沼澤紅假單胞菌CGA009砷調(diào)控蛋白（ArsR）的調(diào)控作用

摘要： 采用改良的凝膠電泳遷移滯緩（EMSA）法和砷生物傳感法研究沼澤紅假單胞菌CGA009菌株6個(gè)高度異質(zhì)性ArsR相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明：6個(gè)ArsR相關(guān)蛋白都具有As（Ⅲ）依賴的調(diào)控活性，改良的 EMSA圖譜可用于系統(tǒng)評(píng)價(jià)ArsR的功能； 6個(gè)相關(guān)蛋白對(duì)異種（E. coli pR733 or Stapylococcus aureus pⅠ258）的砷抗性操縱子的調(diào)控具有不同的選擇性，氨基酸序列同源性（甚至低于30%同源性）的ArsR具有砷依賴的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 沼澤紅假單胞菌； 砷； 砷調(diào)控蛋白； 砷生物傳感

中圖分類號(hào)： Q 811.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-5013（2024）05-0618-08

Regulatory Role of Arsenic Regulatory Protein （ArsR） in Rhodopseudomonas palustris CGA009

Abstract： Using a modified gel electrophoretic mobility shift assay （EMSA） method and Arsenic biosensing method， the regulation of six highly heterogeneous ArsR-associated proteins from Rhodopseudomonas palustris CGA009 bacterial strain is investigated. The reseach results show that six ArsR-associated proteins exhibited As（Ⅲ）-dependent regulatory activity. The modified EMSA mappings can systematically evaluate the functions of ArsR. Six ArsR-associated proteins have different selectivity in regulating the arsenic resistance operon of different species （E. coli pR733 or Staphylococcus aureus pⅠ258）. ArsRs with amino acid sequence homology （even with below 30% homology） have arsenic-dependent regulation.

Keywords： Rhodopseudomonas palustris； arsenic； arsenic regulatory protein； arsenic biosensing

砷污染導(dǎo)致的環(huán)境和人類健康問題已成為全球關(guān)注焦點(diǎn)［1-2］。在與砷的長(zhǎng)期博弈中，微生物進(jìn)化出多種靈巧的抗砷手段，如氧化/還原、甲基化/去甲基化和外排［3-4］ 等。細(xì)胞中的砷代謝相關(guān)蛋白/基因是應(yīng)對(duì)環(huán)境砷脅迫的關(guān)鍵角色， 但其表達(dá)量的差異導(dǎo)致微生物對(duì)砷的抗性有較大差異。 深入解析微生物砷代謝與調(diào)控機(jī)制，對(duì)于微生物修復(fù)與治理環(huán)境砷污染具有重要意義［5-6］。砷調(diào)控蛋白（Arsenic regulatory protein，ArsR）在砷代謝調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用［7］，對(duì)于僅有1個(gè)ArsR基因微生物的砷調(diào)控機(jī)制已有較深入研究［8］，但很多微生物不只1個(gè)砷抗性操縱子（Arsenic resistance operons，ars） ［9-12］，不同的砷代謝（如砷還原、外排、甲基化及甲基胂氧化等）基因位于不同的arsR，其復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控關(guān)系及復(fù)雜環(huán)境中各基因發(fā)揮的作用難以預(yù)測(cè)和研究。

