不同心皮數(shù)量棉花心皮發(fā)育特征、基因表達(dá)及相關(guān)性狀比較

摘要：【目的】探究棉花心皮發(fā)育特征，不同心皮數(shù)量的差異表達(dá)基因與植物激素含量，以及心皮數(shù)量與棉鈴發(fā)育的關(guān)系。【方法】以3心皮（C3）、4心皮（C4）、5心皮（C5）棉花材料為研究對(duì)象，觀察棉花心皮發(fā)育過(guò)程，統(tǒng)計(jì)不同雜交組配后代的心皮數(shù)量?；ㄑ堪l(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及激素含量測(cè)定，并在不同發(fā)育時(shí)期測(cè)定棉鈴的表型。【結(jié)果】花蕾長(zhǎng)度為2～3 mm時(shí)，心皮原基發(fā)育起始；花蕾長(zhǎng)度為4～5 mm時(shí)，心皮融合形成合生心皮。心皮原基的發(fā)育早于雌蕊器官。C3、C4、C5兩兩雜交F1的平均心皮數(shù)量介于雙親之間。C3、C4和C5中差異表達(dá)基因主要富集于生物學(xué)過(guò)程。花芽發(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天，富集通路中心皮發(fā)育相關(guān)基因AP1、AGL6、WUS、MYB21和ARF6在C5中的表達(dá)量高于C4，且顯著高于C3。花芽發(fā)育5 d、10 d，C5的茉莉酸含量顯著高于C3、C4，吲哚乙酸含量顯著低于C3、C4；C4的脫落酸含量顯著低于C3、C5。開(kāi)花后20 d、35 d和60 d，C5的棉鈴直徑、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著高于C3、C4?！窘Y(jié)論】3、4、5心皮棉花親本的雜交組配后代中，心皮數(shù)量介于雙親之間。多個(gè)心皮發(fā)育相關(guān)基因在C5中的表達(dá)量更高。開(kāi)花前，C5中茉莉酸含量最高，吲哚乙酸含量最低。心皮數(shù)量增多利于增加棉鈴直徑、鮮物質(zhì)質(zhì)量，同時(shí)增加纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：棉花；心皮數(shù)量；花芽發(fā)育；差異表達(dá)基因；激素含量；棉鈴

Carpel development characteristics and comparison of gene expression and related traits among cotton with different numbers of carpels

Wang Weiran， Yang Jing， Wang Meng， Zhou Zixin， Zhu Jiahui， Kong Jie*

（Institute of Economic Crops， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract： [Objective] This study aims to investigate the development characteristics of cotton carpel， the differentially expressed genes and plant hormone content among different carpel numbers， and the relationship between carpel number and cotton boll development. [Methods] Cotton plants with three carpels （C3）， four carpels （C4）， and five carpels （C5） were used as the research subjects. The development process of cotton carpel was observed， and the number of carpel in the offspring of different combinations was counted. Transcriptome sequencing and plant hormone content measurement of the carpels were performed at 5 days and 10 days after flower bud development， and on the day of flowering. Phenotype of cotton boll was measured at different developmental stages. [Results] When the flower bud length was 2-3 mm， the development of carpel primordia started; and when the flower bud developed to 4-5 mm， the carpel fused to form fully fused carpel. The development of carpel primordia preceded of pistil organ. The average number of carpel in F1 from different crosses between C3， C4， and C5 parents was between the two parents. The differentially expressed genes of C3， C4， and C5 are mainly enriched in biological processes. During floral bud development at 5 days and 10 days， and on the day of flowering， the expression levels of key genes related to carpel development in the enrichment pathway， including AP1， AGL6， WUS， MYB21， and ARF6， in C5 were higher than that in C4， and significantly higher than that in C3. At 5 days and 10 days of floral bud development， jasmonic acid （JA） content in C5 was significantly higher than that in C3 and C4， while indole acetic acid （IAA） content was significantly lower than that in C3 and C4; abscisic acid content in C4 was significantly lower than that in C3 and C5. At 20 days， 35 days， and 60 days after flowering， the cotton boll diameter， fresh weight of cotton boll， thickness of cotton boll petals， and fresh weight of fiber and ovule in C5 were significantly higher than that in C3 and C4. [Conclusion] The average number of carpel in the offspring from different crosses between the parents with 3， 4， and 5 carpels was between the two parents. Several carpel development-related genes showed higher expression level in C5. Before flowering， C5 has the highest content of JA and the lowest content of IAA. Increasing carpel number is conducive to increase the boll diameter， boll fresh weight， and fresh weight of fiber and ovule.

