維生素B6的合成代謝及其生產(chǎn)應(yīng)用

摘要： 為了得到環(huán)保、便捷且效率更高的維生素B6代謝生產(chǎn)途徑，綜述了維生素B6作為重要的生物活性小分子在不同生物體中參與的天然合成代謝途徑及目前研究發(fā)現(xiàn)的偶然代謝途徑；同時(shí)，總結(jié)了利用生物酶法與代謝工程生產(chǎn)維生素B6的生物合成法。結(jié)果表明：通過生物合成維生素B6可以代替化學(xué)合成法，但未來仍需要研究者對代謝途徑進(jìn)行不斷優(yōu)化、篩選，以得到更高產(chǎn)量的維生素B6。

關(guān)鍵詞： 維生素B6； 系統(tǒng)代謝工程； 偶然途徑； 酶催化

中圖分類號： Q 56文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0588-08

Synthesis Metabolism and Production Application of Vitamin B6

Abstract： In order to achieve an environmentally friendly， convenient， and more efficient metabolic production pathway for vitamin B6， the natural metabolic and serendipitous pathways of vitamin B6 as an important bioactive small molecule in various organisms are comprehensively reviewed. Additionally， the biosynthesis method of vitamin B6 production by enzyme and metabolic engineering techniques is summarized. The results indicate that biosynthesis can serve as an alternative method to chemical synthesis for producing vitamin B6. However， further research is needed to continuously optimize and screen the metabolic pathway to obtain higher yields of vitamin B6.

Keywords： vitamin B6； system metabolic engineering； serendipitous pathway； enzyme catalysis

維生素B6（vitamin B6，VB6）是一種重要的水溶性B族維生素，由吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺6種形式組成，其中，磷酸吡哆醛（pyridoxal 5-phosphate，PLP）具有生物活性，磷酸吡哆胺（pyridoxamine 5-phosphate，PMP）只在較小程度上具有活性。PLP作為生物體內(nèi)的活性小分子，以輔酶的形式參與各種代謝過程，至今為止在生物體中發(fā)現(xiàn)了160多種利用PLP作為輔因子的酶，這些PLP依賴性酶涵蓋了多種反應(yīng)類型，如外消旋、脫羧、β/γ-消除和取代反應(yīng)［1-3］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在自然界早期進(jìn)化過程中，PLP和金屬的結(jié)合可以替代酶促轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，這些研究結(jié)果證明了PLP作為常見的輔酶即使在沒有酶的情況下也可以充當(dāng)代謝反應(yīng)的催化劑［4］。

在人體的腸道中，只有非磷酸化的VB6形式才可以進(jìn)入腸細(xì)胞，從腸細(xì)胞出去以后在肝臟中被磷酸化，VB6的6種形式在不同的細(xì)胞中有不同的運(yùn)輸形式。同時(shí)，PLP作為人體中的活性小分子，以輔酶的形式協(xié)助酶參與神經(jīng)遞質(zhì)合成、葉酸合成、血紅素生物合成、單碳單元轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)核酸生物合成、鞘磷脂合成和碳水化合物的代謝。維生素B6還與糖尿病、心臟病、癌癥、心血管等多種疾病有關(guān)［5-6］。除了與上述疾病的發(fā)生機(jī)制相關(guān)，VB6還可以應(yīng)用到臨床治療中。新冠肺炎患者通常產(chǎn)生過度的T細(xì)胞反應(yīng)和過量的促炎細(xì)胞因子來應(yīng)對病毒，PLP有助于抑制部分患者的細(xì)胞因子風(fēng)暴與炎癥的發(fā)生［7-8］。P57是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑［9］，它通過調(diào)節(jié)VB6代謝，在低溫治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。磷酸吡哆醛激酶（pyridoxal kinase，PdxK）是P57在體溫調(diào)節(jié)中的一個(gè)未知的靶點(diǎn)，在臨床治療環(huán)境中通過降低體溫保護(hù)人體組織在神經(jīng)血管、心血管缺血性疾病中避免造成細(xì)胞死亡［10］。

基于此，本文綜述了維生素B6的合成代謝及其生產(chǎn)應(yīng)用。

1 維生素B6的合成代謝通路

生物體存在2種不同的VB6從頭合成途徑，即5-磷酸脫氧木酮糖（deoxyxylulose 5-phosphate，DXP）依賴性途徑和非依賴性途徑。DXP依賴性途徑主要存在于α-和γ-蛋白細(xì)菌中，如革蘭氏陰性模式菌大腸桿菌，并且在大腸桿菌的這一途徑中，磷酸吡哆醇磷酸酶尚未被鑒定，可能使用具有非特異性底物的磷酸酶［1］。DXP非依賴性生物合成途徑僅涉及PLP合成酶復(fù)合體（PLP synthase complex，PdxST），在革蘭氏陽性模式菌枯草芽孢桿菌、真菌、原生動物、古菌、植物和后生動物中發(fā)現(xiàn)。至今為止還沒有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有2種VB6從頭合成途徑的生物體，包括人類和其他哺乳動物在內(nèi)的許多生物體只存在VB6相互轉(zhuǎn)化的補(bǔ)救途徑［11］。