目前，關(guān)于多個(gè)ars的調(diào)控機(jī)制的研究?jī)H在極少數(shù)菌株上，主要包括Pseudomonas putida KT2440（2個(gè)arsR）［9］，Shewanella sp. ANA-3（6個(gè)arsR）［10］，Corynebacterium glutamicum ATCC13032（2個(gè)arsR）［11］和Agrobacterium tummefaciens （A. tummefaciens） 5A（4個(gè)arsR）［12］等。通過轉(zhuǎn)錄分析或敲入報(bào)告基因方法，研究ars本身表達(dá)調(diào)控關(guān)系［13］；通過基因敲除和轉(zhuǎn)錄分析方法，研究敲除arsR與特定靶基因表達(dá)關(guān)系［12］。A. tummefaciens 5A砷代謝調(diào)控是最為復(fù)雜的菌株，4個(gè)ArsR都具有砷代謝調(diào)控活性，同時(shí)，還參與其他非砷代謝基因（如pstS1和phoB1）調(diào)控。ArsR對(duì)特定的靶基因調(diào)控不但具有高度特異性，也存在交叉調(diào)控和重疊調(diào)控的現(xiàn)象，甚至同源性較低的多個(gè)ArsR都參與同一個(gè)ars操縱子調(diào)控，但這4個(gè)ArsR彼此之間的互作調(diào)控關(guān)系還不清楚［12］。此外，Shewanella sp.ANA-3的6個(gè)ArsR中，只有1個(gè)ArsR2同時(shí)參與2類不同操縱子（ars和arr）的調(diào)控，其他5個(gè)ArsR對(duì)這2個(gè)操縱子沒有調(diào)控作用［10］，但尚不清楚這5個(gè)ArsR是否具有砷依賴的調(diào)控活性或參與其他基因調(diào)控。由此可見，關(guān)于多個(gè)arsR共存菌株的ArsR是否具有砷依賴的調(diào)控活性及調(diào)控選擇性的研究尚待深入。

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris，R. palustris）CGA009 是首次證明細(xì)菌具有砷甲基化機(jī)制的菌株［14］，其基因組擁有As（V）還原、As（Ⅲ）外排、As（Ⅲ）甲基化和MAs（Ⅲ）氧化等相關(guān)基因。Zhao等［15］研究顯示該菌株砷甲基化基因響應(yīng)高質(zhì)量濃度As（Ⅲ）表達(dá)，但未檢測(cè)到砷甲基化產(chǎn)物。Yang等［16］進(jìn)一步揭示該菌株的2個(gè)砷外排蛋白（ArsB和Acr3）抑制了砷甲基化。Ke等［17］研究表明該菌株的4個(gè)ArsR與As（Ⅲ）結(jié)合能力差異很大，ArsR2活性最高，但其是否具有調(diào)控活性尚不清楚。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)沼澤紅假單胞菌CGA009砷調(diào)控蛋白（ArsR）的調(diào)控作用進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

砷操縱子缺失突變株E. coli AW3110 （ΔarsRBC）（北京市中科院朱永官研究員贈(zèng)送）；R. palustris CGA009（BAA-98）（美國(guó)ATCC）；E. coli BL21（DE3），BL21（pET-28a，Kanr）及DH5α（pUC19， Ampr）保存于實(shí)驗(yàn)室；E. coli AW3110（pUC19-OP-gfp-arsR）設(shè)計(jì)構(gòu)建于實(shí)驗(yàn)室，其中，gfp基因?yàn)閳?bào)告基因，其登錄號(hào)為BAG13002.1。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、離心柱型通用型DNA純化回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒（北京市天根生化科技有限公司）；Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ，Xho Ⅰ，Pst Ⅰ，BamH Ⅰ，Kpn Ⅰ，Xba Ⅰ和T4 DNA連接酶（上海市百賽生物技術(shù)股份有限公司）；Trans2K DNA Marker與DNA Marker P（北京市全式金生物技術(shù)有限公司）；蛋白胨與酵母抽提物（美國(guó)OXOID公司）；瓊脂糖（北京市索萊寶公司）；氨芐青霉素和卡那霉素（上海市生物工程股份有限公司）；NaAsO2（As（Ⅲ）），Merck （德國(guó)Darmstadt）及其他分析純?cè)噭ū本┦袊?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

在溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1下，培養(yǎng)基為L(zhǎng)ysogeny Broth （LB）液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。CGA009菌株采用改良的Ormerod培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃，光照度為3 000 lx中靜置培養(yǎng)［15］。