Keywords： cotton; carpel number; flower bud development; differentially expressed gene; hormone content; cotton boll

心皮作為植物孕育胚珠與雌性配子體的場(chǎng)所，是形成雌蕊的基本結(jié)構(gòu)，也是探究植物演化關(guān)系、劃分植物類群的重要依據(jù)。植物的雌蕊位于花器官的最內(nèi)層，被萼片、花瓣、雄蕊包裹，一般是由1個(gè)或多個(gè)心皮融合而成。植物在進(jìn)化過(guò)程中，為了適應(yīng)不同的環(huán)境，維持花器官的功能，心皮數(shù)量不斷發(fā)生變化。目前已發(fā)現(xiàn)的植物心皮類型有：1個(gè)心皮構(gòu)成單雌蕊，例如豆科植物[1]；2個(gè)以上的心皮構(gòu)成離生雌蕊，例如草莓[2]、玉蘭[3]等；2個(gè)以上的心皮構(gòu)成合生雌蕊，子房直連至柱頭（世界上80%的植物為此類）[4]，如番茄[5]、黃瓜[6]等；還有1類離生心皮，子房與花柱合生，而柱頭分離[7]。心皮發(fā)育過(guò)程中，不同的融合方式直接影響后期花器官的形態(tài)。

心皮數(shù)量可以通過(guò)花柱數(shù)量或者腹縫線數(shù)量來(lái)識(shí)別，花柱或腹縫線的數(shù)量等于心皮的數(shù)量[4]。心皮及心皮邊緣組織協(xié)調(diào)生長(zhǎng)形成子房，為胚珠的附著提供空間，心皮數(shù)量的增加能夠產(chǎn)生更多的胚珠，為后期獲得更多種子提供先決條件。在大多數(shù)植物中，心皮數(shù)量主要受遺傳因素調(diào)控，因此其數(shù)量較為穩(wěn)定，但部分植物會(huì)出現(xiàn)雄蕊結(jié)構(gòu)被類似雌蕊結(jié)構(gòu)的器官代替而產(chǎn)生雄蕊心皮化現(xiàn)象，造成花器官結(jié)構(gòu)變化以及雄性不育[8]。心皮的橫向分裂與形態(tài)建成與心皮發(fā)育早期生長(zhǎng)素的側(cè)向分布有關(guān)[9]，生長(zhǎng)素側(cè)向運(yùn)輸形成的濃度梯度能夠調(diào)控心皮發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)[10]。部分轉(zhuǎn)錄因子和植物激素則影響心皮融合[11]。BjCLV1在心皮外緣分生組織（carpel margin meristem， CMM）中特異性過(guò)表達(dá)能夠改變芥菜型油菜蒴果心室數(shù)和種子數(shù)量[12]。洋酸漿（Physalis floridana）中B類MADS-box基因GLOBOSA（GLO）的突變導(dǎo)致心皮結(jié)構(gòu)及功能受損，直接影響柱頭與花柱的結(jié)構(gòu)、柱頭的可接受性、花粉管的引導(dǎo)和胚囊的發(fā)育[13]。CsCLAVATA3通過(guò)調(diào)控相關(guān)植物激素的生物合成與代謝途徑影響黃瓜心皮數(shù)量；定點(diǎn)編輯CsCLAVATA3可將野生型黃瓜（3心皮）突變?yōu)?心皮黃瓜[6]，顯著提高黃瓜質(zhì)量和種子數(shù)量[14]。此外，果實(shí)中不同心皮數(shù)量的占比直接影響胚珠數(shù)量與胚珠敗育率，也是改變果實(shí)大小的關(guān)鍵因素之一[15]。