1.1 DXP依賴性途徑

DXP依賴性途徑含有來自2個(gè)分支途徑的7種酶，均起始于丙三醇的磷酸化途徑，如圖1所示。

4-磷酸赤蘚糖（erythrose 4-phosphate，E4P）在4-磷酸赤蘚糖脫氫酶（erythrose 4-phosphate dehydrogenase，Epd）及輔酶NAD+的催化下脫氫生成4-磷酸赤酮酸（4-phosphoerythronate，4PE），接著在4-磷酸赤酮酸脫氫酶（4-phosphoerythronate dehydrogenase，PdxB）及輔酶NAD+的催化下脫氫生成2-氧代-3-羥基-4-磷酸丁酸（2-oxo-3-hydroxy-4-phosphobutanoate，OHPB），PdxB在一些生物體中被同源酶PdxR取代，如在Sinorhizobium meliloti中［12］。OHPB與谷氨酸（glutamate，Glu）在3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（3-phosphoserineaminotransferase，SerC）的催化作用下生成α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）與4-磷酸羥基-L-蘇氨酸（4-phosphohydroxy-L-threonine，4HTP），α-KG可以作為PdxB的生理再氧化劑。4HTP作為底物在4-磷酸羥基-L-蘇氨酸脫氫酶（4-phosphohydroxy-L-threonine dehydrogenase，PdxA）及輔酶NAD+的催化下生成3-磷酸羥基-1-氨基丙酮（3-phosphohydroxy-1-aminoacetone，PHA），3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，G3P）與丙酮酸（pyruvate，Pyr）在1-脫氧木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase，DXS）作用下生成DXP，其與PHA在磷酸吡哆醇合成酶（PNP synthase，PdxJ）催化下生成磷酸吡哆醇（pyridoxine 5-phosphate，PNP），PNP在PNP氧化酶（PNP oxidase，PdxH）氧化下生成終產(chǎn)物PLP。

1.2 非DXP依賴性途徑

非DXP依賴性途徑由PdxST合酶組成，其中PdxT部分亞基通過序列比較預(yù)測是Ⅰ類谷氨酰胺酶家族的成員，特征是半胱氨酸-組氨酸-谷氨酸催化三聯(lián)體。谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶通常由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即合酶和谷氨酰胺酶結(jié)構(gòu)域。在谷氨酰胺酶結(jié)構(gòu)域中，谷氨酰胺被水解產(chǎn)生谷氨酸和氨，然后被轉(zhuǎn)移到合酶結(jié)構(gòu)域，并用于合成相應(yīng)的含氮化合物PLP。谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物由24個(gè)蛋白質(zhì)單元組成，這些蛋白質(zhì)單元像齒輪一樣組裝，是1個(gè)與12個(gè)PdxT亞基相連的12元體PdxS。在PdxS的N-末端有1個(gè)獨(dú)特的α-螺旋，命名為αN，催化與PdxT亞基的相互作用［11，13］。在模式菌枯草芽孢桿菌的PdxT中，β3折疊和螺旋α3區(qū)域之間Gly47與Ala80的肽氮形成氧陰離子孔，其被發(fā)現(xiàn)與PdxS、谷氨酰胺形成三元復(fù)合物以進(jìn)行正確的催化［14］。該三元結(jié)構(gòu)表明PdxT內(nèi)部的氧陰離子構(gòu)象通過與PdxS的αN相互作用而穩(wěn)定，也因此證明了二者之間的依賴性。此外，PdxST合酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明，氨在谷氨酰胺酶和合酶活性位點(diǎn)之間的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移通過PdxS β-桶內(nèi)富含甲硫氨酸的隧道。谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、催化效率低，不利于通過改造手段提高酶的催化活性，因此，在VB6發(fā)酵生產(chǎn)的改良過程中很少選擇這條代謝途徑［1，14］。

1.3 維生素B6補(bǔ)救途徑

在生物體中，無論是否含有維生素B6的從頭合成途徑，它都存在補(bǔ)救途徑。不含從頭合成途徑的有機(jī)體可以通過從外界吸收吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆醛（pyridoxal，PL）和吡哆胺（pyridoxamine，PM）在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化為維生素B6的6種形式。