1.4 ArsR氨基酸序列聚類分析

從 NCBI （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載基因或氨基酸序列，采用MEGA 7.0軟件 （http：∥www.megasoftware.net/）鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建基于ArsR氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 ArsR克隆表達(dá)純化和調(diào)控活性的測(cè)定

以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ars基因。經(jīng)酶切（NcoⅠ和Xho Ⅰ）、連接（T4連接酶）、轉(zhuǎn)化BL21菌株、卡那霉素平板篩選和PCR驗(yàn)證［17］，獲得重組菌株BL21（pET-28a-arsR）。將BL21（pET-28a-arsR）接種到30 μg·mL-1卡那霉素LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h，加入0.2 mmol·L-1的IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactoside），在16 ℃下培養(yǎng)20 h。超聲波破碎細(xì)胞，收集蛋白提取液，通過Ni-NTA柱層析純化ArsR，采用SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)。采用改良的凝膠電泳遷移滯緩（EMSA）法測(cè)定ArsR、基因組DNA與As（Ⅲ）三者相互作用［18］。將純化的ArsR，基因組DNA與As（Ⅲ）混合（30 μL），在4 ℃下反應(yīng)2 h，采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 砷生物傳感菌株的構(gòu)建

1） 砷生物傳感系統(tǒng)的組成。由OP，arsR和gfp三個(gè)基因元件組成砷生物傳感系統(tǒng)，砷生物傳感菌株的基因元件和酶切位點(diǎn)，如圖1所示。

2） 基因元件設(shè)計(jì)和合成。從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因元件序列，采用Snap gene軟件（6.0.2）對(duì)基因元件進(jìn)行分析，并按圖1設(shè)計(jì)OPE1-arsRE1（630 bp，E. coli J62.1 pR773），OPS-arsRS（417 bp，S. aureus pI258）序列和酶切位點(diǎn)，由蘇州金唯智公司合成。

3） gfp擴(kuò)增和重組。以5′- CATGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3′和5′- CCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG -3′為引物，以AW3110（pUC19-Pars-gfp-arsR）質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增gfp；通過BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切和T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化AW3110菌株，篩選驗(yàn)證得到重組質(zhì)粒pUC19-gfp。

4） 砷生物傳感體系的構(gòu)建。將合成的OP-arsR基團(tuán)和重組質(zhì)粒pUC19 -gfp經(jīng)雙酶切（Hind Ⅲ和Xho Ⅰ）、連接轉(zhuǎn)化篩選、雙酶切（Hind Ⅲ和Xho Ⅰ）驗(yàn)證和熒光活性驗(yàn)證，得到2個(gè)重組菌株，標(biāo)記為OPE1 -arsRE1和OPS-arsRS。

5） 不同ArsR與OPE1，OPS相互作用生物傳感菌株的構(gòu)建。用待測(cè)arsRi基因替換重組菌株OPE1 -arsRE1和OPS-arsRS中的arsRE1和arsRS。引物序列，如表1所示。表1中：CTGCAG和CTCGAG為Pst Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)，GGATCC和GGTACC為BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。不同的arsR的重組菌株分別標(biāo)記為OPE1-arsRi，OPS-arsRi，arsRE1（E. coli J62.1 pR773），arsRS（S. aureus pI258），arsRE2（E. coli BL21）和arsR1 ～arsR6（R. palustris CGA009）。

1.7 不同ArsR與OPE1和OPS相互作用選擇性的測(cè)定

將構(gòu)建的砷生物傳感菌株接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，離心收集菌體，重新懸浮菌體，將菌懸液生物量調(diào)整至1.00，將體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到不同質(zhì)量濃度的As（Ⅲ）的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃，離心率為200 r·min-1的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間取樣，測(cè)定菌體生物量和熒光光譜。以同樣的方式培養(yǎng)，在優(yōu)化測(cè)定時(shí)間（10 h）取樣，測(cè)定各重組菌株熒光強(qiáng)度，考察其對(duì)As（Ⅲ）相應(yīng)的劑量和效應(yīng)的關(guān)系。