目前，關(guān)于植物心皮的形成以及由心皮衍生的組織器官發(fā)育的相關(guān)研究報(bào)道較多[7-12]，但針對(duì)棉花心皮發(fā)育的研究還不夠全面。本研究以不同心皮數(shù)量的棉花材料為研究對(duì)象，觀察心皮發(fā)育特征，探究供試材料雜交組配后代心皮數(shù)量的變化，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因，比較不同材料中心皮發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量，內(nèi)源激素含量以及棉鈴相關(guān)性狀（直徑、長(zhǎng)度、鮮物質(zhì)質(zhì)量等）在不同發(fā)育時(shí)期的變化，以期為相關(guān)研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州庫(kù)爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)的新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所育種家基地（86.08°E，41.68°N）。2017―2022年夏季白天最低氣溫為16～22 ℃，最高氣溫為37～39 ℃，試驗(yàn)地為壤土。

1.2 供試材料

試驗(yàn)材料為海島棉（Gossypium barbadense L.）海335（3個(gè)心皮，以下簡(jiǎn)稱為C3），陸地棉（G. hirsutum）新陸中54號(hào)（5個(gè)心皮，以下簡(jiǎn)稱為C5），海2122（以C5為父本、C3為母本雜交，然后以C3為輪回親本回交2次，重點(diǎn)選擇具有C3表型特征的4心皮單株，之后經(jīng)過(guò)不斷自交，于2011年育成。4個(gè)心皮，以下簡(jiǎn)稱為C4），均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年以C3、C4和C5為父母本采用完全雙列雜交設(shè)計(jì)構(gòu)建分離群體，2020年種植F1并進(jìn)行自交，2021年收獲F2：3種子，2022年種植收獲的F2：3考察植株心皮數(shù)量。

2019―2022年分別于4月13日、4月15日、4月12日和4月17日播種棉花材料。采用1膜4行模式，株距為10～15 cm，行距為60 cm。每個(gè)材料種植3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的面積為3.25 m2（0.65 m×5 m）。采用膜下滴灌，棉花全生育期共滴水10次，每667 m2單次灌水量為24～25 m3，隨水滴施肥料共計(jì)8次，單次施用尿素5 kg、磷酸氫二鉀3 kg、磷酸一銨3 kg，其他管理措施同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)棉田。

1.4 性狀指標(biāo)測(cè)定方法

每個(gè)小區(qū)選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害影響的3～5個(gè)單株，掛牌標(biāo)記各單株第4、6和9果枝第1果節(jié)的花芽。

1.4.1 心皮的發(fā)育過(guò)程及特征。對(duì)標(biāo)記的花芽定期取幼蕾，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾蜜腺到頂端的長(zhǎng)度（花蕾長(zhǎng)度），用手術(shù)刀片將其橫切，采用Leica M125顯微鏡（德國(guó)）觀察花芽不同發(fā)育時(shí)期對(duì)應(yīng)的心皮組織結(jié)構(gòu)變化。

1.4.2 心皮數(shù)量。棉株開(kāi)花之后，觀察標(biāo)記花蕾心皮的類型，統(tǒng)計(jì)心皮數(shù)量。

1.4.3 轉(zhuǎn)錄組分析?；ㄑ堪l(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天取標(biāo)記花蕾。分離出胚珠、子房和心皮，將分離出的心皮于－70 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取和植物激素含量測(cè)定。

用難提植物總RNA小提試劑盒（貨號(hào)：R4165-02，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）提取心皮RNA，送深圳華大基因研究中心進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)序深度為10×）。數(shù)據(jù)測(cè)定完成將下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控后設(shè)定閾值（P＜0.001，|log2 FC|＞1，F(xiàn)C為差異倍數(shù)，fold change）篩選差異表達(dá)基因，利用R語(yǔ)言包DESeq2對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology， GO）分析。比較GO富集通路中心皮發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段即fragments per kilobase of transcript per million mapped reads， FPKM）差異。