補(bǔ)救途徑主要含有2種酶：PdxK和PdxH，PN/PL/PM均可以在前者的作用下生成PNP/PLP/PMP。在大腸桿菌和其他原核生物中發(fā)現(xiàn)含有由基因pdxY編碼的同源PL激酶PdxY，PdxY與PdxK激酶具有非常低的序列同一性（約30%），該蛋白也在補(bǔ)救途徑中發(fā)揮作用，但與PdxK相比，催化活性非常低。PNP與PMP均可以在PdxH的催化下生成PLP，3種磷酸化的VB6分子在磷酸酶的作用下去磷酸化。研究者發(fā)現(xiàn)，ybhA基因編碼一種PLP磷酸酶，該酶屬于鹵酸脫鹵酶（HAD）超家族。在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)1種PdxI酶，在輔酶NAPD+的協(xié)助下，將PL還原成PN。PLP和PMP的互轉(zhuǎn)在轉(zhuǎn)氨酶的作用下進(jìn)行。據(jù)研究，在枯草芽孢桿菌中可能不存在PdxH酶，枯草芽孢桿菌中的pdxST敲除突變體對PL是營養(yǎng)缺陷型，而PN與突變體的互補(bǔ)性非常弱?？莶菅挎邨U菌可以吸收并磷酸化PL，但很難（或不能）為其生長需求募集PN，這很可能是由于缺乏專用的PNP氧化酶，并且在枯草芽孢桿菌基因組中缺失了編碼大腸桿菌PNP氧化酶的pdxH同源物［15-16］。

2 維生素B6的生產(chǎn)應(yīng)用

2.1 維生素B6的生物合成

縱觀維生素B6的生產(chǎn)過程，從化學(xué)合成法到采用綠色、環(huán)保的微生物發(fā)酵，展現(xiàn)了現(xiàn)代生物基因改造手段的不斷進(jìn)化?；瘜W(xué)合成大多圍繞噁唑法不斷改良，產(chǎn)率提高的同時(shí)也引發(fā)了環(huán)保的問題，化學(xué)過程使用了過多的溶劑，如苯和甲苯，且工業(yè)副產(chǎn)品處理困難、成本高昂，如大量的磷酸鹽［17］。此外，高溫和氯化反應(yīng)增加了安全風(fēng)險(xiǎn)，國內(nèi)多家工廠曾出現(xiàn)因生產(chǎn)帶來污染而停工的現(xiàn)象，通過微生物生產(chǎn)維生素也因此快速發(fā)展。

雖然PLP是在生物體內(nèi)起作用的維生素B6形式，由于人體腸道無法吸收磷酸化的VB6，因此，商業(yè)化的維生素B6大多為PN［6］。VB6合成的研究集中在DXP依賴途徑，所用的工程菌主要有大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）、苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti，S. meliloti）等。早在20世紀(jì)70年代，人們就將目光投入到原核生物上，最早基因工程還沒有達(dá)到現(xiàn)在的水平，只通過表達(dá)野生型菌株得到維生素B6。隨著對微生物體內(nèi)代謝途徑研究的深入，研究者開始對上述模式菌株進(jìn)行簡單改造，通過過表達(dá)VB6合成途徑中的一種或多種天然或異源的酶來達(dá)到提高VB6的產(chǎn)量的目的［18-20］。工程菌生產(chǎn)維生素B6的優(yōu)化方式，如表1所示。表1中：t為時(shí)間；ρ為產(chǎn)量；Ec為Escherichia coli；Sm為Sinorhizobium meliloti；Eme為Ensifermeliloti；Gni為Glaciecola nitratireducens；MM為基本培養(yǎng)基。

Commichau等［15］通過在枯草芽孢桿菌中過表達(dá)DXP依賴性合成維生素B6途徑的5個(gè)基因生成PN生產(chǎn)菌株，將來源于大腸桿菌和苜蓿中華根瘤菌的基因pdxA，pdxJ，epd，serC與pdxR組裝到2個(gè)表達(dá)盒中，并插入到敲除了pdxST的枯草芽孢桿菌染色體。通過優(yōu)化生長條件并共同加入4-羥基-蘇氨酸（4-hydroxy-L-threonine，4HT）和脫氧木酮糖（deoxyxylulose，DX）來提高產(chǎn)率。盡管通過在培養(yǎng)基中加入特定被4HT抑制合成的氨基酸可以優(yōu)化生長條件，但是氨基酸的存在仍會產(chǎn)生反饋抑制，改造后的菌株對引入的異源維生素B6途徑的一種或多種酶存在強(qiáng)烈的選擇壓力，暴露了異源表達(dá)生產(chǎn)PN技術(shù)的局限性。