在1 cm熒光比色杯中，采用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液在波長(zhǎng)660 nm的菌懸液中菌體生物量（D）。將D調(diào)整為0.10，采用F97pro型熒光分光光度計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為479 nm，激發(fā)單元狹縫為10.0 nm，發(fā)射單元狹縫為5.0 nm，光電管高壓為780 V，掃描速度為1 000 nm·min-1，在1 cm熒光比色杯中，掃描波長(zhǎng)94～600 nm的熒光光譜或記錄波長(zhǎng)為512 nm的熒光強(qiáng)度（F512）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 砷調(diào)控蛋白（ArsR）系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ArsR氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖2所示。由圖2可知：E. coli菌株的3個(gè)ArsR具有較高的同源性，緊密地聚類在一起；R. palustris CGA009的6個(gè)ArsR（ArsR1～ArsR6）聚類在3個(gè)大的分支上，同源性差異較大。ArsR1，ArsR2，ArsR4和ArsR6聚類在一個(gè)分支上；CGA009的ArsR3與E. coli的3個(gè)ArsR聚在1個(gè)分支上，但與這3個(gè)ArsR同源性具有較大差異；ArsR5獨(dú)立在1個(gè)大的分支上。由此可見，同種不同菌株間的ArsR可以具有高度同源性，同一菌株不同的ArsR也可以具有高度異質(zhì)性。

2.2 ArsR依賴As（Ⅲ）調(diào)控活性的測(cè)定

ArsR依賴As（Ⅲ）調(diào)控活性的測(cè)定，如圖3所示。圖3中：1為蛋白質(zhì)粗提液；2為純化的蛋白質(zhì)；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。

由圖3（a）可知：經(jīng)過異源表達(dá)、純化和電泳檢測(cè)，獲得CGA009菌株的6個(gè)ArsR。基因組DNA，ArsR和As（Ⅲ）三者相互作用的檢測(cè)結(jié)果，如圖3（b）所示。由圖3（b）可知：無(wú)砷時(shí)，ArsR可與識(shí)別的基因組DNA序列結(jié)合，使基因組DNA電泳遷移率降低；有As（Ⅲ）時(shí)，As（Ⅲ）誘導(dǎo)ArsR構(gòu)象變化，使其與結(jié)合的基因組DNA分離，基因組DNA電泳遷移率升高。由此可見，無(wú)砷時(shí)，基因組DNA遷移率較低，添加As（Ⅲ）時(shí)遷移率升高，表明CGA009的6個(gè)ArsR均具有As（Ⅲ）誘導(dǎo)基因“開關(guān)”的功能。由于基因組DNA上擁有不同ArsR的所有結(jié)合位點(diǎn)，基于基因組DNA改良的EMSA法能夠良好評(píng)價(jià)ArsR的功能，圖譜清楚，結(jié)果明確。

2.3 砷生物傳感體系構(gòu)建

以gfp為報(bào)告基因，構(gòu)建OPE1-arsRE1和OPS-arsRS砷生物傳感菌株。重組菌株OPE1-arsRE1和OPS-arsRS雙酶切驗(yàn)證和熒光光譜，如圖4所示。圖4中：F為熒光強(qiáng)度；λ為波長(zhǎng)。由圖4可知：電泳條帶與預(yù)期OPE1-arsRE1（630 bp）和OPS-arsRS（416 bp）DNA片段條帶吻合（圖4（a））；與無(wú)砷對(duì)照相比，添加As（Ⅲ）能夠誘導(dǎo)菌株報(bào)告基因（gfp）高效表達(dá)，熒光強(qiáng)度明顯升高（圖4（b）），表明OPE1-arsRE1和OPS-arsRS菌株具有As（Ⅲ）生物熒光傳感活性。在此基礎(chǔ)上，將這2個(gè)重組菌株中的arsRE1和arsRS替換成其他菌株的arsR（檢測(cè)結(jié)果未顯示），用于研究異種間OP和ArsR相互作用。