1.4.4 植物激素含量測(cè)定。將樣品稱量后用液氮研磨，用含內(nèi)標(biāo)的抽提液（甲醇、ddH2O、乙酸的體積比為80∶19∶1）提取植物激素，再用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]測(cè)定茉莉酸（jasmonic acid， JA）、脫落酸（abscisic acid， ABA）和吲哚乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）的含量。

1.4.5 棉鈴性狀考察。在開(kāi)花后3 d、10 d、20 d、35 d和60 d的上午9：30取標(biāo)記位置的棉鈴，測(cè)定棉鈴直徑（棉鈴最長(zhǎng)直徑）、棉鈴長(zhǎng)度（頂端至棉鈴基座的垂直距離）、棉瓣的厚度（棉瓣著生于心皮背腹兩側(cè)的距離）、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉殼鮮物質(zhì)質(zhì)量及纖維和胚珠的鮮物質(zhì)質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)。采用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 心皮發(fā)育過(guò)程

從棉鈴花芽出現(xiàn)到開(kāi)花，可分為6個(gè)時(shí)期，分別是花芽原基伸長(zhǎng)期、苞片分化期、花萼分化期、花瓣-雄蕊分化期、心皮分化期、花藥生殖器官（雌蕊與胚珠）形成期。其中，心皮的發(fā)育分為4個(gè)階段：花原基發(fā)育、隔膜融合、心室發(fā)育、雌蕊形成?；ɡ匍L(zhǎng)度為1～2 mm時(shí)（圖1A），為心皮發(fā)育初期，心皮開(kāi)始出現(xiàn)。在花芽分化初期（花蕾長(zhǎng)度為2～3 mm），花蕾雄蕊內(nèi)圍的心皮突起，形成心皮原基，此時(shí)心皮隔膜和初生藥室已形成（圖1B）。花蕾長(zhǎng)度為3～4 mm時(shí)，為心室形成期，雄蕊的花絲逐漸伸長(zhǎng)，雌蕊同步發(fā)育（圖1C）。隨著心皮原基的生長(zhǎng)，其外緣逐漸內(nèi)卷（圖1D）。在心皮分化初期，心皮之間是相互分離的（圖1E），當(dāng)心皮逐漸發(fā)育融合時(shí)，形成合生心皮。花蕾長(zhǎng)度為4～5 mm時(shí)，心皮完全融合，隨后心皮腹縫線邊緣有珠狀凸起，胚珠逐漸形成（圖1 F），此時(shí)心皮進(jìn)入成熟期，花蕾進(jìn)入快速發(fā)育階段。

2.2 心皮發(fā)育特征

棉花心皮分化期，雄蕊和雌蕊同步發(fā)育（圖1A～B）。隨著心皮原基的發(fā)育，其在分離-融合過(guò)程中通過(guò)折疊、卷曲形成內(nèi)在空間，并逐漸將胚珠包裹在內(nèi)，與胚珠同步發(fā)育。棉花子房通常由3～5個(gè)心皮合成，每一心皮的兩邊緣向內(nèi)延長(zhǎng)成為棉鈴的一室，胚珠著生于心皮的腹縫線（圖2）。C5的心皮數(shù)量多于C3、C4，因此，著生于C5心皮上的胚珠數(shù)量也更多（圖2A～C）。隨著棉鈴的發(fā)育（從心皮融合到胚珠表皮的纖維逐漸伸長(zhǎng)直至后期纖維脫水），心皮間的夾角幾乎不再變化。心皮數(shù)量越多，心皮之間的夾角越?。▓D2D～F）。