前人的研究成果顯示，僅利用過表達(dá)某種或某幾種基因可能會暫時(shí)提高維生素B6的產(chǎn)量，但是得到的工程菌不穩(wěn)定、遺傳性差，遠(yuǎn)不如通過適應(yīng)性突變得到的菌株性狀穩(wěn)定，推測原因有以下3點(diǎn)。1） 參與DXP代謝途徑的7種酶的動力學(xué)性質(zhì)不同，其中，PdxA與PdxJ屬于限速酶，在代謝通路中催化速率較慢，而Epd，PdxB與SerC反應(yīng)速率快，如果不控制酶的表達(dá)量很容易造成毒性中間產(chǎn)物4HTP過度積累，最終使菌株死亡，4HTP合成的過程使同型絲氨酸激酶（homoserine kinase，ThrB）酶促反應(yīng)功能單一化，抑制了多種氨基酸的合成（圖1）。2） 生物體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的調(diào)控作用會維持PLP的穩(wěn)定，據(jù)顯示，PLP僅以非常小的催化量被需要，并且一些酶儲存PLP，其可以被轉(zhuǎn)移到依賴于PLP的載酶。再加上低效的酶通過維生素B6生物合成途徑的代謝通量非常低，因此，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)減弱終產(chǎn)物PLP對VB6合成途徑的抑制。3） 模式菌株被動地轉(zhuǎn)入基因后進(jìn)行發(fā)酵并不穩(wěn)定，幾代以后容易造成基因丟失，而通過改變培養(yǎng)環(huán)境得到的適應(yīng)性突變菌株卻可以得到穩(wěn)定的遺傳。

有了以上研究經(jīng)驗(yàn)，為了提高生產(chǎn)菌的遺傳穩(wěn)定性，Commichau等［16］運(yùn)用適應(yīng)性突變的策略，在添加了4HT的培養(yǎng)基中獲得了耐受型枯草芽孢桿菌突變菌，并發(fā)現(xiàn)bcaP基因的1 094～1 159堿基缺失，由于該基因編碼B. subtilis和Lactococcus lactis中的支鏈氨基酸滲透酶，推測bcaP的缺失減慢了4HT的吸收速度，并解除了對氨基酸合成的競爭性抑制。hom-thrC-thrB操縱子編碼參與蘇氨酸生物合成轉(zhuǎn)化的酶，通過適應(yīng)性突變所得到的耐受型菌株的啟動子發(fā)生變異，命名該突變?yōu)镻*hom（T63C）。P*hom（T63C）啟動子突變導(dǎo)致對蘇氨酸抑制的解除，增強(qiáng)了對干擾蘇氨酸生物合成的4-HO-Thr的抗性。芳香族化合物的積累表明，新的維生素B6代謝途徑與色氨酸生物合成途徑之間存在相互干擾。為了防止菌株產(chǎn)生副產(chǎn)物，研究者構(gòu)建了刪除色氨酸操縱子的菌株ΔtrpEDFCAB，發(fā)現(xiàn)此時(shí)維生素B6途徑和Trp生物合成途徑之間的干擾解除。為了提高突變株的產(chǎn)率，在添加了DX的培養(yǎng)基中獲得了適應(yīng)性突變，在枯草芽孢桿菌中組成型表達(dá)生成DXP的同源酶（基因型Pspac dxs erm），至此，在宿主菌體內(nèi)產(chǎn)生了非天然DXP依賴性VB6合成途徑［11，16］。

近期，Liu等［1］通過迭代多模塊優(yōu)化策略做出了以下改進(jìn)。1） 在大腸桿菌系統(tǒng)中解耦連PN和PLP的生產(chǎn)途徑，有機(jī)體不會因?yàn)镻LP含量過高而抑制DXP依賴途徑的發(fā)生。在敲除pdxH基因的位點(diǎn)插入pdxSH，并通過調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomebinding site，RBS）強(qiáng)度提高翻譯強(qiáng)度。同時(shí)，將PNP磷酸酶（PNP phosphatase，pdxP）基因插入大腸桿菌的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphate acetyltransferase，pta）基因座中，從而避免了PNP積累對氨基酸代謝的抑制。2） 對關(guān)鍵酶PdxA和PdxJ進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，通過將PdxA的His136位點(diǎn)突變?yōu)锳sn氨基酸，發(fā)現(xiàn)可以使酶與底物產(chǎn)生直接相互作用，有利于PdxA的穩(wěn)定催化，從而提高收率。PdxJ的突變體（E104T/I218L/G194C）也被證明可以提高酶的催化能力。3） 敲除3-磷酸甘油酸脫氫酶基因（3-phospho-D-glycerate dehydrogenase，serA）補(bǔ)充甘氨酸、α-KG，促進(jìn)SerC從主要合成絲氨酸轉(zhuǎn)向?qū)B6的合成，以甘氨酸（glycine，Gly）替代絲氨酸（serine，Ser），以防止絲氨酸的濃度過高而對菌株造成的生長抑制。α-KG作為PdxB的生理再氧化劑促進(jìn)了代謝的進(jìn)行。4） 把維生素B6合成途徑劃分為上游推動部分和下游拉動部分，在4HTP處分離。上游部分由低拷貝質(zhì)粒表達(dá)Epd，Dxs，PdxB和SerC組成，通過提供足夠的DXP和中間4HTP來增強(qiáng)推動驅(qū)動力，下游通路由高拷貝質(zhì)粒表達(dá)關(guān)鍵酶PdxA和PdxJ組成以增加拉力。