2.4 ArsR與OP相互作用條件的確定

As（Ⅲ）對(duì)菌株的影響，如圖5所示。圖5中：ρ（As（Ⅲ））為As（Ⅲ）質(zhì)量濃度。由圖5可知：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌體D和F512升高，8 h基本穩(wěn)定；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，線性關(guān)系的斜率升高，本底值也升高，但線性關(guān)系范圍減小，線性關(guān)系范圍降至As（Ⅲ）質(zhì)量濃度為30 μg·L -1，8～10 h直線的斜率和本底值無(wú)明顯差異；隨著As（Ⅲ）質(zhì)量濃度的升高，菌株生長(zhǎng)速率降低，F(xiàn)512升高。由此表明，砷生物傳感菌株可用于As（Ⅲ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定，培養(yǎng)時(shí)間短，線性范圍寬，本底值低，但靈敏度低。因此，研究不同ArsR與OP的相互作用，選擇As（Ⅲ）質(zhì)量濃度為0～50 μg·L-1，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。

2.5 熒光生物傳感法檢測(cè)ArsR與OP的相互作用

ArsR為轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，若不與OP識(shí)別結(jié)合，基因表達(dá)將不受抑制，菌株產(chǎn)生GFP的熒光；若能相互作用，則抑制基因表達(dá)，菌株的熒光強(qiáng)度降低；As（Ⅲ）誘導(dǎo)可解除ArsR的轉(zhuǎn)錄抑制，使基因表達(dá)、菌體熒光強(qiáng)度升高。 ArsＲ 與 ＯＰ 的相互作用，如圖6所示。由圖6可知：除了ArsRE1外，ArsRE2和ArsR3也能與OP E1相互作用，抑制菌株GFP表達(dá)；隨著As（Ⅲ）質(zhì)量濃度升高，GFP表達(dá)量升高，其余5個(gè)ArsR均不能與OP E1相互作用（圖6（a））；除了ArsRS外，ArsR1和ArsR5也能與OPS相互作用，其余6個(gè)ArsR均不能與OPS相互作用（圖6（b））。由此表明，ArsR具有高度特異性調(diào)控作用，但也具有交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，除了菌株自身ArsR外，其他不同菌株甚至異種的外源ArsR也能發(fā)揮調(diào)控作用。

將圖6的As（Ⅲ）和GFP熒光（F512）的劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行線性擬合，從定量水平分析ArsR，OP和As（Ⅲ） 三者之間的相互作用。不同重組菌株的F512對(duì)As（Ⅲ）濃度響應(yīng)的線性擬合方程，如表2所示。表2中：k為斜率，反映砷解除ArsR對(duì)基因表達(dá)的抑制的能力，斜率越大，GFP表達(dá)越高，說(shuō)明ArsR對(duì)砷響應(yīng)活性高，反之則低；b為截距，反映ArsR與OP結(jié)合能力的大小，截距大，說(shuō)明ArsR與OP結(jié)合能力弱，反之則強(qiáng)；上標(biāo)a，b，c，d，e表示顯著性差異分析，不同字母間具有顯著性差異（Plt;0.05）。

由表2可知：與OPE1-ArsR E1相比，OP E1-ArsR E2親和力相近，但對(duì)砷響應(yīng)活性更高，OP E1-ArsR3親和力和對(duì)砷響應(yīng)活性則顯著降低；與OPS-ArsRS相比，OPS-ArsR1與OPS-ArsR5對(duì)砷響應(yīng)線性方程的斜率顯著降低，OPE1-ArsR E1的親和力更高，無(wú)砷環(huán)境中調(diào)控系統(tǒng)更有效，基因本底表達(dá)量更低。