2.3 不同雜交組配后代的心皮數(shù)量

采用完全雙列雜交設(shè)計(jì)，從構(gòu)建的9個(gè)遺傳群體來(lái)看，F(xiàn)1心皮數(shù)量由父母本基因型共同決定。同一母本與不同心皮數(shù)量的父本雜交，F(xiàn)1的平均心皮數(shù)量會(huì)隨著父本心皮數(shù)量的增加而增加；同一父本與不同心皮數(shù)量的母本雜交，F(xiàn)1的平均心皮數(shù)量會(huì)隨著母本心皮數(shù)量的增加而增加。當(dāng)父本心皮數(shù)量大于母本時(shí)，其后代的平均心皮數(shù)量大于母本；當(dāng)父本心皮數(shù)量小于母本時(shí)，其后代的平均心皮數(shù)量大于父本。因此，不同心皮數(shù)量的雙親雜交后，F(xiàn)1心皮數(shù)量介于雙親之間（表1）。

（C5×C4）F1中5心皮棉鈴數(shù)量占比高于4心皮棉鈴，且未出現(xiàn)3心皮棉鈴；（C5×C4）F2分離出3心皮棉鈴（占群體調(diào)查總鈴數(shù)的6.36%）。隨著世代遞增（從F1、F2到F2：3），C5×C4雜交后代中，5心皮棉鈴數(shù)量占比逐漸減少，4心皮、3心皮棉鈴數(shù)量占比逐漸增加。（C3×C5）F1中4心皮棉鈴數(shù)量占比最大，隨著世代遞增（從F1、F2到F2：3），3心皮棉鈴數(shù)量占比增加，4心皮、5心皮棉鈴數(shù)量占比減少。相比于F1群體，F(xiàn)2與F2：3群體的平均心皮數(shù)量顯著下降，F(xiàn)2群體的平均心皮數(shù)量高于F2：3群體，但二者之間差異不顯著。在（C5×C4）和（C3×C5）的F1、F2及F2：3家系中，平均心皮數(shù)量均介于雙親之間（表2）。

2.4 心皮中差異表達(dá)基因的分析

2.4.1 GO富集分析。對(duì)C3、C4和C5心皮3個(gè)發(fā)育時(shí)期（花芽發(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天）差異表達(dá)基因的并集進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，被富集于生物學(xué)過(guò)程的路徑最多。C3中主要的生物學(xué)路徑有微管的運(yùn)輸過(guò)程、糖酵解過(guò)程、甘油醚代謝過(guò)程等；細(xì)胞組分主要為微管；分子功能主要為微管結(jié)合、微管蛋白活性、脂質(zhì)結(jié)合和陽(yáng)離子結(jié)合等（圖3A）。C4中主要的生物學(xué)路徑包括磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、植物型細(xì)胞壁組織、對(duì)激素的響應(yīng)等；細(xì)胞組分為膜的外在成分；分子功能主要為脂質(zhì)結(jié)合、陽(yáng)離子結(jié)合、磷酸化感應(yīng)激酶活性等（圖3B）。C5中主要的生物學(xué)路徑包括細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、生物合成過(guò)程、糖酵解過(guò)程等；細(xì)胞組分為細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器；分子功能主要為鎂離子結(jié)合、陽(yáng)離子結(jié)合、萜烯合酶活性等（圖3C）。

2.4.2 富集通路中心皮發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量。在GO富集通路中，發(fā)現(xiàn)了一些參與心皮發(fā)育的基因。根據(jù)注釋信息，CLV1參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，AP1、AP2和AGL6參與細(xì)胞發(fā)育，WUS參與細(xì)胞壁組織的分化，JAG參與維持細(xì)胞的氧化穩(wěn)態(tài)，MYB21參與次生壁合成，ARF6、ARF8和ARF16參與脂質(zhì)合成及細(xì)胞發(fā)育，PIN1、PIN3參與植物激素響應(yīng)。上述12個(gè)基因的表達(dá)量見(jiàn)圖4。