2.2 維生素B6的偶然途徑合成

研究者對模式菌株大腸桿菌與枯草芽孢桿菌突變體進(jìn)行抑制因子篩選，使其攜帶天然途徑或異源基因的突變，從而揭示了PLP生物合成的新途徑。這些途徑由具有多種底物的非特異性酶和已經(jīng)參與維生素B6生物合成的酶組成。因此，E. coli與B. subtilis含有多種混雜的酶，導(dǎo)致所謂的偶然途徑（serendipitous pathway，SP），使細(xì)菌繞過被破壞的維生素B6生物合成途徑。

以大腸桿菌為例，截止目前，研究者已發(fā)現(xiàn)至少4條偶然途徑可以在敲除了VB6合成途徑中的酶時(shí)提供臨時(shí)的補(bǔ)充合成途徑（圖1）。他們通過將含有3 276個(gè)來自大腸桿菌的ORF引入質(zhì)粒中，并在敲除pdxB基因的大腸桿菌中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中有7種不同基因的過表達(dá)恢復(fù)了ΔpdxB菌株的生長。通路1的具體途徑已經(jīng)被研究者詮釋，這條途徑是通過YeaB（未知具體功能）、L-丙氨酸醛縮酶（L-allo-threonine aldolase，LtaE）和ThrB將3-磷酸羥基丙酮酸鹽（3-phosphohydroxy-pyruvate，3PHP）從絲氨酸合成途徑拉向合成維生素B6。這種新型代謝途徑所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可能含有對宿主生長不利的物質(zhì)，如4HT與3-羥基丙酮酸（3-hydroxy-pyruvate，3HP），3HP抑制絲氨酸和支鏈氨基酸的產(chǎn)生，而4HT干擾蘇氨酸的生物合成。正常代謝網(wǎng)絡(luò)的成分以3種方式干擾新的PLP合成途徑：絲氨酸通過負(fù)反饋機(jī)制抑制SerA作用，并阻止新途徑中第1個(gè)中間體3PHP的形成；同型絲氨酸（Homo-serine，Homo-Ser）在新的合成途徑中抑制4HT向4HTP的轉(zhuǎn)化，因?yàn)門hrB可以非特異性的磷酸化4HT與同型絲氨酸；乙酰羥基酸合成酶的同工酶將3HP從新的途徑中轉(zhuǎn)移出來，形成1個(gè)代謝產(chǎn)物。通路2由咪唑焦磷酸脫水酶和組氨酸磷酸酶（imidazoleglycerolphosphatedehydratase and histidinol phosphatase，HisB）、Php（未知具體功能）和YjbQ（未知具體功能）3種酶構(gòu)成，通過生成OHPB進(jìn)入代謝途徑。通路3目前只發(fā)現(xiàn)了3-脫氫奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase，aroB）基因，由于AroB沒有可檢測的4HTP脫氫酶活性，推測其可能通過生成PHA替代原有代謝途徑，目前還沒有研究對通路2和通路3進(jìn)行詳細(xì)的解釋。

近些年，研究者利用ΔpdxB菌株在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)化上百代，得到了在葡萄糖中生長旺盛并可以合成PLP的菌株發(fā)現(xiàn)了第4條偶然途徑。這條途徑由已經(jīng)參與VB6合成的SerA，SerC和ThrB組成，起始于SerA對赤蘚糖（Erythronate）的氧化，除此以外還發(fā)現(xiàn)了這些酶以外的基因突變［21-24］。除了在大腸桿菌中，在枯草芽孢桿菌也發(fā)現(xiàn)了非天然代謝途徑，通過對敲除了pdxST基因并插入pdxH與pdxJ基因的菌株進(jìn)行適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化得到了含有ΔbshC缺陷基因的菌株，再次進(jìn)行適應(yīng)性突變得到了ytoQ（未知具體功能）基因表達(dá)增強(qiáng)，使得突變株的PLP生成速度達(dá)到了與野生型一致的水平［25-26］。