3 結(jié)論

3.1 ArsR調(diào)控活性

ArsR在微生物砷代謝調(diào)控及砷代謝轉(zhuǎn)化過程中具有重要的作用。對(duì)于只有1個(gè)arsR菌株而言，arsR通常位于1個(gè)ars操縱子上，在無(wú)砷的環(huán)境中，ars操縱子基因表達(dá)產(chǎn)生ArsR，ArsR與操縱子的操縱區(qū)結(jié)合抑制基因表達(dá)。當(dāng)As（Ⅲ）存在時(shí)，可誘導(dǎo)ars操縱子基因的表達(dá)［18］。在已報(bào)道的多個(gè)arsR菌株中，Shewanella sp. ANA-3擁有6個(gè)arsR，但調(diào)控方式則相對(duì)簡(jiǎn)單，只有ArsR2發(fā)揮調(diào)控作用，可同時(shí)調(diào)控2種類型操縱子（ars和arr）靶基因的表達(dá)，其余5個(gè)arsR卻未呈現(xiàn)明確的調(diào)控作用［10］，但這5個(gè)arsR是否具有As（Ⅲ）依賴的調(diào)控活性或參與其他基因調(diào)控尚不明確。

EMSA法和DNA足跡法是2種經(jīng)典的定性的研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的方法［19］。DNA足跡法能全面地解決ArsR功能評(píng)價(jià)的問題，但需要高靈敏的放射性核素（32P）標(biāo)記基因組DNA，常規(guī)使用受限。EMSA法簡(jiǎn)單，主要用于評(píng)價(jià)ArsR對(duì)特定的基因組DNA片段是否具有識(shí)別作用，但菌株中不同的ArsR識(shí)別的基因組DNA片段并不清楚，即使ArsR對(duì)特定基因組DNA片段不識(shí)別，也不能證明ArsR沒有調(diào)控活性，ArsR可能對(duì)基因組DNA其他區(qū)域具有識(shí)別作用。在4個(gè)arsR相關(guān)基因［17］的基礎(chǔ)上，CGA009菌株又預(yù)測(cè)了2個(gè)新型的arsR，但這6個(gè)ArsR識(shí)別的基因組DNA序列并不清楚。鑒于此，以CGA009菌株的6個(gè)ArsR為對(duì)象，通過EMSA法研究ArsR、基因組DNA和As（Ⅲ）三者之間的相互作用。結(jié)果表明，基于基因組DNA改良的EMSA法能夠全面地評(píng)價(jià)ArsR的功能，且圖譜清楚，結(jié)果明確；CGA009菌株的6個(gè)ArsR都具有As（Ⅲ）依賴的調(diào)控活性，但這6個(gè)ArsR的作用位點(diǎn)及其在菌株中調(diào)控機(jī)制尚不清楚，還有待于進(jìn)一步的分析。

3.2 ArsR與基因組DNA的識(shí)別

ArsR與OP的選擇性識(shí)別是ArsR調(diào)控的基礎(chǔ)。ArsR系統(tǒng)發(fā)育表明，同種（E. coli）不同菌株（BL21，pR733和R46）的ArsR的同源性也較高，但同一菌株（如CGA009或ANA-3）的不同arsR同源性差異很大（圖2），這與文獻(xiàn)［12］在其他菌種（株）中分析結(jié)果基本一致。在生物進(jìn)化過程中arsR可能存在橫向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象［12］，從理論上分析ArsR在異種間應(yīng)該具有調(diào)控作用，但尚未見報(bào)道。因此，利用2個(gè)OP序列，構(gòu)建可替換基因元件的砷生物傳感菌株，探討異種菌株ArsR，基因組DNA和As（Ⅲ）三者之間的相互作用的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源ArsR能在同種不同菌株及異種菌株中發(fā)揮調(diào)控作用。