花芽發(fā)育5 d和10 d，C5中CLV1的表達(dá)量顯著高于C3（圖4A）；C5中AP1和ARF6的表達(dá)量顯著高于C3和C4（圖4B、H）；3個(gè)材料中AP2的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖4C）；C4和C5心皮中AGL6、WUS和MYB21的表達(dá)量顯著高于C3（圖4D～E、G）；C4心皮中PIN3的表達(dá)量顯著高于C3和C5（圖4L）。

花芽發(fā)育5 d，C5心皮中ARF8和ARF16的表達(dá)量顯著高于C3和C4（圖4I～J），3個(gè)材料中JAG和PIN1的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖4F、K）。

花芽發(fā)育10 d，C4和C5心皮中JAG和PIN1的表達(dá)量顯著高于C3（圖4F、K）；C4和C5心皮中ARF8的表達(dá)量顯著低于C3（圖4I）；C4心皮中ARF16的表達(dá)量顯著高于C3和C5（圖4J）。

開(kāi)花當(dāng)天，C5心皮中CLV1和PIN1的表達(dá)量顯著低于C3和C4（圖4 A、K）。C4和C5心皮中AP2、ARF16和PIN3的表達(dá)量顯著低于C3（圖4C、J、L）；C5心皮中WUS的表達(dá)量顯著高于C3和C4（圖4E）。C4和C5心皮中AP1、AGL6、JAG、MYB21和ARF6的表達(dá)量顯著高于C3（圖4B、D、F、G、H）。

綜上，花芽發(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天，C5心皮中AP1、AGL6、WUS、MYB21和ARF6的表達(dá)量更高，且與C3差異顯著。

2.5 棉花心皮內(nèi)源激素含量變化

隨著棉花花芽發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，3種心皮的JA含量均呈下降趨勢(shì)?；ㄑ堪l(fā)育5 d時(shí)，C5的JA含量顯著高于C3和C4，C4的JA 含量顯著高于C3?；ㄑ堪l(fā)育10 d時(shí)，C5的JA含量顯著高于C3和C4。開(kāi)花當(dāng)天，3個(gè)材料的JA含量無(wú)顯著差異（圖5A）。

花芽發(fā)育5 d，C5的ABA含量顯著高于C3和C4，C3的ABA含量顯著高于C4?；ㄑ堪l(fā)育10 d，C3和C5的ABA含量顯著高于C4，且達(dá)到了3個(gè)測(cè)定時(shí)期的最大值。開(kāi)花當(dāng)天，C5的ABA含量顯著高于C3和C4?；ㄑ堪l(fā)育5 d至開(kāi)花當(dāng)天，C4的ABA含量較低且整體表現(xiàn)較為穩(wěn)定（圖5B）。

棉花花芽發(fā)育5 d至開(kāi)花當(dāng)天，C3和C4的IAA含量呈下降趨勢(shì)，C5的IAA含量呈先升后降趨勢(shì)?；ㄑ堪l(fā)育5 d和10 d，C3和C4的IAA含量顯著高于C5。開(kāi)花當(dāng)天，3個(gè)材料的IAA含量無(wú)顯著差異（圖5C）。

2.6 棉鈴發(fā)育相關(guān)性狀

棉株開(kāi)花后，隨著棉鈴發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，C3、C4、C5的棉鈴直徑、棉鈴長(zhǎng)度均呈增加趨勢(shì)（圖6A～B），棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度、棉殼鮮物質(zhì)質(zhì)量以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均呈先上升后下降趨勢(shì)（圖6C～F）。

開(kāi)花后3 d，C3和C4的棉鈴直徑、棉鈴長(zhǎng)度顯著大于C5（圖6A～B），C4的鈴殼鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著大于C3和 C5（圖6E），C5的棉瓣厚度顯著大于C3和C4（圖6D），3種心皮類型的棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均無(wú)顯著差異（圖6C、F）。

開(kāi)花后10 d，C4和C5的棉鈴直徑顯著大于C3（圖6A），C3和C4的棉鈴長(zhǎng)度顯著大于C5（圖6B），C4的棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度、鈴殼鮮物質(zhì)質(zhì)量以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著大于C3和C5（圖6C～F）。