研究表明，偶然代謝途徑的出現(xiàn)并不一定需要該途徑中編碼酶的基因發(fā)生突變，也可能是由于人為突變改變了代謝產(chǎn)物中其他蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的水平，在進(jìn)化過程中由選擇壓力形成的新代謝路徑中起作用的酶開始對原本結(jié)合能力較弱的非天然底物產(chǎn)生作用。偶然途徑的出現(xiàn)提示，在模式菌株中合成維生素B6不僅依賴于天然代謝，還可采用由于酶底物的非特異性而產(chǎn)生的偶然代謝途徑，這些途徑可以在一定程度上減少合成VB6所需的步驟。想要利用偶然合成途徑需要解決宿主的天然途徑對非天然代謝的影響，可以改造偶然途徑的非特異性代謝中間酶，將氨基酸合成途徑與VB6代謝途徑分開，同時(shí)由于絲氨酸的多效性，如果想要提高通路1的流通量，可以增加其他中間產(chǎn)物的量，而不應(yīng)通過在培養(yǎng)基中添加絲氨酸補(bǔ)充物獲得。

3 總結(jié)與展望

鑒于維生素B6對疾病治療、保健品、科研材料、工業(yè)生產(chǎn)的重要性，高效、綠色環(huán)保、簡單快捷地生產(chǎn)VB6對化學(xué)及生物領(lǐng)域仍是不斷發(fā)展的方向。近年來，隨著系統(tǒng)代謝工程的提出，系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)、進(jìn)化工程與傳統(tǒng)的代謝工程結(jié)合在了一起，從而促進(jìn)高性能菌株的發(fā)展，這些領(lǐng)域的出現(xiàn)也為生物合成VB6提供了更多的思路。在后續(xù)對VB6合成的研究中，科研工作者不僅要考慮產(chǎn)物的產(chǎn)率，還要從實(shí)驗(yàn)菌株的穩(wěn)定性入手。

從微觀角度看，研究可以從DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)翻譯水平進(jìn)行，DNA水平可以通過CRISPR-Cas進(jìn)行基因編輯、適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（adaptive laboratory evolution，ALE）等技術(shù)，從而避免質(zhì)粒轉(zhuǎn)化造成的基因丟失、菌株性狀不穩(wěn)定；轉(zhuǎn)錄水平可以從更換啟動子、核糖開關(guān)、不同拷貝水平載體入手，也可以通過CRISPRi，CRISPRa對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制或激活、隨機(jī)突變等方式改變啟動子強(qiáng)度，或者采用動態(tài)方式使用可以響應(yīng)代謝環(huán)境變化的啟動子；翻譯水平可以通過使用穩(wěn)定性不同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)［27-30］。

從宏觀角度看，可以從已經(jīng)明晰的主要代謝途徑入手，提高碳利用效率，增加主要途徑的代謝流量，減少并分離旁支的分流，解除限速步驟，防止中間有毒代謝產(chǎn)物的積累。同時(shí)，也需要考慮還原力（NAD+/NADP+）與能量（ATP）產(chǎn)生與消耗的平衡。有研究者在優(yōu)化生產(chǎn)L-賴氨酸時(shí)就提出碳通量的可用性對產(chǎn)物的生物合成至關(guān)重要，增加前體的供應(yīng)、增強(qiáng)核心代謝途徑、削弱競爭代謝途徑是將碳通量引導(dǎo)到產(chǎn)物合成的有效途徑。除此以外，還需要考慮產(chǎn)物對代謝調(diào)控的抑制，可以通過在宿主體內(nèi)增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來減弱反饋抑制［31］。除了主要代謝途徑，也可以利用較短的偶然代謝途徑，但是需要分開偶然代謝與這些酶參與的其他代謝途徑之間的相互作用。

隨著計(jì)算手段的進(jìn)步，機(jī)器學(xué)習(xí)在代謝設(shè)計(jì)的基因注釋、途徑設(shè)計(jì)與構(gòu)建、代謝流量優(yōu)化等方面均有應(yīng)用，可以利用Rosetta，F(xiàn)oldX，Discovery Studio等軟件對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)與改造。酶的設(shè)計(jì)可以從對酶的底物通道、表面、環(huán)（loop）區(qū)改造入手，改變酶分子中的通道結(jié)構(gòu)影響底物、產(chǎn)物和反應(yīng)中間體在酶分子內(nèi)部的轉(zhuǎn)移。改變酶分子表面的氨基酸可以改變酶與底物、輔酶、反應(yīng)中間體的相互作用，引入新的相互作用并消除局部的不良效應(yīng)。Loop區(qū)遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)氨基酸的改造可以通過構(gòu)象變化影響底物的識別和催化，提高對存在對映體底物的立體選擇性［32-34］。酶的突變可以增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性或與底物結(jié)合能力，使得酶促反應(yīng)的專一性增強(qiáng)，加快其在代謝通路中的反應(yīng)進(jìn)程。

無論是以上哪一種方法都需要不斷嘗試，目前生物學(xué)方法生產(chǎn)維生素B6因產(chǎn)量低而沒有替代化學(xué)法，未來仍需要在前人研究的基礎(chǔ)上完善、更新傳統(tǒng)的方法體系，從而得到可以大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵策略。

參考文獻(xiàn)：

［1］ LIU Linxia，LI Jinlong，GAI Yuanming，et al.Protein engineering and iterative multimodule optimization for vitamin B6 production in Escherichia coli［J］.Nature Communications，2023，14（1）：5304.DOI：10.1038/s41467-023-40928-0.