A. tummefaciens 5A擁有4個(gè)ArsR，高度同源性（93%）的ArsR1和ArsR4具有高度的調(diào)控特異性，二者不能等效替代；而同源性只有44%的 ArsR1和ArsR3，卻能發(fā)生交叉反應(yīng)［12］。ArsR與OPE1相關(guān)作用表明：與ArsRE1同源性為77%的ArsRE2對(duì)OPE1識(shí)別作用與ArsRE1一致，且砷誘導(dǎo)表達(dá)活性更高，即ArsRE2可替代ArsRE1的作用，這與高度同源的ArsR“不能相互替代”的結(jié)果不同［12］；與ArsRE1同源性為42.4%的ArsR3，也能識(shí)別OPE1發(fā)揮調(diào)控作用，這與同源性較低的ArsR之間能發(fā)生交叉反應(yīng)的結(jié)果基本一致［12］；其他6個(gè)ArsR雖然都具有砷依賴的調(diào)控活性，但均不能識(shí)別OPE1，表明ArsR對(duì)DNA識(shí)別又具有高度特異性。

與菌株自身ArsRS相比，同源性低于30%的ArsR5（28.6%）和毫無(wú)同源性的ArsR1，卻能識(shí)別異源的OPS發(fā)揮調(diào)控作用，但同源性相對(duì)較高的ArsR3（41%）卻不能識(shí)別OPS發(fā)揮調(diào)控作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道的ArsR的特異性調(diào)控和交叉調(diào)控結(jié)果［12］是一致的，只是顯示親緣關(guān)系差別更大、甚至毫無(wú)親緣關(guān)系的ArsR也具有相互識(shí)別調(diào)控的作用。

高度同源的ArsR彼此之間卻沒有等效調(diào)控作用，表明ArsR對(duì)基因組DNA識(shí)別序列具有高度特異性，可能是因?yàn)锳rsR與基因組DNA結(jié)合域的個(gè)別氨基酸差異［12］。由此可知，同源性很高的ArsR由于基因組DNA結(jié)合域的關(guān)鍵氨基酸不同，ArsR與基因組DNA識(shí)別序列特異性也不同；同源性很低甚至毫無(wú)同源性的ArsR卻能識(shí)別相同的基因組DNA片段，原因可能是ArsR與基因組DNA結(jié)合域的某些氨基酸相似度較高，也可能是識(shí)別的基因組DNA片段的位點(diǎn)不同。由此可知，ArsR對(duì)基因組DNA的識(shí)別序列具有豐富的多樣性，目前難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。這可能也是多個(gè)ArsR菌株的砷代謝調(diào)控機(jī)制難以分清ArsR識(shí)別基因組DNA位點(diǎn)的原因之一。根據(jù)異種已知的基因組DNA序列，推測(cè)研究菌株中未知的ArsR作用位點(diǎn)，還有待進(jìn)一步研究。

通過改良的EMSA法研究ArsR、基因組DNA 和As（Ⅲ）三者之間的相互作用。結(jié)果表明，CGA009菌株的6個(gè)ArsR（包括預(yù)測(cè)的2個(gè)ArsR相關(guān)基因）都具有As（Ⅲ）依賴的調(diào)控活性；由于基因組DNA上具有相關(guān)ArsR全部的識(shí)別位點(diǎn)，基于基因組DNA 改良的EMSA法能夠良好地評(píng)價(jià)ArsR的功能，圖譜清楚，結(jié)果明確。采用砷生物傳感法研究了異種間ArsR、基因組DNA和As（Ⅲ）三者之間的相互作用。結(jié)果顯示，同種不同菌株（親緣關(guān)系相對(duì)較近，ArsRE2與OPE1），甚至異種間（親緣關(guān)系很遠(yuǎn)ArsR1和ArsR5與OPS）的外源ArsR，也具有相互識(shí)別作用，反而一些親緣關(guān)系相對(duì)較近ArsR（ArsR3與OPS）卻不能相互作用，表明ArsR調(diào)控選擇性并不是由氨基酸序列的同源性高低決定的，可能與ArsR識(shí)別基因組DNA結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸有關(guān)，這為深入研究微生物復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供了思路和研究方法。

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