開(kāi)花后20 d，C5的棉鈴直徑、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著高于C3和C4（圖6A、C、D、F），C5的棉鈴長(zhǎng)度顯著低于C3和C4（圖6B），C5的鈴殼鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著低于C3，但顯著高于C4（圖6E）。

開(kāi)花后35 d和60 d，C5的棉鈴直徑、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度、鈴殼鮮物質(zhì)質(zhì)量以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于C3 和C4（圖6A、C～F），C5的棉鈴長(zhǎng)度顯著低于C3和C4（圖6B）。

3 討論

3.1 心皮發(fā)育特征

心皮作為開(kāi)花植物重要的生殖器官，在進(jìn)化中經(jīng)歷了離生到合生過(guò)程，并通過(guò)腹面融合形成隔膜，將心皮分成多個(gè)心室，從而為花粉傳輸提供通道[17]。心皮在花器官的最內(nèi)層，與花芽同步發(fā)育，在發(fā)育早期其結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，不易被觀察到。心皮作為雌蕊發(fā)育的關(guān)鍵組織，直接影響花器官的形態(tài)建成、種子數(shù)量及果實(shí)產(chǎn)量[5]。如果心皮原基發(fā)育異常，無(wú)法進(jìn)行正常融合，則導(dǎo)致花器官形態(tài)改變，甚至阻礙果實(shí)的正常成熟[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花心皮原基于花芽發(fā)育早期（花蕾長(zhǎng)度為2～3 mm）出現(xiàn)，花蕾長(zhǎng)度為4～5 mm時(shí)，心皮融合形成合生心皮。心皮融合之后，雄蕊快速發(fā)育，此時(shí)心皮數(shù)量趨于穩(wěn)定。心皮原基出現(xiàn)到心皮融合是心皮形成的關(guān)鍵期。

3.2 心皮數(shù)量的變化

植物發(fā)育過(guò)程中，心皮數(shù)量受多種因素的影響。十字花科植物的心皮數(shù)量主要受遺傳因素調(diào)控，其遺傳率較高，而豆科植物則較低[19]。本研究通過(guò)觀察棉花不同雜交組合后代心皮數(shù)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的心皮數(shù)量介于2個(gè)親本之間，多心皮數(shù)量的親本利于增加后代的心皮數(shù)量；隨著世代遞增，（C5×C4）后代中5心皮棉鈴數(shù)量占比下降，（C3×C5）后代中4心皮和5心皮棉鈴數(shù)量占比逐漸降低。這可能與心皮發(fā)育相關(guān)基因在不同后代中的表達(dá)量存在差異有關(guān)[19-20]。棉鈴的心皮數(shù)量受環(huán)境因素影響較大，因此不同部位果枝的心皮數(shù)量存在差異[21]。針對(duì)具體的研究材料，需要在特定的環(huán)境，對(duì)心皮數(shù)量進(jìn)行更加細(xì)致的研究。