［2］ DU Yiling，RYAN K.Pyridoxal phosphate-dependent reactions in the biosynthesis of natural products［J］.Natural Product Reports，2019，36（3）：430-457.DOI：10.1039/c8np00049b.

［3］ LIANG Jing，HAN Qian，TAN Yang，et al.Current advances on structure-function relationships of pyridoxal 5′-phosphate-dependent enzymes［J］.Frontiers in Molecular Biosciences，2019，6：4.DOI：10.3389/fmolb.2019.00004.

［4］ DHERBASSY Q，MAYER R，MUCHOWSKA K，et al.Metal-pyridoxal cooperativity in nonenzymatic transamination［J］.Journal of the American Chemical Society，2023，145（24）：13357-13370.DOI：10.1021/jacs.3c03542.

［5］ STACH K，STACH W，AUGOFF K.Vitamin B6 in health and disease［J］.Nutrients，2021，13（9）：3229.DOI：10.3390/nu13093229.

［6］ WILSON M，PLECKO B，MILLS P，et al.Disorders affecting vitamin B6 metabolism［J］.Journal of Inherited Metabolic Disease，2019，42（4）：629-646.DOI：10.1002/jimd.12060.

［7］ KUMRUNGSEE T，ZHANG Peipei，CHARTKUL M，et al.Potential role of vitamin B6 in ameliorating the severity of COVID-19 and its complications［J］.Frontiers in Nutrition，2020，7：562051.DOI：10.3389/fnut.2020.562051.

［8］ ITO T.Role of the conserved pyridoxal 5′-phosphate-binding protein YggS/PLPBP in vitamin B6 and amino acid homeostasis［J］.Bioscience， Biotechnolpgy and Biochemistry，2022，86（9）：1183-1191.DOI：10.1093/bbb/zbac113.

［9］ GUO Hui，TIAN Tao，NAN Kejun，et al.P57： A multifunctional protein in cancer （review）［J］.International Journal of Oncology，2010，36（6）：1321-1329.DOI：10.3892/ijo_00000617.

［10］ WANG Ruina，XIAO Lei，PAN Jianbo，et al.Natural product P57 induces hypothermia through targeting pyridoxal kinase［J］.Nature Communications，2023，14（1）：5984.DOI：10.1038/s41467-023-41435-y.

［11］ ROSENBERG J，ISCHEBECK T，COMMICHAU F.Vitamin B6 metabolism in microbes and approaches for fermentative production［J］.Biotechnology Advances，2017，35（1）：31-40.DOI：10.1016/j.biotechadv.2016.11.004.

［12］ TAZOE M，ICHIKAWA K，HOSHINO T.Flavin adenine dinucleotide-dependent 4-phospho-D-erythronate dehydrogenase is responsible for the 4-phosphohydroxy-L-threonine pathway in vitamin B6 biosynthesis in Sinorhizobium meliloti［J］.Journal of Bacteriology，2006，188（13）：4635-4645.DOI：10.1128/JB.01999-05.

［13］ RICHTS B，ROSENBERG J，COMMICHAU F.A survey of pyridoxal 5′-phosphate-dependent proteins in the gram-positive model bacterium Bacillus subtilis［J］.Frontiers in Molecular Biosciences，2019，6：32.DOI：10.3389/fmolb.2019.00032.

［14］ FITZPATRICK T，AMRHEIN N，KAPPES B，et al.Two independent routes of de novo vitamin B6 biosynthesis： Not that different after all［J］.Biochemical Journal，2007，407（1）：1-13.DOI：10.1042/BJ20070765.

［15］ COMMICHAU F，ALZINGER A，SANDE R，et al.Overexpression of a non-native deoxyxylulose-dependent vitamin B6 pathway in Bacillus subtilis for the production of pyridoxine［J］.Metabolic Engineering，2014，25：38-49.DOI：10.1016/j.ymben.2014.06.007.

［16］ COMMICHAU F，ALZINGER A，SANDE R，et al.Engineering Bacillus subtilis for the conversion of the antimetabolite 4-hydroxy-L-threonine to pyridoxine［J］.Metabolic Engineering，2015，29：196-207.DOI：10.1016/j.ymben.2015.03.007.

