需復(fù)雜的儀器設(shè)備,非常適合現(xiàn)場快速檢測和即時監(jiān)測.未來有望進一步拓展其在試劑盒和試紙條等快速檢測產(chǎn)品中的實際應(yīng)用,以更好地滿足快速、簡便、實用的重金屬離子的實際檢測需求.
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(責(zé)任編輯 陸泉芳)
收稿日期:2024-10-21
基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(22064014,82202324);蘭州市科技發(fā)展計劃項目(2021-1-146);甘肅省科技項目(21YF5FA071,21JR7RA538);甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(22JR5RA152);西北師范大學(xué)青年教師科研能力提升計劃項目(NWNU-LKQN2022-08);高校產(chǎn)業(yè)支撐計劃項目(2023CYZC-69,2024CYZC-05);2023甘肅省重點人才項目(2023RCXM26)
作者簡介:常溫卓(1997—),女,甘肅蘭州人,博士研究生.主要研究方向為電化學(xué)與化學(xué)測量新方法、新技術(shù).
E-mail:15800951150@163.com
*通信聯(lián)系人,男,教授,博士.主要研究方向為即時檢測(POCT)相關(guān)的可視化傳感和快速檢測試劑盒.
E-mail:xzh@nwnu.edu.cn