3.3 基因表達(dá)和植物激素含量對(duì)心皮數(shù)量的影響

心皮發(fā)育受環(huán)境和遺傳因素的共同影響[22-25]。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與調(diào)控心皮數(shù)量的基因[5， 13， 26]。黃瓜中降低CLV3表達(dá)量會(huì)增加心皮數(shù)量，而過(guò)表達(dá)WUS可以產(chǎn)生更多心皮[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花心皮發(fā)育早期（花芽發(fā)育5 d），C5中CLV1、WUS的表達(dá)量顯著高于C3、C4，花芽發(fā)育10 d，C4、C5中CLV1、WUS的表達(dá)量顯著高于C3，推測(cè)CLV1和WUS基因可能影響棉花心皮數(shù)量。植物激素與相關(guān)基因的共同作用也會(huì)影響心皮數(shù)量[28]。野生番茄中JA通過(guò)MYB21調(diào)控心皮發(fā)育，MYB21功能喪失導(dǎo)致心皮形態(tài)發(fā)育異常[29]。生長(zhǎng)素生物合成、極性運(yùn)輸及相關(guān)基因的突變都會(huì)導(dǎo)致心皮數(shù)量改變[17，" 27]。本研究發(fā)現(xiàn)，花芽發(fā)育5 d和10 d，C5心皮中MYB21的表達(dá)量與JA含量顯著高于C3和C4；而C5心皮中IAA含量顯著低于C3與C4。李鴻萍[11]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子與植物激素影響心皮融合和心皮數(shù)量。響應(yīng)生長(zhǎng)素及調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的ARF轉(zhuǎn)錄因子能夠影響心皮極性發(fā)育[17]。本研究中，花芽發(fā)育5 d后，C5中ARF6、ARF8和ARF16的表達(dá)量顯著高于C3、C4，IAA含量顯著低于C3、C4；花芽發(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天，C5心皮中AP1、AGL6、WUS、MYB21和ARF6的表達(dá)量更高，且均與C3差異顯著，推測(cè)這5個(gè)基因的表達(dá)量變化可能影響棉花心皮數(shù)量。未來(lái)可通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)探究上述基因間的相互作用及其對(duì)棉花心皮發(fā)育和心皮數(shù)量的影響。

3.4 心皮數(shù)量對(duì)果實(shí)的影響

心皮數(shù)量的變化能夠改變果實(shí)的大小和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，番茄心皮相關(guān)基因通過(guò)調(diào)節(jié)花分生組織，使心皮數(shù)量增加，從而產(chǎn)生更大的果實(shí)[5]。心皮保護(hù)棉花胚珠的發(fā)育，是胚珠著生以及纖維發(fā)育的關(guān)鍵場(chǎng)所。本研究發(fā)現(xiàn)，棉株開(kāi)花后3 d、10 d，C5的棉鈴直徑、棉鈴長(zhǎng)度、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、鈴殼鮮物質(zhì)質(zhì)量、纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均低于C4；而開(kāi)花后20 d、35 d和60 d，C5的棉鈴直徑、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于C3和C4。心皮數(shù)量增多能夠增加種子數(shù)量和果實(shí)質(zhì)量[15]，可能是由于心皮數(shù)量增加，導(dǎo)致果實(shí)內(nèi)部腔室增多，能夠供給種子養(yǎng)分的側(cè)膜胎座空間增大[14]。未來(lái)可進(jìn)一步探究不同心皮數(shù)量棉花的種子數(shù)量、籽指、鈴重、籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀等的差異。

4 結(jié)論

棉花心皮發(fā)育起始于花芽分化初期，且心皮原基的發(fā)育早于雌蕊器官。3、4、5心皮棉花親本的雜交組配后代中，心皮數(shù)量介于雙親之間。花芽發(fā)育5 d、10 d和開(kāi)花當(dāng)天，3種心皮材料的差異表達(dá)基因多被富集于生物學(xué)過(guò)程。富集路徑中參與心皮發(fā)育的基因AP1、AGL6、WUS、MYB21和ARF6在5心皮棉花材料中的表達(dá)量高于3心皮棉花（差異顯著）和4心皮棉花。花芽發(fā)育5 d和10 d，5心皮棉花的JA和IAA含量最高、IAA含量最低，4心皮棉花的ABA含量最低。開(kāi)花后20 d、35 d和60 d，5心皮棉花的棉鈴直徑、棉鈴鮮物質(zhì)質(zhì)量、棉瓣厚度以及纖維和胚珠鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于3心皮棉花和4心皮棉花。

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（責(zé)任編輯：王小璐 責(zé)任校對(duì)：王國(guó)鑫）

第一作者簡(jiǎn)介：王為然（1989―），男，博士研究生，85338994@qq.com

*通信作者：kongjie.258@163.com

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)青年科學(xué)基金（2020D01B35）；新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科技骨干培養(yǎng)（xjnkq-2023002）；國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-15-09）；新疆維吾爾自治區(qū)棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系副首席科學(xué)家；新疆維吾爾自治區(qū)天山英才計(jì)劃（2023）