［17］ 徐勇智，范衛(wèi)東，黨登峰，等.維生素B6的合成研究進(jìn)展［J］.廣州化工，2012，40（12）：50-51.DOI：10.3969/j.issn.1001-9677.2012.12.019.

［18］ TAZOE M，ICHIKAWA K，HOSHINO T.Biosynthesis of vitamin B6 in Rhizobium： In vitro synthesis of pyridoxine from 1-deoxy-D-xylulose and 4-hydroxy-L-threonine［J］.Bioscience， Biotechnology and Biochemistry，2002，66（4）：934-936.DOI：10.1271/bbb.66.934.

［19］ HOSHINO T，ICHIKAWA K，TAZOE M.Recombinant microorganism for the production of vitamin B6： US2006/0228785 A1［P］.2006-06-15［2024-01-01］.

［20］ ACEVEDO-ROCHA C，GRONENBERG L，MACK M，et al.Microbial cell factories for the sustainable manufacturing of B vitamins［J］.Current Opinion in Biotechnology，2019，56：18-29.DOI：10.1016/j.copbio.2018.07.006.

［21］ KIM J，F(xiàn)LOOD J，KRISTOFICH M，et al.Hidden resources in the Escherichia coli genome restore PLP synthesis and robust growth after deletion of the essential gene pdxB［J］.The Proceedings of the National Academy of Sciences，2019，116（48）：24164-24173.DOI：10.1073/pnas.1915569116.

［22］ KIM J，KERSHNER J，NOVIKOV Y，et al.Three serendipitous pathways in E. coli can bypass a block in pyridoxal-5′-phosphate synthesis［J］.Molecular Systems Biology，2010，6：436.DOI：10.1038/msb.2010.88.

［23］ KIM J，COPLEY S.Inhibitory cross-talk upon introduction of a new metabolic pathway into an existing metabolic network［J］.The Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（42）：E2856-E2864.DOI：10.1073/pnas.1208509109.

［24］ ROSENBERG J，MULLER P，LENTES S，et al.ThrR， a DNA-binding transcription factor involved in controlling threonine biosynthesis in Bacillus subtilis［J］.Molecular Microbiology，2016，101（5）：879-893.DOI：10.1111/mmi.13429.

［25］ ROSENBERG J，YEAK K，COMMICHAU F.A two-step evolutionary process establishes a non-native vitamin B6 pathway in Bacillus subtilis［J］.Environmental Microbiology，2018，20（1）：156-168.DOI：10.1111/1462-2920.13950.

［26］ RICHTS B，COMMICHAU F.Underground metabolism facilitates the evolution of novel pathways for vitamin B6 biosynthesis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2021，105（6）：2297-2305.DOI：10.1007/s00253-021-11199-w.

［27］ CHOI K，JANG W，YANG D，et al.Systems metabolic engineering strategies： Integrating systems and synthetic biology with metabolic engineering［J］.Trends in Biotechnology，2019，37（8）：817-837.DOI：10.1016/j.tibtech.2019.01.003.

［28］ ZHAN Yangyang，XU Yong，ZHENG Pengling，et al.Establishment and application of multiplexed CRISPR interference system in Bacillus licheniformis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104（1）：391-403.DOI：10.1007/s00253-019-10230-5.

［29］ 朱欣娜，戴住波，樊飛宇，等.微生物細(xì)胞工廠［J］.科學(xué)通報(bào)，2023，68（13）：1626-1636.

［30］ 劉洋，牟慶璇，石雅南，等.微生物細(xì)胞工廠的代謝調(diào)控［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2021，37（5）：1541-1563.DOI：10.13345/j.cjb.200688.

［31］ LIU Jie，OU Ying，XU Jianzhong，et al.L-lysine production by systems metabolic engineering of an NADPH auto-regulated Corynebacterium glutamicum［J］.Bioresource Technology，2023，387：129701.DOI：10.1016/j.biortech.2023.129701.

［32］ QU Ge，BI Yuexin，LIU Beibei，et al.Unlocking the stereoselectivity and substrate acceptance of enzymes： Proline-induced loop engineering test［J］.Angewandte Chemie International Edition，2022，61（1）：e202110793.DOI：10.1002/anie.202110793.

［33］ PRAVDA L，BERKA K，VAREKOVA R，et al.Anatomy of enzyme channels［J］.BMC Bioinformatics，2014，15（1）：379.DOI：10.1186/s12859-014-0379-x.

［34］ XIAO Shifeng，PATSALO V，SHAN Bing，et al.Rational modification of protein stability by targeting surface sites leads to complicated results［J］.The Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（28）：11337-11342.DOI：10.1073/pnas.1222245110.